Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

Zusammenfassung

Eine Flüssigkristall-Nanopartikel (LCNP) Nanotransporter wird als Träger für die kontrollierte Abgabe eines hydrophoben Ladung an die Plasmamembran lebender Zellen ausgenutzt.

Zusammenfassung

Die kontrollierte Abgabe von Arzneimittel / Abbildungsmittel für Zellen ist entscheidend für die Entwicklung von Therapeutika und für die Untersuchung von zellulären Signalprozessen. Vor kurzem Nanopartikel (NPs) sehr vielversprechend sind in der Entwicklung solcher Abgabesysteme gezeigt. Hierbei wird ein Flüssigkristall NP (LCNP) basierende Verabreichungssystem wurde für die kontrollierte Abgabe eines wasserunlöslichen Farbstoff eingesetzt, 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO), von innerhalb des NP Kern zu den hydrophoben Bereich eines Plasma Membran-Doppelschicht. Während der Synthese der NPs wurde der Farbstoff effizient in den hydrophoben Kern LCNP eingebaut, wie bestätigt durch mehrere spektroskopische Analysen. Konjugation eines PEGylierten Cholesterinderivat zur NP Oberfläche (DIO-LCNP-PEG-Chol) aktiviert die Bindung der farbstoffbeladenen NPs an die Plasmamembran in HEK 293T / 17-Zellen. Zeitaufgelöste Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Bildgebung bestätigte den Passive Efflux von DiO vom LCNP Kern und seine Insertion in die Plasmamembran-Doppelschicht. Schließlich abgeschwächt die Lieferung der OVI als LCNP-PEG-Chol die Zytotoxizität von DiO; die NP Form Dio ausgestellt ~ 30-40% geringere Toxizität im Vergleich zu DiO _frei von Massenlösung geliefert. Dieser Ansatz zeigt die Nützlichkeit der LCNP Plattform als effiziente Modalität für die membranspezifische Abgabe und Modulation der hydrophoben Molekül cargos.

Einleitung

Seit dem Aufkommen der Schnittstelle Nanomaterialien (Materialien ≤100 nm in mindestens einer Dimension) mit lebenden Zellen, ein kontinuierliches Ziel wurde für verschiedene Anwendungen Vorteile der einzigartigen größenabhängigen Eigenschaften von Nanopartikeln (NPs) zu nehmen. Diese Anwendungen umfassen die Zell- und Gewebemarkierungs / imaging (sowohl in vitro als auch in vivo), Echtzeiterfassung, und die gesteuerte Abgabe von Arzneimitteln und anderen cargos ^1. Beispiele für solche relevanten NP Eigenschaften umfassen die größenabhängige Emission von Halbleiter-Nanokristallen (Quantum Dots, QD); die Eigenschaften Lichtwärmeumsetzmaterial von Gold-Nanopartikeln; die große Ladekapazität des wässrigen Kern von Liposomen; und die ballistische Leitfähigkeit von Kohlenstoffallotrope, wie einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren und Graphen.

In jüngerer Zeit hat großes Interesse an der Verwendung von NPs für die kontrollierte Modulation von Arzneimitteln und anderen Frachten, wie Kontrast / Abbildungs ​​a entstandenHerren. Hier ist das Grundprinzip deutlich zu verbessern / optimieren den gesamten Löslichkeit abgegebenen Dosis, Kreislaufzeit und eventuelle Clearance des Arzneimittels Ladung durch sie als NP-Formulierung zu liefern. Dies hat sich als NP-vermittelte Arzneimittelabgabe bekannt sein (NMDD), und es gibt derzeit sieben FDA-zugelassenen NP Arzneimittel-Formulierungen für den Einsatz in der Klinik verschiedene Krebsarten und Hunderte mehr in verschiedenen Phasen der klinischen Studien zu behandeln. Im Wesentlichen ist es das Ziel, "mehr mit weniger zu erreichen;" Das heißt, das NP als Gerüst zu verwenden , um mehr Medikament mit weniger Dosierungs Verabreichungen liefern durch Ausnutzung der großen Oberflächenbereich einnehmen: Volumen (beispielsweise harte Partikel, wie QD und Metalloxiden) von NPs oder deren großen Innenvolumen zum Beladen große Fracht Nutzlasten (zB Liposomen oder Mizellen). Der Zweck ist hier die Notwendigkeit für mehrere systemisch zugeDosierungsSchemata zu reduzieren, während gleichzeitig die wässrige Stabilität und eine verbesserte Durchblutung fördern, insbesondere füranspruchsvolle hydrophobe Arzneimittel cargos, die zwar hochwirksam, in wässrigen Medien schwer löslich sind.

