Трансдукция-Трансплантация Mouse Модель миелопролиферативными новообразование

Резюме

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Аннотация

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

Введение

Трансдукция-трансплантация является полезным методом для моделирования гематологических злокачественных новообразований у мышей. Этот метод особенно ценным для изучения миелоидных злокачественных новообразований , начиная с первой демонстрацией того, что эктопическая экспрессия BCR-ABL1 мог точно резюмировать хронический миелолейкоз у мышей ^1. Этот метод впоследствии способствовало обширное исследование JAK2 ^V617F и MPL ^{W515K / л} мутировали миелопролиферативными новообразование (MPN).

MPN представляют собой группу гематологические злокачественных опухолей, характеризующихся гиперпродукцией зрелых миелоидных клеток и фиброз костного мозга. Эти заболевания возникают, как правило из клональной экспансии гемопоэтических стволовых клеток, которая приобрела соматической мутации в любом jak2, MPL или CALR. Трансдукция трансплантации JAK2 ^V617F и MPL ^{W515K / L} модели демонстрируют клинические признаки полицитемии и миелофиброза ^{2 - 5 <}/ SUP>. В последнее время , модель мыши калретикулин-мутированный MPN также генерироваться с методом трансдукции трансплантации ^6. Эти мыши развивают существенную тромбоцитемией заболевание, подобное с увеличением тромбоцитов, увеличение числа мегакариоцитов и фиброза костного мозга. Вместе взятые, эти модели не только при условии, что возможность получить представление о молекулярном патогенезе MPN, но и возможности для разработки и изучения терапии в доклинических условиях.

Эта рукопись содержит подробное описание методологии трансдукции трансплантации с акцентом на мутации CALRdel52. Этот метод включает в себя трансплантацию ретровирусно трансдуцированных клеток костного мозга, экспрессирующих мутантный конструкции в облученных сингенных мышей-реципиентов.

протокол

Это исследование было одобрено и осуществляется в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию комитета Institutional животных в Университете Калифорнии в Ирвине по. Все процедуры проводились под анестезией изофлуран и все усилия были сделаны, чтобы свести к минимуму страдания.

1. Генерация экотропного ретровируса

1. Подготовка высококачественных плазмид с концентрацией по меньшей мере 1 мкг / мкл с использованием либо коммерческий макси-Prep Kit или очистку хлорида цезия.
   Примечание: К ним относятся MSCV магистральную вектор , кодирующий представляющий интерес ген (в данном случае CALR ^7,8) и маркер выбора (GFP, Neo и т.д.), а также экотропным упаковки плазмиду, кодирующую рвотный-POL-ENV (далее здесь, как плазмиды).
2. Разморозить и расширяющие низкого прохода 293T клеток в среде DMEM с добавлением 10% FBS и L-глутамина с пенициллин / стрептомицин (D10). Пластина 5 × 10 ⁶ клеток в 10 см культуре ткани обработанных блюдо в в увлажненнойтканевой культуры инкубатор при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
3. Расширение 293T клеток в культуре. За день до трансфекции, промыть клетки путем добавления 1 мл PBS и аспирировать надосадочную жидкость в вакуумной колбе.
4. Для Trypsinize клетки, добавляют 2 мл 0,05% трипсина и инкубировать блюда в увлажненном инкубаторе культуры ткани в течение 2 - 3 мин при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
5. Чтобы остановить трипсинизации, добавьте 3 мл D10 блюдо и клетки передачи в 15 мл коническую трубку. Спин клетки при 400 мкг в течение 10 мин.
6. Отберите супернатант в клеточный осадок термос и ресуспендируют в 2 мл D10.
7. Граф клеток от трипанового синего использованием гемоцитометра.
8. Семя 2 х 10 ⁶ клеток на чашку в трех 10 см тканевой культуры обработанных блюд на вирус сгенерированных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения оптимальных результатов, не позволяют клеткам превышать 30 - 50% слияния во время трансфекции или плохой выход вируса может быть получен.
9. Непосредственно перед трансфекцией,аспирата СМИ в термос и заменить 5 мл свежей D10.
10. За каждые 10 см чашку Петри, чтобы быть трансфицированы подготовить индивидуальный стерильный 1,5 мл микроцентрифужных трубку.
11. Пипетка 760 мкл восстановленного сыворотки сред в каждую пробирку микроцентрифужных, затем осторожно добавляют 40 мкл реагента для трансфекции непосредственно в средствах массовой информации. Инкубируйте пробирки в культуре ткани капот при комнатной температуре в течение 5 мин.
12. Добавьте 30 мкг MSCV вектора с интересующего гена (15 мкг при использовании пустой вектор), а также 5 мкг плазмиды каждой соответствующей трубки и осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируют при комнатной температуре в капюшоне культуры ткани в течение еще 15 мин.
    Примечание: Меньшие векторы , как правило, имеют более высокие вирусные урожаи.
13. Аккуратно добавить общий объем каждой реакции (примерно 800 мкл) по каплям в соответствующей 10 см чашку Петри и слегка наклоните блюдо из стороны в сторону, чтобы перемешать. Возвращение клеток в куб увлажненной тканиlture инкубатор.
14. После 8 ч или инкубации в течение ночи в инкубаторе тканевых культур, аспирация средств массовой информации в вакуумную колбу и осторожно заменить 10 мл свежей D10.
15. На 48 ч после трансфекции супернатант собирают в 35 мл шприц и фильтруют через мембрану 0,45 мкм для удаления остатков клеток.
16. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Поместите 10 мл свежей D10 назад на клетках 293Т и дополнительного вируса могут быть собраны в 72 ч после трансфекции.
17. Утилизировать клеток 293Т в биологически опасных отходов, когда никаких дополнительных вирус не собирается.
18. Алиготе вирусный супернатант в отдельные объемы использования (например, 1 мл для титра вируса или 6,5 мл для БМ-инфекции). Вирус флэш-замораживание жидким азотом и вируса хранят при температуре -80 ° C.
    Примечание: Избегайте повторных циклов замораживания / оттаивания , поскольку они значительно снижают титр вируса.

