התמר-השתלה במודל עכבר של מחלה מיילופרוליפרטיבית

Summary

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

Abstract

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

Introduction

התמר-השתלה היא שיטה שימושית מודל ממאירויות המטולוגיות בעכברים. טכניקה זו כבר יקר במיוחד ללימוד ממאירויות מיאלואידית שראשיתה ההפגנה הראשונה כי ביטוי אקטופי של BCR-ABL1 יכול בנאמנות לשחזר לוקמיה מיאלואידית כרונית בעכברים ^1. טכניקה זו לאחר מכן יש להקל את המחקר המקיף של JAK2 ^V617F ו MPL ^{W515K / L} מוטצית מחלה מיילופרוליפרטיבית (MPN).

MPN הוא קבוצה של ממאירויות המטולוגיות המאופיינת היתר של תאים מיאלואידית בוגרים סיסטיק מח עצם. מחלות אלה נובעים בדרך כלל מהרחבת המשובטים של תא גזע hematopoietic כי רכשה מוטציה סומטיים או Jak2, MPL, או CALR. התמרה-השתלת JAK2 ^V617F ו MPL ^{W515K /} מודלים ^L התערוכה המאפיינים הקליניים של פוליציטמיה ו מיילופיברוזיס ראשונית ^{2 - 5 <}/ Sup>. לאחרונה, במודל של עכברים של MPN calreticulin-מוטציה גם נוצר עם שיטת התמרה-השתלת ^6. עכברים אלו לפתח מחלת thrombocythemia דמוי חיוני עם טסיות מוגבר, מספר גדל של megakaryocytes, סיסטיק מח עצם. יחד, המודלים האלה לא רק ספקו את ההזדמנות כדי לקבל תובנה בפתוגנזה המולקולרית של MPN, אלא גם את היכולת לפתח וללמוד רפויים באווירה טרום קלינית.

כתב יד זה מספק תיאור מפורט של המתודולוגיה התמר השתלה עם דגש על מוטצית CALRdel52. טכניקה זו כרוכה השתלה של תאים במח עצם transduced retrovirally להביע המוטציה לבנות לעכברי נמען syngeneic מוקרנים.

Protocol

מחקר זה אושר ובוצע בהתאם להמלצות של ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת קליפורניה, אירווין. כל הנהלים בוצעו בהרדמה isoflurane וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל.

