Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

Resumen

Una nanopartícula de cristal líquido (LCNP) nanotransportador es explotado como un vehículo para la administración controlada de una carga hidrofóbica en la membrana plasmática de las células vivas.

Resumen

La entrega controlada de agentes de fármaco / de formación de imágenes a las células es crítico para el desarrollo de agentes terapéuticos y para el estudio de los procesos de señalización celular. Recientemente, nanopartículas (NP) han mostrado una promesa significativa en el desarrollo de tales sistemas de administración. Aquí, un NP (LCNP) sistema de entrega basado en cristal líquido se ha empleado para el suministro controlado de un colorante insoluble en agua, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO), desde dentro del núcleo NP de la región hidrófoba de un plasma bicapa de la membrana. Durante la síntesis de los PN, el colorante se incorporó de manera eficiente en el núcleo hidrófobo LCNP, según lo confirmado por análisis espectroscópico múltiple. La conjugación de un derivado de colesterol PEGilado a la superficie de NP (DIO-LCNP-PEG-Chol) activar la unión de los NPs colorante cargado a la membrana plasmática en células HEK 293T / 17 células. Resuelta en el tiempo de escaneo láser confocal de microscopía y la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) de imágenes confirmó el paseive flujo de salida de DiO desde el núcleo LCNP y su inserción en la bicapa de la membrana de plasma. Por último, la entrega de DiO como LCNP-PEG-Chol atenúa la citotoxicidad de DiO; la forma de Dio NP exhibió ~ 30-40% menor toxicidad en comparación con DiO _libre liberado de solución a granel. Este enfoque demuestra la utilidad de la plataforma LCNP como una modalidad eficaz para la entrega de membrana específico de modulación y de cargas moleculares hidrófobas.

Introducción

Desde el advenimiento de la interfaz nanomateriales (materiales ≤100 nm en al menos una dimensión) con células vivas, un objetivo continuo ha sido tomar ventaja de las propiedades únicas dependientes del tamaño de las nanopartículas (NP) para diversas aplicaciones. Estas aplicaciones incluyen células y tejidos etiquetado / formación de imágenes (tanto in vitro como in vivo), la detección en tiempo real, y la administración controlada de fármacos y otros cargos ^1. Ejemplos de tales propiedades relevantes NP incluyen la emisión dependiente del tamaño de los nanocristales semiconductores (puntos cuánticos, los puntos cuánticos); fototermales las propiedades de las nanopartículas de oro; la gran capacidad de carga del núcleo acuoso de liposomas; y la conductividad balístico de alótropos de carbono, tales como nanotubos de carbono de pared simple y grafeno.

Más recientemente, ha surgido un interés significativo en el uso de los PN para la modulación controlada de fármacos y otras cargas, como contraste / imagen de unacaballeros. Aquí, la razón es para mejorar significativamente / optimizar la solubilidad en general, la dosis administrada, el tiempo de circulación, y el aclaramiento eventual de la carga de drogas mediante la entrega como una formulación NP. Esto ha llegado a ser conocido como la administración de fármacos mediada NP (NMDD), y actualmente hay siete formulaciones de fármacos NP aprobados por la FDA para su uso en la clínica para el tratamiento de varios tipos de cáncer y cientos más en distintas fases de ensayos clínicos. En esencia, el objetivo es "lograr más con menos"; es decir, utilizar el NP como un andamio para entregar más fármaco con un menor número de administraciones de dosificación mediante el aprovechamiento de la gran área superficial: volumen (por ejemplo, partículas duras, tales como puntos cuánticos y óxidos metálicos) de PN o de su gran volumen interior para la carga grandes cargas útiles de carga (por ejemplo, liposomas o micelas). El objetivo aquí es reducir la necesidad de múltiples regímenes de dosificación sistémicamente entregadas mientras que al mismo tiempo la promoción de la estabilidad acuosa y una mayor circulación, en particular paradesafiantes cargamentos de drogas hidrofóbicas que, aunque muy eficaz, son poco solubles en medios acuosos.