2. Определить относительную титр вируса с помощью проточной цитометрии

1. Оттепель 3T3 клеток и поддерживать в D10. Культуры клеток в 10 смтканевых культур обрабатывают блюдо в инкубаторе тканевых культур увлажненным при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
2. Выполните титр вируса в трех экземплярах. Для подготовки клеток, мыть клетки путем добавления 1 мл PBS и аспирировать надосадочную жидкость в вакуумной колбе.
3. Для Trypsinize клетки, добавляют 2 мл 0,05% трипсина и инкубировать блюда в инкубаторе тканевых культур увлажненным при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
4. Чтобы остановить трипсинизации, добавьте 3 мл D10 блюдо и клетки передачи в 15 мл коническую трубку. Спин клетки при 400 мкг в течение 10 мин.
5. Отберите супернатант в клеточный осадок термос и ресуспендируют в 2 мл D10.
6. Граф клеток от трипанового синего использованием гемоцитометра.
7. Семя 3Т3 при плотности 1 × 10 ⁵ клеток в пятнадцать 60 мм тканевой культуры обработанных блюд и инкубировать в течение ночи.
8. Сделайте 1: 3, 1:10, 1:30 и 1: 100 разведения талой вирусного супернатанта с использованием D10 в общей сложности 1 мл. Также включите безвирусного контроль.
9. Аспирируйте менядиам от 3Т3 в вакуумную колбу и заменить 4 мл D10.
10. Наложить 3Т3 с разведениями вирусного супернатанта и добавляют полибрен до конечной концентрации 8 мкг / мл в каждую чашку. Инкубируют в течение 48 часов в культуральной инкубаторе ткани при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
11. Определить относительную титр вирусов с помощью проточной цитометрии:
    1. Для того, чтобы промыть клетки, аспирация СМИ в вакуумную колбу и добавляют 5 мл PBS.
    2. Аспирируйте PBS в вакуумную колбу. Добавить 1 мл 0,05% трипсина и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 2 - 5 мин, чтобы отделить клетки от тарелки.
    3. Добавить 3 мл D10 и пипетку вверх и вниз, чтобы отсоединить все оставшиеся клетки от пластины. Передача клеток в пробирку, FACS и центрифуге при 400 мкг в течение 10 мин.
    4. Слейте супернатант и промыть клетки с 3 мл PBS. Центрифуга при 400 мкг в течение 10 мин и декантации надосадочной жидкости. Ресуспендируют в 200 мкл PBS.
    5. Запуск клетки на проточном цитометре ^9. Собрать между 20 000 - 30 000 мероприятий в рамках тон живой клетки ворота (определяется FSC против SSC) и вычислить процент GFP ⁺ и GFP ^- клетками.
       Примечание: Титр вируса считается приемлемым , когда 1:30 разведение супернатанта вирусными урожайность по меньшей мере , 50% GFP ⁺ 3Т3. Если этого раствора приводит к менее чем 50% GFP ⁺ клеток затем субоптимальные результаты трансдукции могут быть получены. Расчет для определения титра вируса был адаптирован из Лимона и др. , Blood (1997) ^9.
    6. Для определения относительного титра вируса, использовать уравнение: титр вируса = частиц образующих единиц (БОЕ) / мл = [(Количество 3Т3 × Частота GFP ⁺ клеток) / Объем супернатанта (мл)] × коэффициент разбавления.