Somit war das Ziel der hierin beschriebene Arbeit, die Lebensfähigkeit der Verwendung eines neuen NP-Gerüst für die spezifische und gesteuerte Abgabe von hydrophoben cargos dem lipophilen Plasmamembran-Doppelschicht zu bestimmen. Die Motivation für die Arbeit war die inhärente begrenzte Löslichkeit und die Schwierigkeit bei der Bereitstellung von hydrophoben Molekülen an Zellen aus wäßrigen Medien. Typischerweise erfordert die Lieferung solcher hydrophoben Molekülen die Verwendung von organischen Lösungsmitteln (beispielsweise DMSO) oder amphiphile Tenside (beispielsweise Poloxamere), die ² oder Mizelle Träger toxischen und Kompromisse Zell- und Gewebelebensfähigkeit sein kann, die interne Belastung begrenzt haben kann Kapazitäten. Der NP Träger ausgewählt hier war eine neue Flüssigkristall NP (LCNP) Formulierung zuvor ³ entwickelt und dass zuvor eine ~ 40-fache zu erreichen gezeigt worden war Verbesserung der Wirksamkeit des Antikrebsmedikament Doxorubicin in kultivierten Zellen ^4.

In der hier beschriebenen Arbeiten wählte die repräsentative Ladung war die potentiometrischen Membranfarbstoff, 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO). DiO ist ein wasserunlöslicher Farbstoff, der für die anterograde und retrograden Tracing in lebenden und fixierten Neuronen, Membranpotentialmessungen verwendet wurde und für die allgemeine Kennzeichnung Membran ^{5, 6, 7, 8, 9.} Aufgrund seiner hydrophoben Natur ist DiO typischerweise direkt zu Zellmonolayern oder Geweben in einer kristallinen Form ^10, oder es wird in sehr hohen Konzentrationen inkubiert (~ 1-20 uM) nach Verdünnung von einer Konzentration Stammlösung ^{11, 12.}

content "> Hierbei ist die Vorgehensweise war die Verwendung zur LCNP Plattform, ein multifunktionales NP, dessen innere Kern vollständig hydrophob ist und deren Oberfläche gleichzeitig hydrophile und zugänglich Biokonjugation, als Abgabevehikel für DiO. DiO in die LCNP Kern während der Synthese eingearbeitet und die NP Oberfläche dann mit einem PEGylierten Cholesterin-Einheit zu fördern, um die Bindung an die Membran der OVI-LCNP Ensemble an der Plasmamembran. Dieser Ansatz führte zu einem Abgabesystem, das partitioniert Dio in die Plasmamembran mit größerer Treue und Membran Residenz funktionalisiert ist Zeit als die freie Form von DiO von Massenlösung geliefert (DIO _frei). Ferner ist dieses Verfahren zeigte , dass die LCNP-vermittelte Abgabe von DiO moduliert wesentlich und treibt die Rate der spezifischen Unterteilung des Farbstoffes in die lipophile Plasmamembran bilayer. Dies ist erreicht, während gleichzeitig die Zytotoxizität des freien Arzneimittels von ~ 40% zu reduzieren, indem es als LCNP Formulierung zu liefern.

Es wird erwartet, dass die hier beschriebene Methode eine leistungsstarke ermöglicht Technik für die Forscher, deren Arbeit mit sein wird oder erfordert die zelluläre Bereitstellung von stark hydrophoben Frachten, die schwer löslich oder vollständig unlöslich in wässriger Lösung sind.