Por lo tanto, el objetivo del trabajo descrito en la presente memoria fue determinar la viabilidad del uso de una novela NP andamio para la entrega específica y controlada de cargas hidrófobas a la bicapa de la membrana de plasma lipófilo. La motivación para el trabajo era la solubilidad limitada inherente y la dificultad en la entrega de moléculas hidrófobas a las células a partir de medios acuosos. Típicamente, la entrega de dichas moléculas hidrófobas requiere el uso de disolventes orgánicos (por ejemplo, DMSO) o tensioactivos anfifílicos (por ejemplo, poloxámeros), que pueden ser tóxicos y compromiso de células y tejidos viabilidad ^2, o portadores de micelas, que puede tener la carga interna limitada capacidades. El soporte elegido NP NP aquí fue una formulación (LCNP) novela de cristal líquido desarrollado previamente ³ y que se había demostrado previamente para lograr un ~ 40 veces mejora en la eficacia de la doxorubicina medicamento contra el cáncer en células cultivadas ^4.

En el trabajo descrito en este documento, la carga representante seleccionado fue el colorante de membrana potenciométrica, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO). DiO es un colorante insoluble en agua que se ha utilizado para anterógrada y rastreo retrógrado en neuronas fijos de estar y, las mediciones de potencial de membrana, y para el etiquetado general de membrana ^{5, 6, 7, 8, 9.} Debido a su naturaleza hidrófoba, DiO típicamente se añade directamente a las monocapas de células o tejidos en una forma cristalina ^10, o se incubó a concentraciones muy altas (~ 1-20 mM) después de la dilución de una solución de concentración madre ^{11, 12.}

contenido "> Aquí, el enfoque fue el uso de la plataforma LCNP, un NP multifuncional cuyo núcleo interno es completamente hidrófoba y cuya superficie es a la vez hidrófila y susceptibles de bioconjugación, como vehículo de administración para DiO. DiO se incorpora en el núcleo LCNP durante la síntesis , y la superficie de NP es entonces funcionalizado con una fracción de colesterol PEGilado para promover la unión del conjunto dio-LCNP a la membrana plasmática de la membrana. Este enfoque dio como resultado un sistema de entrega que se repartió la diO en la membrana de plasma con mayor fidelidad y residencia membrana el tiempo y la forma libre de DiO entrega de la solución a granel (DiO _libre). Además, este método mostró que la entrega LCNP mediada de DiO modula sustancialmente y acciona la tasa de partición específica del colorante en la bicapa de la membrana plasmática lipófilo. esto es alcanzado mientras que de forma concomitante reducción de la citotoxicidad del fármaco libre por ~ 40% mediante la entrega como una formulación LCNP.

Se anticipa que la metodología descrita en este documento será una poderosa técnica que permite a los investigadores cuyo trabajo implique o requiera la entrega celular de cargas altamente hidrofóbicos que son poco solubles o completamente insoluble en solución acuosa.

Protocolo

1. Preparación de Dio-LCNP y dio-LCNP-PEG-Chol

1. Disolver diacrilato cristalino líquido agente de reticulación (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DiO, 2 mg), y un iniciador de radical libre (azobisisobutironitrilo, 1 mg) para la polimerización en 2 ml de cloroformo. Añadir esto a una solución acuosa de tensioactivo funcionalizado con acrilato (AC10COONa, 13 mg en 7 ml).
2. Se agita la mezcla durante 1 hr y se somete a ultrasonidos a 80% de amplitud durante 5 minutos para producir una miniemulsión que consiste de pequeñas gotitas de la materia orgánica rodeado de tensioactivo polimerizable en agua.
3. Se calienta la mezcla a 64 ° C en un baño de aceite para iniciar la polimerización de tanto el agente y el agente tensioactivo de reticulación como el cloroformo se evapora lentamente, dejando una suspensión NP DiO que contiene que se estabiliza por el tensioactivo.
4. Filtrar la suspensión NP (3 veces) a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras para eliminar cualquier agregación. store la solución NP filtrada a 4 ° C hasta su uso posterior.
5. La conjugación de PEG-Chol que dio-LCNP a través de acoplamiento EDC.
   1. Disolver Chol-PEG-NH ₂ · HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) en tampón HEPES 25 mM (pH 7,0).
   2. Preparar una solución de trabajo que contiene sal de N-hidroxi-sulfosuccinimida de sodio (NHSS, 40 mM) y 1-etil-3- (3- (dimetilamino) propil) carbodiimida (EDC, 400 mM) en tampón HEPES a partir de soluciones madre concentradas.
   3. Inmediatamente se añaden 20 l de la solución de trabajo recién preparada de NHSS / EDC a 1,0 ml de DiO-LCNP en tampón HEPES y se agita durante 5 min.
   4. Añadir 20 l de solución madre de Chol-PEG-NH ₂ · HCl a esta mezcla y se agita durante 2 hr.
   5. Centrifugar brevemente la mezcla de reacción a la velocidad máxima (~ 2.000 xg) durante 30 segundos usando una mini centrífuga de mesa y pasar el sobrenadante a través de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño PD-10 equilibrada con ¹³de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, 0,1x).