3. трансдукции Донорские клетки костного мозга

1. Для подготовки мышей-доноров для костного мозга (ВМ), урожай, первые анестезию мышей изофлурановым испарителем со скоростью потока 5% в сочетании дополнительному каналукислорода на 1 л / мин. Pinch ногу для оценки отклика.
   Примечание: Донорские мышей (менее 8 недель) должны быть подготовлены за 5 дней до сбора костного мозга (8 дней до трансплантации). Один мышей-доноров обеспечит достаточное количество клеток, по крайней мере, 2 получателей.
2. Вводят 150 мг / кг 5-фторурацила (5-ФУ) с помощью ретро-орбитальной инъекции в анестезированных мышей с помощью 27 G × ½ "игла.
   ВНИМАНИЕ! 5-ФУ анти-рак химиотерапевтическое средство. Всегда обращайтесь с 5-FU внутри сертифицированного химического вытяжного шкафа или шкафа канальным биологической безопасности. Проконсультируйтесь с комитетом по безопасности лабораторных животных и учреждения, чтобы определить соответствующую маркировку мышей, получавших 5-ФУ.
   1. Поместите наркозом мышь на его стороне и сдерживать как с помощью большого пальца и указательного пальца таким образом, что глаз слегка выступает из головы.
   2. Начиная с иглы латеральнее медиального угла глазной щели и с фаской вверх, вставить иглу в 45° угол в медиальном направлении и останавливается, когда игла вставлена ​​наполовину. Медленно вводят клетки и удалить осторожно удалите иглу.
      Примечание: Если этот метод выполняется правильно, глаз должен убрать немного и никакого сопротивления не должно ощущаться при введении иглы.
   3. Проверьте мышь для любых признаков повреждения, таких как отек или кровотечение.
3. Урожай костного мозга 5 дней после того, как 5-FU обработки (за 3 дня до трансплантации).
   1. Обезболить мышей изофлурановым испарителем со скоростью потока 5% в сочетании дополнительного кислорода на 1 л / мин. Pinch ногу для оценки отклика.
   2. Жертвоприношение мышь путем смещения шейных позвонков. Стерилизовать мышь путем распыления щедро с 70% этанола до мех не намокает.
   3. Использование рассекает ножницы, надрезать кожу и рассекают фасцию от мышц ног. Затем рассекают ногу от мыши, отделяя бедренной кости в тазобедренном суставе и голени на лодыжке.
   4. сгибатьнога в форме "L" и отделить каждую ногу кость путем разрезания в коленном суставе с рассекающих ножницами.
   5. Чтобы удалить хрящ на дистальных концах каждой кости ноги, используйте ножницы, чтобы рассекает аккуратно соскрести мышцы к одному концу кости ноги, пока хрящ не отсоединяется.
   6. С помощью шприца с 27 G х ½ дюйма иглы, на одном уровне каждая нога кости с PBS с добавлением 2% FBS над нейлоновую мембрану 100 мкМ в 50 мл коническую пробирку. Флеш кости до кости становится белым, чтобы максимизировать количество собранных клеток.
   7. Используйте поршень шприца, чтобы месиво клеток через нейлоновую мембрану в коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы получить суспензию единичных клеток. Повторите с другой ногой мыши.
4. Центрифуга клетки при 4 ° С в течение 10 мин при 400 мкг и отбросить супернатант. Ресуспендируют БМ в 5 мл хлористого аммония калия (ACK) буфера для лизиса эритроцитов. Инкубируйте клетки на льду в течение 10 мин.
5. Заполните трубку с PBS, чтобы остановить лизиса клеток. CentriФьюдж клетки при 4 ° С в течение 10 мин при 400 мкг и отбросить супернатант. Повторите шаг для лизиса, если осадок BM имеет красный цвет.
6. Ресуспендируют в 5 мл PBS и подсчета клеток с помощью трипанового синего, используя гемоцитометра.
7. Ресуспендируют клеток в 2 х 10 ⁶ клеток на м с 2x предварительно стим коктейль , который содержит DMEM , дополненной 20% FBS, L-глутамина, пенициллин / стрептомицин, ИЛ-3 (14 нг / мл), IL-6 (24 нг / мл), и SCF (112 нг / мл). Пластина 2 мл на лунку в 6-луночные планшеты.
8. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
9. Добавляют 2 мл вирусного супернатанта в каждую лунку, содержащих клетки BM и добавляют полибрен (8 мкг / мл). Спин пластины при 30 ° С в течение 90 мин при 1500 х г а затем вернуть пластину к культуре ткани инкубаторе на ночь.
10. Суспензию клеток Налить в конические пробирки и центрифугируют при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 400 х г, не отбрасывать пластину. Ресуспендируют клеток в 2 мл свежей 2x предварительно стим коктейль на лунку и вернуться в исходные лунки.
11. Выполните 2 - ^й spinoculation, повторяя шаги 3,7-3,9.