Protokoll

1. Vorbereitung der OVI-LCNP und DIO LCNP-PEG-Chol

1. Auflösen flüssigkristallines Diacrylat-Vernetzungsmittel (DACTP11, 45 mg), 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO, 2 mg) und einem Radikalinitiator (Azobisisobutyronitril, 1 mg) für die Polymerisation in 2 ml Chloroform gegeben. Fügen diese zu einer wässrigen Lösung von Acrylat-funktionalisierten Tensids (AC10COONa, 13 mg in 7 ml).
2. Rühre das Gemisch 1 h und beschallen bei 80% Amplitude für 5 min, um eine Miniemulsion herzustellen, das aus kleinen Tröpfchen des organischen Materials von polymerisierbarem Tensid in Wasser umgeben.
3. Das Gemisch wird auf 64 ° C in einem Ölbad zu initiieren die Polymerisation sowohl des Vernetzungsmittels und des Tensids, wie das Chloroform langsam verdampft, so dass eine DiO enthaltenden NP Suspension, die durch das oberflächenaktive Mittel stabilisiert ist.
4. Filtern Sie die NP-Suspension (3 mal) durch einen 0,2 & mgr; m Spritzenfilter auf jede Aggregation zu entfernen. Store der gefilterten NP-Lösung bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
5. Konjugation von PEG-Chol Dio-LCNP über EDC - Kopplung.
   1. Auflösen Chol-PEG-NH ₂ · HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) in 25 mM HEPES - Puffer (pH 7,0).
   2. Bereiten einer Arbeitslösung , enthaltend N -hydroxy-sulfosuccinimide Natriumsalz (NHSS, 40 mM) und 1-Ethyl-3- (3- (dimethylamino) -propyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC, 400 mM) in HEPES - Puffer aus konzentrierten Stammlösungen.
   3. Sofort im 20 ul der frisch hergestellten Arbeitslösung von NHSS / EDC bis 1,0 ml der OVI-LCNP in HEPES-Puffer und rühre 5 min.
   4. In 20 ul Stammlösung von Chol-PEG-NH ₂ · HCl zu dieser Mischung und rühre 2 Stunden.
   5. Zentrifuge kurz die Reaktionsmischung bei maximaler Geschwindigkeit (~ 2.000 × g) für 30 sec eine Tischplatte Mini - Zentrifuge und übergeben Sie den Überstand durch eine PD-10 Grßenausschlußchromatographie Säule ¹³ ins Gleichgewicht gebracht mitDulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 0,1x).

2. Charakterisierung der OVI-LCNP und DIO LCNP-PEG-Chol

1. Bestätigen Sie die erfolgreiche kovalente Konjugation von PEG-Chol zu DIO-LCNP Oberfläche durch Gelelektrophorese.
   1. Man löst 0,5 g Agarose in 50 ml (1x) Tris-Borat-Elektrophorese (TBE; 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM Borsäure und 2 mM EDTA) -Puffer. Die Lösung wird in einem Mikrowellenofen, um die Agarose aufzulösen. Lassen Sie die Lösung leicht abkühlen, und der Inhalt in eine Gelplatte in die Elektrophorese-Box gießen. Legen Sie eine Gelkamm zu Probenschächten erstellen.
   2. Sobald das Gel erstarrt ist, fügen die erforderliche Menge (genug, um das Gel in die Kammer unterzutauchen) von TBE-Laufpuffer in die Kammer.
   3. Mit 35 ul DiO-LCNP Probe (amended mit Glycerin, 5% v / v) in die Vertiefungen des Gels und bei einer Spannung von 110 V. 20 min laufen
   4. Bild das Gel ein Gel Imaging-System wi mitth Anregungs- und Emissionsfilter bei 488 nm und 500-550 nm.
2. Beurteilen Sie Partikelgröße und -verteilung durch dynamische Lichtstreuung (DLS) von Dio-LCNP Lösung verdünnt (~ 200-fache Verdünnung) in PBS (pH ~ 8, 0,1x) und Messen auf einem DLS Instrument ^14. Messen Sie die Zeta-Potential der OVI-LCNPs ein entsprechendes Zeta-Potential Messinstrument.