1. דור של רטרו-וירוס Ecotropic

1. כן פלסמידים באיכות גבוהה עם ריכוז של לפחות 1 מיקרוגרם / μl או באמצעות טיהור כלוריד מסחרית maxi-prep ערכה או צזיום.
   הערה: אלה כוללים וקטור השדרה MSCV קידוד הגן של עניין (במקרה זה CALR ^7,8) ו סמן הבחירה (GFP, ניאו, וכו ') וכן פלסמיד אריזה ecotropic, קידוד איסור פרסום-Pol-env (המכונה כאן כמו פלסמיד).
2. הפשרה ולהרחיב תאי 293T נמוך מעבר DMEM בתוספת 10% FBS ו L- גלוטמין עם פניצילין / סטרפטומיצין (D10). פלייט 5 x 10 ⁶ תאים בצלחת תרבות שטופלו רקמות 10 ס"מ בתוך humidifiedבתרבית רקמה החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
3. להרחיב תאי 293T בתרבות. ביום שלפני transfection, לשטוף תאים על ידי הוספת 1 מ"ל PBS ו supernatant לשאוב לתוך בקבוק ריק.
4. כדי trypsinize תאים, להוסיף 2 מ"ל 0.05% טריפסין דגירה מנות חממה בתרבית רקמה humidified עבור 2 - 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
5. כדי להפסיק trypsinization, להוסיף 3 מ"ל D10 צלחת ותאי והעברת צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין תאים ב 400 XG במשך 10 דקות.
6. לשאוב supernatant לתוך תא גלול בקבוק resuspend ואקום D10 2 מיליליטר.
7. ספירת התאים על ידי הרחקה הכחולה trypan באמצעות hemocytometer.
8. Seed 2 x 10 ⁶ תאים לכל צלחת לתוך מנות רקמות שלוש 10 ס"מ שטופלו תרבות לכל וירוס שנוצר.
   הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות, אינו מאפשר לתאים יעלו על 30 - 50% מפגש בשעת transfection או תשואת וירוס עניים ניתן לקבל.
9. מיד לפני transfection,תקשורת לשאוב לתוך בקבוק ריק ולהחליף עם 5 מיליליטר D10 טרי.
10. על כל צלחת 10 ס"מ פטרי להיות transfected להכין צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge סטרילית הפרט.
11. פיפטה 760 μl של התקשורת סרום מופחת לתוך כל צינור microcentrifuge, ואז מוסיפים בזהירות 40 μl של מגיב transfection ישירות לתוך התקשורת. דגירה צינורות ב למכסה המנוע בתרבית רקמה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
12. הוסף 30 מיקרוגרם של וקטור MSCV עם הגן של עניין (15 מיקרוגרם אם באמצעות וקטור ריק) וכן 5 מיקרוגרם של פלסמיד על צינור אחד בהתאמה ומערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה בטמפרטורת חדר בשכונה בתרבית רקמה עבור 15 דקות נוספות.
    הערה: וקטורים קטנים נוטים להיות בעלי תשואות ויראלי גבוהות.
13. בזהירות להוסיף את הנפח הכולל של כל תגובה (כ 800 μl) נפתח חכם לתוך צלחת שלה בהתאמה 10 ס"מ פטרי בעדינות להטות את צלחת מצד לצד כדי לערבב. חזרו תאי מ"ק הרקמה humidifiedחממת lture.
14. בעקבות 8 שעות או דגירת לילה חממה בתרבית רקמה, תקשורת לשאוב לתוך בקבוק ריק ולהחליף בעדינות עם 10 מיליליטר של D10 הטרי.
15. בשעה 48 שעות שלאחר transfection לאסוף supernatant לתוך מזרק 35 מ"ל ולסנן דרך קרום 0.45 מיקרומטר להסיר פסולת התא.
16. אופציונלי: בחזרה D10 10 מ"ל מקום טרי על תאים 293T ווירוסים נוספים ניתן לקצור ב 72 hr-transfection פוסט.
17. השלך תאי 293T ב פסול Biohazard כשאף וירוס נוסף נאסף.
18. supernatant ויראלי Aliquot לתוך כרכים לשימוש חד (למשל 1 מ"ל עבור כייל הנגיף או 6.5 מ"ל לזיהום בע"מ). וירוס פלאש להקפיא בחנקן נוזל וירוס בחנות ב -80 ° C.
    הערה: הימנע חזר להקפיא / מחזורי ההפשרה כפי שהם לצמצם במידה ניכרת כייל הנגיף.