2. Caracterización de Dio-LCNP y dio-LCNP-PEG-Chol

1. Para confirmar el éxito de la conjugación covalente de PEG-Chol a la superficie dio-LCNP por electroforesis en gel.
   1. Disolver 0,5 g de agarosa en 50 ml (1x) de electroforesis tris-borato (TBE; mM Tris 89 (pH 7,6), 89 mM de ácido bórico y 2 mM EDTA) buffer. Calentar la solución en un horno de microondas para disolver la agarosa. Deje que la solución se enfríe un poco y verter el contenido en una placa de gel de electroforesis en el cuadro. Insertar un peine de gel para crear pocillos de muestra.
   2. Una vez que el gel se ha solidificado, añadir la cantidad requerida (suficiente para sumergir el gel en la cámara) de tampón de TBE a la cámara.
   3. Añadir 35 l de muestra dio-LCNP (modificada con glicerol, 5% v / v) a los pocillos del gel y una duración de 20 min a una tensión de 110 V.
   4. La imagen del gel usando un sistema de imágenes de gel wifiltros de excitación y emisión th a 488 nm y 500 a 550 nm, respectivamente.
2. Evaluar el tamaño de partícula y la distribución por dispersión de luz dinámica (DLS) por dilución de la solución dio-LCNP (dilución ~ 200 veces) en PBS (pH ~ 8, 0,1x) y la medición en un instrumento DLS ^14. Medir el potencial zeta de la DIO-LCNPs utilizando un instrumento de medición del potencial zeta apropiado.

3. Preparación del cultivo celular platos para experimentos de envío e Imaging

NOTA: etiquetado dio-LCNP se realiza en HEK 293T / 17 células de riñón embrionario humano (entre pasajes 5 y 15) que se cultivan como se describió anteriormente ^4. Realizar los experimentos de entrega y la imagen de células subsiguientes como se describe a continuación.

1. Preparar placas de cultivo de tejido de diámetro 35 mm (14 mm equipados con insertos No. 1 cubreobjetos) recubriéndolos con fibronectina bovina (~ 100 l a una concentración de 20 mg/ Ml) en DPBS durante 2 horas a 37 ° C.
2. Eliminar la solución de revestimiento de la fibronectina de la placa de cultivo. Cosecha HEK 293 T1 / 7 células del matraz T-25 por primera lavado de la monocapa celular con 3 ml de DPBS y luego mediante la adición de 2 ml de tripsina-EDTA (0,5% de tripsina-0,25% de EDTA).
3. Incubar el matraz a 37 ° C durante ~ 3 min. Retire la tripsina-EDTA y devolver el frasco a la incubadora. Una vez que las células se separaron del matraz, neutralizar la tripsina mediante la adición de 4 ml de medio completo (medio Eagle modificado de Dulbecco; DMEM; modificado para contener 10% de suero fetal bovino, piruvato de sodio 5%, y 5% de antibiótico / antimicótico) al matraz . Determinar la concentración de células en la suspensión mediante el recuento en un contador de células.
4. Ajustar la concentración de células a ~ 8 x 10 ⁴ células / ml con medio de crecimiento. Añadir 3 ml de la suspensión celular a la antena y la cultura en la incubadora durante la noche; Al día siguiente, las células deben estar en ~ 70% de confluencia y deben estar listos para su uso. Adecuadodensidad celular es crítica para robusto y eficiente etiquetado de un alto porcentaje de células.