3. Herstellung von Zellkulturschalen für Lieferung Experimente und Imaging

HINWEIS: DIO LCNP Kennzeichnung auf HEK 293T / 17 menschliche embryonale Nierenzellen (zwischen den Kanälen 5 und 15) durchgeführt wird , die kultiviert werden , wie zuvor ⁴ beschrieben. Führen Sie die Lieferung Experimente und die nachfolgende Zelle Bildgebung wie unten beschrieben.

1. Vorbereitung 35 mm Durchmesser-Gewebekulturschalen (ausgestattet mit 14 mm No. 1 Abdeckglas Einsätze), indem sie mit bovine Fibronectin Beschichtung (~ 100 & mgr; l bei einer Konzentration von 20 ug/ Ml) in DPBS 2 Stunden lang bei 37 ° C.
2. Entfernen Sie die Fibronektin Beschichtungslösung von der Kulturschale. Ernte HEK 293 T1 / 7-Zellen aus dem T-25-Kolben, indem zuerst Waschen der Zellmonoschicht mit 3 ml DPBS und dann durch Zugabe von 2 ml Trypsin-EDTA (0,5% Trypsin-0,25% EDTA).
3. Inkubieren der Kolben bei 37 ° C für ~ 3 min. Entfernen Sie die Trypsin-EDTA und kehren die Kolben in den Inkubator. Sobald Zellen vom Kolben abgelöst werden, Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 4 ml vollständigem Medium (Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM; geänderte 10% fötalem Rinderserum, 5% Natriumpyruvat enthielt, und 5% Antibiotikum / Antimykotikum) in den Kolben . Bestimmen Sie die Zellkonzentration in der Suspension, indem sie in einem Zellzähler gezählt.
4. Stellen Sie die Zellkonzentration auf ~ 8 × 10 ⁴ Zellen / ml mit Wachstumsmedium. 3 ml der Zellsuspension in die Schale und Kultur in den Inkubator über Nacht; Am nächsten Tag sollten die Zellen bei ~ 70% Konfluenz sein und sollten zur Verwendung bereit sein. AngemesseneZelldichte ist von entscheidender Bedeutung für eine robuste und effiziente Markierung von einem hohen Prozentsatz von Zellen.

4. Cellular Lieferung von DIO und DIO LCNPs und Bildgebung von fixierten Zellen

1. Bereiten Sie 1 ml Lösungen Dio Dio-LCNP und DIO LCNP-PEG-Chol in Fördermedium (HEPES-DMEM; DMEM , das 25 mM HEPES) durch Verdünnen von Stammlösungen der OVI _frei und DIO LCNPs; geeignete DiO Konzentrationen für die Inkubation auf Zellen werden ~ 1-10 uM (ausgedrückt als entweder die Konzentration der OVI _frei oder Dio Form der OVI-LCNP).
2. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Kulturschalen eine serologische Pipette und die Zellmonolayern waschen (siehe Schritt 3) zweimal mit HEPES-DMEM (je 2 ml Wasch). Führen Sie die Waschungen durch leichtes Hinzufügen und Entfernen von HEPES-DMEM eine Pipette zum / vom Rand der Speisen verwenden.
3. In 0,2 ml der vorbereiteten DiO _frei oder DIO LCNP - Delivery - Lösungen zum Zentrum der Kulturschalen und geben die Gerichte an die incubator für einen angemessenen Zeitraum (typischerweise 15 oder 30 min, je nach den Bedürfnissen des Experimentes). Längere Inkubationszeiten in den mehr unspezifische zelluläre Kennzeichnung von nicht-membranartige Bereiche (zB Cytosol).
4. Nach der Inkubationszeit, entfernen Sie die Delivery-Lösungen eine serologische Pipette. Waschen Sie die Zellmonolayern zweimal mit DPBS (je 2 ml Wasch). Führen Sie die Waschungen durch leichtes Hinzufügen und Entfernen von DPBS zum / vom Rand der Schale.
5. Fix die Zellmonolayern unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd (hergestellt in DPBS) für 15 min bei Raumtemperatur.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd ist brennbar, ein Atmungsreizmittel, und ein Verdacht, karzinogen.
6. Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung mit einer Pipette und die Zellen vorsichtig 1-mal mit DPBS waschen (2 ml) durch Hinzufügen und Entfernen von DPBS zum / vom Rand der Gerichte mit Pipette.
7. Die fixierten Zellen sind bereit für die Anwesenheit eines membranösen Fluoreszenzsignal unter Verwendung von konfokaler Laserscanning abgebildet werdenMikroskopie (CLSM). Führen Sie die Bild sofort oder alternativ, ersetzen Sie das Medium mit DPBS mit 0,05% NaN ₃ und speichern Sie die Gerichte bei 4 ° C.
   ACHTUNG: NaN ₃ ist giftig; äußerste Vorsicht walten lassen, wenn man ₃ NaN verwenden.
   HINWEIS: Feste Proben auf diese Weise gelagert werden, sollten innerhalb von 48 Stunden für optimale Ergebnisse abgebildet werden.