2. קביעת כייל הנגיף יחסית על ידי cytometry זרימה

1. הפשרת 3T3 תאים ולתחזק ב D10. תאי התרבות ב 10 סנטימטריםרקמות-תרבות שטופלו צלחת בתוך חממה בתרבית רקמה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. בצע כייל הנגיף בשלושה עותקים. כדי להכין תאים, לשטוף תאים על ידי הוספת 1 מ"ל PBS ו supernatant לשאוב לתוך בקבוק ריק.
3. כדי trypsinize תאים, להוסיף 2 מ"ל 0.05% טריפסין דגירה מנות חממה בתרבית רקמה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
4. כדי להפסיק trypsinization, להוסיף 3 מ"ל D10 צלחת ותאי והעברת צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין תאים ב 400 XG במשך 10 דקות.
5. לשאוב supernatant לתוך תא גלול בקבוק resuspend ואקום D10 2 מיליליטר.
6. ספירת התאים על ידי הרחקה הכחולה trypan באמצעות hemocytometer.
7. זרע 3T3 תאים בצפיפות של 1 x 10 ⁵ תאים לתוך חמש עשר 60 מ"מ רקמת תרבות מנות שטופלה דגירת הלילה.
8. הפוך 1: 3, 1:10, 1:30, ו 1: 100 דילולים של supernatant ויראלי מופשר באמצעות D10 בסך של 1 מ"ל. כמו כן כולל שליטה מוירוסים.
9. לשאוב אותיdia מ 3T3 תאים לתוך תרמוס ולהחליף עם 4 מ"ל של D10.
10. מכסים את 3T3 תאים עם דילולים של supernatant ויראלי ולהוסיף polybrene לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל ​​כל מנה. דגירה במשך 48 שעות ב בתרבית רקמה חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
11. לקבוע כייל הנגיף ביחס ידי cytometry זרימה:
    1. כדי לשטוף תאים, לשאוב את התקשורת לתוך בקבוק ואקום ולהוסיף 5 מ"ל PBS.
    2. לשאוב PBS לתוך בקבוק ריק. הוסף 1 מ"ל 0.05% טריפסין ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 5 דקות כדי לנתק את התאים מן המנה.
    3. הוסף 3 D10 מ"ל ו פיפטה מעלה ומטה כדי לנתק את כל התאים הנותרים מהצלחת. מעבירים את התאים צינור צנטריפוגות FACS ב 400 XG במשך 10 דקות.
    4. למזוג supernatant ולשטוף תאים עם 3 מ"ל PBS. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות ו supernatant למזוג. Resuspend ב 200 μl PBS.
    5. תאים לרוץ על cytometer זרימה ^9. אסוף בין 20,000 - 30,000 אירועים בתוך tהוא גר שער תא (נקבע על ידי FSC לעומת SSC) ולחשב את אחוז GFP ⁺ ו- GFP ^- התאים.
       הערה: כייל הנגיף נחשב מקובל כאשר 1:30 דילול של תשואות supernatant ויראלי לפחות 50% GFP ⁺ 3T3 תאים. אם תוצאות דילול זה בפחות מ -50% GFP ⁺ תאים אז תוצאות התמרה הכי מוצלחות ניתן להשיג. החישוב לקביעת כייל הנגיף הותאם מתוך ואח לימון. דם, (1997) ^9.
    6. כדי לקבוע כייל הנגיף יחסית, השתמש המשוואה: כייל הנגיף = יחידות להרכיב החלקיקים (PFU) / מ"ל = [(מספר 3T3 תאים × תדירות GFP ⁺ תאים) / נפח של Supernatant (מ"ל)] × דילול פקטור.