4. Пересадка Донорские клетки в мышей-реципиентов

1. Подготовьте сингенных мышей-реципиентов для трансплантации с летальной дозой облучения всего тела <24 ч до инъекции клеток BM.
   Примечание: Смертельная доза облучения для BALB / с мышей , как правило , 800-900 сГр и 1000-1200 сГр для C57B / 6 ^10. Доза, как правило, делится на две сессии облучения, разнесенных по меньшей мере, 3-4 часов друг от друга.
2. Продолжение со стадии 3.11, урожай трансдуцированных клеток-доноров из 6-луночные планшеты осторожно пипеткой надосадочную жидкость в конические пробирки. Промыть каждую лунку с 1 мл PBS для сбора остаточных клеток и добавляют 50 мл конические пробирки.
3. Добавьте 0,5 мл 0,05% трипсина в лунки и инкубируют при 37 ° С в инкубаторе культуры ткани в течение 5 мин.
4. Добавляют 1 мл D10 в лунки и снять все оставшиеся клетки осторожно пипеткой. Добавить клетки в соответствующей трубеs из шага 4.2 и окатышей центрифугированием при 4 ° С в течение 10 мин при 400 х г.
5. Промыть клетки с PBS и центрифугировать при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 400 х г. Ресуспендируют в 5 мл PBS и сосчитайте клеток с использованием гемоцитометра по трипанового синего.
   Примечание: Если вектор имеет GFP тег затем количественно процент GFP-положительных клеток с проточной цитометрии.
6. Ресуспендируют 5 х 10 ⁵ - 2 х 10 ⁶ клеток в 50 - 100 мкл PBS для инъекции в мышей.
7. Вводят клетки через ретро-орбитальное инъекции в мышей под наркозом с помощью стерильного 27 G х ½ "иглы.
   Примечание: Другие методы включают в себя инъекционные хвостом вены, селезеночной или бедренных.
   1. Обезболить мышь, используя изофлуран и пинч ногу, чтобы оценить отклик.
   2. Поместите мышь на его стороне и сдерживать как с помощью большого пальца и указательного пальца таким образом, что глаз слегка выступает из головы.
   3. С фаска лицевой стороной вверх, вставьте пeedle сбоку от медиального угла глазной щели под углом 45 °.
      Примечание: Если этот метод выполняется правильно, глаз должен убрать немного и никакого сопротивления не должно ощущаться при введении иглы.
   4. Проверьте мышь для любых признаков повреждения, таких как отек или кровотечение.
      Примечание: После трансплантации мышей будут иметь низкие показатели крови в течение нескольких недель и поэтому восприимчивы к инфекции. Профилактика антибиотиками или использование подкисленной воды может быть использован.
8. Через месяц после трансплантации, измеряют% GFP в периферической крови в качестве показателя для приживления донорских клеток с помощью проточной цитометрии.
   Примечание: одна GFP не может определить успешность приживления клеток. Вирусный трансдукция может потерпеть неудачу еще приживления могло произойти. В этом случае нет GFP ⁺ клетки не будут обнаружены, но приживление трансплантированных клеток был успешным.
   1. Возьмите 10 мкл периферической крови бу прокалывания подкожной вены ноги с 21 G х 1 ½ "шприца и добавить его в 100 мМ ЭДТА в PBS для предотвращения коагуляции.
   2. Добавляют 1 мл ACK в крови и лизировать на льду в течение 10 мин. Гранул клетки центрифугированием при 400 х г в течение 10 мин.
   3. Отберите супернатант в вакуумной колбе и добавляют 1 мл PBS с добавлением 2% FBS, чтобы остановить лизиса. Гранул клетки центрифугированием при 400 х г в течение 10 мин.
   4. Отберите супернатант в вакуумной колбе и ресуспендируют осадок в 100 мкл PBS с добавлением 2% FBS.
   5. Выполнить образцов на проточном цитометре и собирают 300000 событий в сотовом ворот живой (определяется FSC против SSC) и вычислить процент GFP ⁺ и GFP ^- клеток ^9.
9. Кроме того , на 1 месяц после трансплантации, проводить полный анализ крови (CBC) с использованием автоматического анализатора ветеринарного ¹⁸ гематологический контролировать прогрессирование заболевания.
   Примечание: Продолжайте следить за болезни на%GFP в периферической крови и CBC ежемесячно.
10. Для завершения эксперимента, обезболить мышь, используя изофлуран и пинч ногу, чтобы оценить отклик. Жертвоприношение мышь путем смещения шейных позвонков и урожая селезенки и костного мозга для гистопатологии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность эксперимента носит субъективный характер и дата окончания должны быть оценены на основе фенотипа заболевания ожидается.