5. Cellular Lieferung von DIO und DIO LCNPs und FRET-Imaging in lebenden Zellen

HINWEIS: In diesem Verfahren werden Zellen colabeled mit 6 & mgr; M jedes DiO-LCNP-PEG-Chol (wobei DiO ein FRET-Donor) und 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin Perchlorat (DiI _frei, wo Dil ist ein FRET - Akzeptor). Die Veröffentlichung der OVI von DiO-LCNP-PEG-Chol und dessen Einbau in die Plasmamembran wird durch eine beobachtete Zunahme der Energieübertragung von den DIO-Donor auf den Akzeptor Dil bestätigt.

1. Label - Zellen nacheinander mit DiO-LCNP-PEG-Chol und Dil _free unter Verwendung der in Schritt beschriebenen Verfahren 4.
2. Nach dem Färben Waschen Sie die Zellen 1 mal mit DPBS (2 ml) einer serologischen Pipette und der Waschpuffer mit 2 ml Live Cell Imaging-Lösung (LCIS) ersetzen.
3. Auf einem Mikroskoptisch mit einem beheizten Inkubationskammer ausgestattet, Bild der Live-Zellprobe mit einem konfokalen Mikroskop (60x Objektiv) mit einem FRET-Imaging-Konfiguration in 30-Minuten-Intervallen über einen 4 Stunden-Zeitraum durch Anregung des DiO Spender bei 488 nm und das Sammeln volle Emission mit Spektren der beiden Dio Spender und Dil Akzeptor 490-700 nm mit einem 32-Kanal-spektral-Detektor.
4. HINWEIS: Weitere Informationen über FRET - Imaging finden Sie unter ¹⁵ verweisen.
5. Bestimmen Sie die zeitaufgelöste Emissionsintensität sowohl den DIO-Spender und Dil Akzeptor von Zellen gefärbt mit DiO-LCNP-PEG-Chol und Dil. Berechnen Sie die zeitaufgelöste Akzeptor / Donor - FRET - Verhältnis (Dil _emi / DiO _EWI) für die Bilder, die stetig zunehmen wird und schließlich Platteau einmal die Menge der OVI Spender in die Membran unterteilt ist maximal ¹⁶ erreicht.

6. Zytotoxizitätstest von DIO und DIO LCNPs zu den HEK 293T / 17-Zellen

HINWEIS: Die Zytotoxizität der OVI-LCNP Materialien bewertet wird ¹⁷ einen Tetrazoliumfarbstoffs basierten Proliferationstest verwendet wird . Zellen werden in einer Mikrotiterplatte in Gegenwart von variierenden Konzentrationen der Materialien unter Bedingungen, die Lieferung / Kennzeichnung emulieren. Die Zellen werden dann für 72 Stunden kultiviert Proliferation zu ermöglichen. Ein Farbstoff (MTS (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) wird dann zu den Vertiefungen und metabolisch aktiv Zellen wandeln den Farbstoff in einem blauen Formazan Produkt. die Menge an Farbbildung auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen direkt proportional ist.