3. תורם transduce תאים במח העצם

1. כדי להכין עכברים תורמים עבור מח עצם (בע"מ) קציר, להרדים עכברים לראשונה על ידי אידוי isoflurane עם קצב זרימה של משלים 5% בשילובחמצן 1 ליטר / דקה. לצבוט רגל להעריך תגובה.
   הערה: תורם עכברים (פחות מ -8 שבועות) צריכים להיות מוכנים 5 ימים לפני קציר מח עצם (8 ימים לפני השתלה). עכברים תורמים אחד יספקו מספיק תאים עבור 2 מקבלים לפחות.
2. להזריק 150 מ"ג / ק"ג 5-fluorouracil (5-FU) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית בעכברים מורדמים באמצעות מחט 27 G × ½ ".
   זְהִירוּת! 5-FU סוכן כימותרפיות נגד סרטן. תמיד טפלו 5-FU בתוך במנדף כימי מוסמך או ארון בטיחות ביולוגית ducted. התייעץ עם ועדת הבטיחות במעבדה ובבעלי חיים של המוסד לקבוע תיוג מתאים של עכברים שטופלו 5-FU.
   1. מקם את העכבר הרדים על צידו לרסן באמצעות הן האגודל והאצבע המורה כך העין הבולטת מעט מהראש.
   2. החל לרוחב המחט canthus המדיאלי עם שיפוע כלפי מעלה, הכנס את המחט בזווית של 45° זווית בכיוון המדיאלי ולהפסיק כאשר המחט מוחדרת באמצע הדרך. לאט לאט להזריק תאים ולהסיר להסיר מחט בזהירות.
      הערה: אם טכניקה זו מבוצעת כראוי, העין צריכה להתקפל מעט ואין התנגדות צריכה להיות מורגשת על החדרת מחט.
   3. בדוק עכבר עבור כל סימנים של פגיעה כגון נפיחות או דימום.
3. קציר מוח העצם 5 ימים לאחר הטיפול 5-FU (3 ימים לפני ההשתלה).
   1. להרדים עכברים על ידי אידוי isoflurane עם קצב זרימה של חמצן בשילוב 5% ב 1 ליטר / דקה. לצבוט רגל להעריך תגובה.
   2. להקריב העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. לעקר עכבר על ידי ריסוס בנדיבות עם 70% EtOH עד הפרווה הופכת רטובה.
   3. באמצעות מספריים לנתח, לעשות חתך בעור לנתח את fascia מן שרירי הרגליים. בשלב הבא, לנתח את הרגל מן העכבר על ידי ניתוק הירך בירך ואת השוקה בקרסול.
   4. לְכּוֹפֵףהרגל לתוך צורה "L" ולהפריד בין עצם רגל על ​​ידי חיתוך במפרק הברך עם מספריים לנתח.
   5. כדי להסיר סחוס בקצות הדיסטלי של כל עצם הרגל, להשתמש במספריים לנתח לגרד שריר בעדינות לכיוון קצה אחד של עצם הרגל עד סחוס מתנתק.
   6. באמצעות מזרק עם מחט 27 G x ½ אינץ ', סומק כל עצם הרגל עם PBS בתוספת 2 FBS% מעל קרום ניילון 100 מיקרומטר צינור חרוטי 50 מ"ל. עצם פלאש עד העצם הופך לבן על מנת למקסם את מספר התאים שנקטפו.
   7. השתמש הבוכנה של מזרק לכתוש התאים דרך קרום ניילון לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לקבל השעיה תא בודד. חזור עם רגל עכבר אחרת.
4. תאי צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 400 XG וזורקים supernatant. Resuspend בע"מ ב 5 מ"ל אשלגן כלוריד אמוניום (ACK) חיץ כדי lyse כדוריות דם אדומות. דגירת תאים על קרח למשך 10 דקות.
5. מלאו צינור עם PBS להפסיק תמוגה התא. Centriתאי fuge ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 400 XG וזורקים supernatant. חזור על שלב תמוגה אם גלולת BM יש צבע אדום.
6. Resuspend ב 5 מ"ל PBS ו לספור תאים על ידי הרחקה כחול trypan באמצעות hemocytometer.
7. תאים Resuspend ב 2 x 10 ⁶ תאים לכל מטר עם קוקטייל מראש Stim 2x המכיל DMEM בתוספת FBS 20%, L- גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין, IL-3 (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / מ"ל), ו SCF (112 ng / ml). פלייט 2 מ"ל לכל היטב 6 צלחות היטב.
8. דגירת תאי הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
9. הוסף 2 מ"ל של supernatant ויראלי לכל התאים BM המכיל היטב ומוסיפים polybrene (8 מיקרוגרם / מ"ל). ספין צלחות על 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות ב 1500 XG ואז לחזור הצלחת אל האינקובטור בתרבית רקמה לילה.
10. השעית תא פיפטה לתוך צינורות צנטריפוגות חרוטים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 400 XG, לא כדאי לזרוק את הצלחת. תאי Resuspend ב 2 מיליליטר טרי קוקטייל מראש Stim 2x לכל טוב ולחזור הבארות המקוריות.
11. בצע spinoculation 2 ^nd על ידי חזרה על שלבים 3.7-3.9.