4. Entrega celular de Dio y Dio-LCNPs e Imagen de células fijadas

1. Preparar 1 ml de soluciones de Dio, Dio-LCNP, y dio-LCNP-PEG-Chol en medio de distribución (HEPES-DMEM; DMEM que contenía HEPES 25 mM) mediante la dilución de las soluciones madre de DiO _libre y dio-LCNPs; concentraciones DiO apropiadas para la incubación de células serán ~ 1-10 mM (expresado como ya sea la concentración de DiO _libre o DiO en forma de DiO-LCNP).
2. Quitar el medio de crecimiento de las placas de cultivo utilizando una pipeta serológica y lavar las monocapas de células (véase la etapa 3) dos veces con HEPES-DMEM (2 ml cada lavado). Realizar los lavados añadiendo y eliminando HEPES-DMEM con una pipeta a / desde el borde de los platos con cuidado.
3. Añadir 0,2 ml de las soluciones preparadas de entrega _libre o DIO-LCNP Dio el centro de las placas de cultivo y devolver los platos a la incubator durante un período adecuado de tiempo (típicamente 15 o 30 min, dependiendo de las necesidades del experimento). Tiempos de incubación más largos se suman a más de etiquetado celular no específica de las zonas no membranosas (por ejemplo, citosol).
4. Después del período de incubación, retirar las soluciones de entrega utilizando una pipeta serológica. Se lavan las monocapas de células dos veces con DPBS (2 ml cada lavado). Realizar los lavados añadiendo con cuidado y quitando DPBS a / desde el borde del plato.
5. Fijar las monocapas celulares usando 4% de paraformaldehído (preparado en DPBS) durante 15 min a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es inflamable, un irritante respiratorio, y un posible carcinógeno.
6. Eliminar la solución de paraformaldehído usando una pipeta y lavar suavemente las células 1 vez con DPBS (2 ml) mediante la adición y la eliminación de DPBS usa la pipeta para / desde el borde de los platos.
7. Las células fijadas están listas para ser reflejado por la presencia de una señal de fluorescencia membranosa utilizando láser confocal de barridoLa microscopía (CLSM). Realice la imagen inmediatamente o, en su defecto, sustituir el medio con DPBS que contenía 0,05% _{de NaN3} y almacenar los platos a 4 ° C.
   PRECAUCIÓN: NaN ₃ es tóxico; extremar la precaución al utilizar _NaN3.
   NOTA: Se ha corregido muestras almacenadas de esta manera deben ser reflejados dentro de 48 horas para obtener resultados óptimos.

5. celular Entrega de Dio y Dio-LCNPs y FRET Imaging en células vivas

NOTA: En este método, las células se colabeled con 6 M cada DiO-LCNP-PEG-Chol (donde DiO es un donante FRET) y 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DII _libre, donde DII es un aceptor de FRET). La liberación de DiO de Dio-LCNP-PEG-Chol y su incorporación en la membrana plasmática es confirmado por un aumento observado en la transferencia de energía desde el donante al aceptor DiO Dil.

1. Las células de la etiqueta secuencialmente con Dio-LCNP-PEG-Chol y Dil _frecorreo utilizando el método descrito en el paso 4.
2. Después de la tinción, se lavan las células 1 vez con DPBS (2 ml) usando una pipeta serológica y reemplazar el tampón de lavado con 2 ml de solución de imágenes de células vivas (CLIS).
3. En un escenario microscopio equipado con una cámara de incubación climatizada, la imagen de muestra de células vivas usando un microscopio confocal (objetivo 60X) con una configuración de formación de imágenes FRET a intervalos de 30 min durante un período de 4 horas por la excitación del donante DiO a 488 nm y recogida de emisión completa espectros tanto del donante y el aceptor DiO DiI 490-700 nm con un detector espectral de 32 canales.
4. NOTA: Para obtener más información sobre las imágenes de FRET, por favor, véase la referencia ^15.
5. Determinar la intensidad de las emisiones de resolución temporal tanto del donante y el aceptor DiO Dil de células teñidas con Dio-LCNP-PEG-Chol y Dil. Calcula el aceptor / donador de FRET resuelta en el tiempo ratio (DiI _emi / DiO _EMI) para las imágenes, lo que aumentará de manera constante y, finalmente, la placaau una vez que la cantidad de donante de DiO con particiones en la membrana ha alcanzado un máximo ^16.