1. Ernte HEK 293 T1 / 7-Zellen aus dem T-25-Kolben durch das Verfahren beschrieben in Schritt folgenden 3.2.SeedHEK 293T / 17-Zellen (5000 Zellen / 100 ul / Vertiefung) zu den Vertiefungen einer 96-Well-Gewebekultur-behandelte Platte und die Kultur für 24 Std.
2. Entfernen Sie vollständig die Kulturmedien aus den Vertiefungen mit einer Mikropipette und 50 ul HEPES-DMEM _frei dio-LCNPs oder DiO-LCNP-PEG-Chol bei steigenden Konzentrationen Brunnen zu replizieren enthält DiO hinzuzufügen. Inkubieren auf die Zellen bei 37 ° C für 30 min.
   HINWEIS: In der Regel Replikaten in dreifacher Ausfertigung oder vierfacher Ausfertigung durchgeführt sind ausreichend statistisch zuverlässige Daten zu erhalten.
   1. Nach der Inkubation, entfernen Sie das Fördermedium die Materialien mit einer Mikropipette und ersetzen Sie es mit 100 ul Wachstumsmedium enthält. Kultur die Zellen für 72 Stunden.
3. In 20 ul des Tetrazolium-Substrat in jede Vertiefung, kehren die Platte in den Inkubator und lassen die Farbbildung bei 37 ° C für 4 Stunden, um fortzufahren. Die optische Dichte (abs) des Formazanprodukts bei 570 nm (Absorptionsminima für die OVI-LCNPs in diesem stu verwendetdy) und 650 nm (für die Subtraktion der unspezifischen Hintergrundabsorption) eines Mikrotiterplatten-Lesegerät verwenden.
4. Plotten des Differenzabsorptionswert (abs ₅₇₀ - abs ₆₅₀₎ gegenüber der Materialkonzentration und berichten die Ergebnisse als Prozent der Kontrolle der Zellproliferation (Grad der Proliferation von Zellen in Zellkulturmedium only).

7. Datenanalyse

1. Statistisch gesehen, die Daten mit einer univariaten Varianzanalyse (ANOVA) analysiert werden. Für multiple Vergleiche gelten die post-hoc-Test nach Bonferroni. Geben Sie alle Mittelwerte als ± Standardabweichung vom Mittelwert (SEM), sofern nicht anders angegeben.
   HINWEIS: Die akzeptable Wahrscheinlichkeit für Signifikanz war p <0,05.

Ergebnisse

LCNPs wurden, in denen der hydrophobe Kern des NP, hergestellt mit einem repräsentativen membranMarkierungsSonde geladen wurde die Nützlichkeit des LCNP als effizientes Abgabevehikel für hydrophobe Frachten zu demonstrieren. Zu diesem Zweck gewählte Ladung war sehr wasserunlöslichen potentiometrische membranMarkierungsFarbstoff, DiO. DiO belasteten LCNPs (DIO-LCNPs) wurden unter Verwendung synthetisiert ein zweiphasiges Miniemulsionstechnik mit der chemischen Komponenten DACTP11, AC10COONa und DiO, wie in A...

Diskussion

Ein ständiges Ziel der NMDD ist die kontrollierte Ausrichtung und Abgabe von Arzneimittelformulierungen an Zellen und Geweben, bei gleichzeitiger Verbesserung der Wirksamkeit von Medikamenten kombiniert. Eine spezielle Klasse von Arzneimittelmolekülen, für die dies eine große Herausforderung gestellt hat, hydrophobe Arzneimittel / Abbildungsmittel, die schwer bis gar keine Löslichkeit in wäßrigen Medien aufweisen. Dieses Problem ist der Übergang von wirksamen Arzneimitteln aus in vitro - Zellkultursyste...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)	ThermoFisher	E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)	Sigma Aldrich	D4292-20MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride	Nanocs, Inc.	PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter	ThermoFisher	C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher	14040182	Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma	ThermoFisher	33010018	Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V)	ThermoFisher	28906	Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)	American Type Culture Collection	ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS)	ThermoFisher	A14291DJ	Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS)	ThermoFisher	24510
Nikon A1si spectral confocal microscope	Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)	ThermoFisher	T10282	mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor	Sonics and Materials Inc	GEX 600-5
Mini Cetntrifuge	Benchmark	Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium	GE Healthcare	17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System	Bio-RAD	76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056