4. תאי תורם השתלה לעכברי נמען

1. כן עכברי נמען syngeneic להשתלה עם הקרנת גוף הכולל מנה קטלנית <24 שעות לפני הזריקה של תאי בע"מ.
   הערה: הקרנה במינון קטלנית עבור עכברי BALB / c היא בדרך כלל 800-900 cGy ו 1,000-1,200 cGy עבור C57B / 6 ^10. המינון מפוצל בדרך כלל לשתי פגישות של הקרנה במרווחים לפחות מזה 3-4 שעות.
2. המשך משלב 3.11, תאי תורם transduced אסיף 6 הצלחות היטב על ידי pipetting supernatant בעדינות לתוך צינורות חרוטים. לשטוף היטב עם כל 1 מ"ל של PBS לאיסוף תאים שיורית ולהוסיף צינורות חרוטי 50 מ"ל.
3. הוסף 0.5 מ"ל של טריפסין 0.05% לבארות לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה בתרבית רקמה למשך 5 דקות.
4. הוסף 1 מ"ל D10 לבארות לנתק את כל התאים הנותרים על ידי pipetting עדין. הוספת תאים אל הצינור בהתאמהים משלב 4.2 ו גלולה ידי צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 400 x ז.
5. שטפו תאים עם PBS ו צנטריפוגות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב g x 400. Resuspend ב 5 מ"ל PBS ו לספור תאים באמצעות hemocytometer על ידי הרחקה כחול trypan.
   הערה: אם הווקטור יש תג GFP אז לכמת אחוז תאי ה- GFP החיובי עם cytometer זרימה.
6. Resuspend 5 x 10 ⁵ - 2 x 10 ⁶ תאים 50 - 100 μl PBS להזרקה לעכברים.
7. להזריק תאים באמצעות הזרקת רטרו מסלולית לעכברים מורדם באמצעות מחט סטרילית 27 G x ½ ".
   הערה: טכניקות הזרקה אחרות כוללות זנב-וריד, טחול, או ירך.
   1. להרדים עכבר באמצעות רגל isoflurane ולצבוט להעריך תגובה.
   2. מקם את העכבר על צידו לרסן באמצעות הן האגודל והאצבע המורה כך העין הבולטת מעט מהראש.
   3. עם פונה כלפי מעלה את זווית ההטיה, הכנס את needle לטרלית למרכז canthus המדיאלי בזווית של 45 מעלות.
      הערה: אם טכניקה זו מבוצעת כראוי, העין צריכה להתקפל מעט ואין התנגדות צריכה להיות מורגשת על החדרת מחט.
   4. בדוק עכבר עבור כל סימנים של פגיעה כגון נפיחות או דימום.
      הערה: עכברים השתלה בעקבות יהיו ספירת דם נמוכה במשך מספר שבועות ולכן חשופים לסכנת הדבקה. טיפול מונע באנטיביוטיקה או שימוש במים acidified ניתן להשתמש.
8. חודש לאחר השתלה, למדוד את GFP% בדם ההיקפי כאינדיקטור תאי תורם engrafted ידי cytometry זרימה.
   הערה: GFP לבד לא יכול לקבוע את מידת ההצלחה של engraftment של התאים. תמרת ויראלי אולי נכשלה עדיין engraftment ייתכן שאירע. במקרה זה, לא תאי GFP ⁺ יהיו מזוהים, אבל engraftment של התאים המושתלים היה מוצלח.
   1. קח 10 μl של b דם ההיקפיתy ניקוב וריד ברגל saphenous עם 21 G x ½ 1 "מזרק ולהוסיף אותו ל -100 מ"מ EDTA ב PBS כדי למנוע קרישה.
   2. הוסף 1 מ"ל ACK לדם lyse על קרח למשך 10 דקות. תאים גלולים ידי צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות.
   3. לשאוב supernatant בבקבוק ואקום ולהוסיף 1 מ"ל PBS בתוספת 2% FBS להפסיק תמוגה. תאים גלולים ידי צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות.
   4. לשאוב supernatant בבקבוק ואקום resuspend גלולה ב 100 μl PBS בתוספת 2% FBS.
   5. הפעל דגימות על cytometer זרימה ולאסוף 300,000 אירועים בתוך שער התא החי (נקבע על ידי FSC לעומת SSC) ולחשב את אחוז GFP ⁺ ו- GFP ^- התאים ^9.
9. בנוסף ב 1 לחודש השתלה פוסט, לבצע ספירת דם מלאה (CBC) באמצעות מנתח המטולוגיה וטרינרים אוטומטי ¹⁸ לעקוב אחר התקדמות מחלה.
   הערה: המשך לעקוב אחר המחלה על ידי%GFP בדם היקפי ו CBC חודשי.
10. כדי לסיים את הניסוי, להרדים עכבר באמצעות רגל isoflurane ולצבוט להעריך תגובה. להקריב עכבר על ידי נקע בצוואר רחם וטחול קציר מח עצם עבור histopathology.
    הערה: אורכו של הניסוי הוא סובייקטיבית לבין מועד הסיום צריך יוערך בהתבסס על פנוטיפ המחלה הצפוי.