6. Ensayo de citotoxicidad de Dio y Dio-LCNPs a las células HEK 293T / 17 células

NOTA: La citotoxicidad de los materiales DiO-LCNP se evaluó mediante un ensayo de proliferación a base de colorante de tetrazolio ^17. Las células se cultivan en una placa de múltiples pocillos en presencia de concentraciones variables de los materiales bajo condiciones que emulan la entrega / etiquetado. Las células se cultivaron luego durante 72 horas para permitir la proliferación. Un colorante (MTS, (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil se añade a continuación) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio) a los pocillos, y metabólicamente activo células convierten el colorante en un producto de formazán azul. la cantidad de formación de color es directamente proporcional al número de células viables.

1. Cosecha HEK 293 T1 / 7 células del matraz T-25 siguiendo el procedimiento descrito en la etapa 3.2.Seed/ 17 células HEK 293T (5.000 células / 100 l / pocillo) a los pocillos de una placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos tratados y la cultura durante 24 horas.
2. Eliminar por completo los medios de cultivo de los pocillos utilizando una micropipeta y añadir 50 l de HEPES-DMEM que contenía DiO _libre, dio-LCNPs, o Dio-LCNP-PEG-Chol a concentraciones crecientes de replicar pozos. Incubar en las células a 37 ° C durante 30 min.
   NOTA: Por lo general, repeticiones hecho triplicado o cuadruplicado son suficientes para obtener datos estadísticamente fiables.
   1. Después de la incubación, se elimina el medio de suministro que contiene los materiales utilizando una micropipeta y reemplazarla con 100 l de medio de crecimiento. Cultivar las células durante 72 horas.
3. Añadir 20 l de sustrato a cada pocillo de tetrazolio, devuelva la placa de la incubadora, y permitir la formación de color para proceder a 37 ° C durante 4 h. Leer la absorbancia (abs) del producto formazan a 570 nm (mínimos de absorción para los dio-LCNPs utilizados en este Study) y 650 nm (para la sustracción de fondo no específica de absorbancia) usando un lector de placas de microtitulación.
4. Trazar el valor diferencial de absorbancia (abs ₅₇₀ - abs ₆₅₀₎ frente a la concentración de material y reportar los resultados como porcentaje de la proliferación de células control (grado de proliferación de las células en medio de cultivo de células solamente).

Análisis 7. Datos

1. Analizar estadísticamente los datos con un análisis univariado de la varianza (ANOVA). Para comparaciones múltiples, aplicar el test post hoc de Bonferroni. Proporcionar a todos los valores medios ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique lo contrario.
   NOTA: La probabilidad aceptable de significación fue de p <0,05.

Resultados

LCNPs se prepararon en la que el núcleo hidrofóbico de la NP se cargó con una sonda de membrana de etiquetado representante para demostrar la utilidad de la LCNP como un vehículo de suministro eficiente para cargas hidrófobas. Para este propósito, la carga elegido fue el potenciométrica colorante membrana de etiquetado altamente insoluble en agua, DiO. LCNPs cargadas con DiO (DIO-LCNPs) se sintetizaron utilizando una técnica de mini-emulsión de dos fases con los componentes químicos DACTP11, AC10COONa, y DiO, ...

Discusión

Un objetivo continuo de NMDD es la orientación controlada y entrega de formulaciones de fármacos a células y tejidos, en combinación con la eficacia del fármaco mejorada simultánea. Una clase específica de moléculas de fármacos para los que esto ha supuesto un importante reto es agentes drogas / imagen hidrófobos que tienen con moderación para ninguna solubilidad en medios acuosos. Este problema ha plagado la transición de fármacos potentes de en sistemas de cultivo celular in vitro para e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)	ThermoFisher	E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)	Sigma Aldrich	D4292-20MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride	Nanocs, Inc.	PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter	ThermoFisher	C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher	14040182	Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma	ThermoFisher	33010018	Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V)	ThermoFisher	28906	Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)	American Type Culture Collection	ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS)	ThermoFisher	A14291DJ	Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS)	ThermoFisher	24510
Nikon A1si spectral confocal microscope	Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)	ThermoFisher	T10282	mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor	Sonics and Materials Inc	GEX 600-5
Mini Cetntrifuge	Benchmark	Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium	GE Healthcare	17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System	Bio-RAD	76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056