Результаты

Методика трансдукции трансплантации приводит к восстановления гемопоэза мышей-реципиентов с клетками, экспрессирующими интересующего гена. На рисунке 1 показан обзор модели мыши трансдукции-трансплантация калретикулин мутантного MPN. В кратком изложении, р...

Обсуждение

Этот протокол содержит подробное описание того, как осуществлять трансплантацию костного мозга у мышей резюмировать существенную тромбоцитемией, как болезнь с прогрессированием миелофиброза с CALRdel52 мутации как водитель заболевания. Успешная трансплантация клеток, экспрессирующих ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL LINES
DMEM	Corning	MT-10-013-CV
293T cells	ATCC	CRL-11268
3T3 cells	ATCC	CRL-1658
PLASMIDS
EcoPak, also known as pCL-Eco	Addgene	12371	Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.
MSCV-IRES-GFP (MIG)	Addgene	20672	Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.
CONSUMABLES
27G x 1/2" needles	BD	305620
Fetal bovine serum	Corning	MT-35-010-CV
Penicillin/streptomycin/L-glutamine	Corning	MT-30-009-CI
Trypsin-EDTA (0.05%)	Corning	MT-25-052-CI	Can be homemade
PBS	Corning	MT-21-031-CV
10cm dishes	Fisher	172931
15 ml conical tubes	Fisher	12565268
60mm dishes	Fisher	150288
Polybrene	Fisher	NC9840454
5-FU	Fisher	A13456-06
100um cell strainers	Fisher	22363549
50 ml conical tubes	Fisher	12565270
6-well plate	Fisher	130184
FACS tubes	Fisher	14-959-5
0.45um syringe filters	Fisher	0974061B
Opti-MEM	Gibco	31985-070
ACK buffer	Lonza	10-548E	Can be homemade
Recombinant murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant murine SCF	Peprotech	250-03
X-tremeGENE 9	Roche	6365809001	Transfection reagent
1.5 ml centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
EQUIPMENT
BD Accuri C6
X-ray irradiator