תוצאות

הטכניקה התמר-השתלת תוצאת הכינון מחדש hematopoietic של עכברי הנמען עם תאים המבטאים את הגן של עניין. איור 1 מציג סקירה של מודל העכבר התמר-השתלת calreticulin מוטצית MPN. בקצרה, רטרו-וירוס להביע CALRwt או CALRdel52 משמש להדביק תאים BM מתוך עכבר התורם C57B / 6. תאי transduced מו?...

Discussion

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של איך לבצע השתלות מח עצם בעכברים לשחזר מחל thrombocythemia דמוי חיונית עם התקדמות מיילופיברוזיס ראשונית עם מוטצית CALRdel52 כנהג מחלה. השתלה מוצלחת של תאי המבטאים תוצאות CALRdel52 במספר טסיות דם מוגברים, הרחבת megakaryocytes, סיסטיק מח עצם. השתלת מח עצם היא תהל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CELL LINES
DMEM	Corning	MT-10-013-CV
293T cells	ATCC	CRL-11268
3T3 cells	ATCC	CRL-1658
PLASMIDS
EcoPak, also known as pCL-Eco	Addgene	12371	Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others.
MSCV-IRES-GFP (MIG)	Addgene	20672	Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others.
CONSUMABLES
27G x 1/2" needles	BD	305620
Fetal bovine serum	Corning	MT-35-010-CV
Penicillin/streptomycin/L-glutamine	Corning	MT-30-009-CI
Trypsin-EDTA (0.05%)	Corning	MT-25-052-CI	Can be homemade
PBS	Corning	MT-21-031-CV
10cm dishes	Fisher	172931
15 ml conical tubes	Fisher	12565268
60mm dishes	Fisher	150288
Polybrene	Fisher	NC9840454
5-FU	Fisher	A13456-06
100um cell strainers	Fisher	22363549
50 ml conical tubes	Fisher	12565270
6-well plate	Fisher	130184
FACS tubes	Fisher	14-959-5
0.45um syringe filters	Fisher	0974061B
Opti-MEM	Gibco	31985-070
ACK buffer	Lonza	10-548E	Can be homemade
Recombinant murine IL-3	Peprotech	213-13
Recombinant murine IL-6	Peprotech	216-16
Recombinant murine SCF	Peprotech	250-03
X-tremeGENE 9	Roche	6365809001	Transfection reagent
1.5 ml centrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
EQUIPMENT
BD Accuri C6
X-ray irradiator