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Method Article
一种液晶纳米颗粒(LCNP)纳米载体被利用作为用于受控递送疏水货物的活细胞的质膜的车辆。
药物/成像剂对细胞的受控递送是治疗学的发展和对细胞信号过程的研究是至关重要的。最近,纳米粒子(NPS)都表现出这样的运载系统的发展显著的承诺。这里,液晶的NP(LCNP)系递送系统已被用于不溶于水的染料,3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine高氯酸(DIO)的受控递送,从NP芯内的等离子体的疏水区双层膜。在纳米颗粒的合成中,将染料有效地掺入疏水LCNP芯,如确认由多个光谱分析。 PEG化的胆固醇衍生物的NP表面(DIO-LCNP-PEG-澈)的缀合使染料加载纳米粒的结合在HEK 293T / 17细胞质膜。时间分辨激光扫描共聚焦显微镜和荧光共振能量转移(FRET)成像证实通从LCNP芯和其插入质膜双层香港专业教育学院DIO的流出。最后,迪欧作为LCNP-PEG-澈交付衰减DIO的细胞毒作用;相比DIO 无批量交付解决方案DIO的NP形式展出少〜30%-40%的毒性。这种做法表明了LCNP平台的效用的有效模式疏水分子货物的具体膜交付和调制。
由于与活细胞的接口的纳米材料(材料≤100纳米的至少一个维度)的出现,持续目标是采取纳米颗粒(纳米颗粒),用于各种应用的独特大小依赖特性的优势。这些应用包括细胞和组织的标记/成像( 在体外和在体内 ),实时检测和的药物和其它货物1的受控递送。这种相关的NP性质的实例包括半导体纳米晶体的尺寸依赖性发射(量子点,量子点);金纳米颗粒的光热特性;脂质体的水性核心的大负荷能力;和碳同素异形体,例如单壁碳纳米管和石墨烯的弹道导电性。
最近,显著的兴趣已经出现在药品和其他货物,如对比度/成像的控制调制使用核动力源男厕所。在这里,基本原理是显著提高/通过提供它作为一个NP制剂优化整体溶解度,递送剂量,循环时间,并最终清除药物的货物。这已经到了被称为NP介导的药物递送(NMDD),并有目前有7种FDA批准的药物NP制剂在临床上用于治疗各种癌症和数百个临床试验的各个阶段。在本质上,目标是"实现事半功倍;"也就是说,要使用NP作为支架通过取较大的表面积的优点用较少的给药施用以提供更多的药物:体积( 如 ,硬颗粒,如量子点和金属氧化物)纳米粒子的或它们的大的内部容积为装载大货的有效载荷( 例如 ,脂质体或胶束)。这里的目的是为了减少多全身递送给药方案的必要性,而在同一时间促进水溶液稳定性和增强的循环,特别是用于有挑战性疏水药物货物,虽然高效,是在水性介质中微溶。
因此,本文所描述的工作的目的是确定使用一种新的NP支架,用于向亲脂质膜双层的具体和受控递送疏水货物的生存能力。对工作的动机是固有的有限的溶解度和难于从含水介质递送疏水性分子的细胞。典型地,这样的疏水性分子的递送需要使用的有机溶剂( 例如 ,DMSO)或两亲性表面活性剂( 例如 ,泊洛沙姆),这可能是有毒的和妥协的细胞和组织的生存力2,或胶束载体,其可以具有有限的内部负载能力。这里所选择的NP载体是一种新型液晶的NP(LCNP)先前开发3制剂和先前已示出,实现了〜40倍改进,在抗癌药物阿霉素的培养细胞4的功效。
在本文所述的工作中,所选择的代表性的货物是电位膜染料,3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine高氯酸(DIO)。 DIO是已经用于生活和固定神经细胞,膜电位测量顺行和逆行追踪不溶于水的染料,和一般的膜标记5,6,7,8,9。由于其疏水特性,DIO通常直接加入到细胞单层或组织中的结晶形式10,或它在非常高的浓度下培养 (〜1-20μM)从浓度原液11,12稀释后。
内容">这里,方法是利用以LCNP平台,一个多功能的NP,其内芯是完全疏水性的,其表面是同时的亲水性和适合于生物耦合,作为递送载体用于DIO。DIO掺入合成期间LCNP芯和对NP表面,然后用聚乙二醇化的胆固醇部分官能化,以促进膜的DIO-LCNP合奏的质膜的结合。这种方法产生了一个输送系统,该系统划分的DIO到质膜以更大的保真度和膜滞留时间比DIO的游离形式从本体溶液递送(DIO 免费 )。另外,该方法表明,DIO的LCNP介导的递送基本调制并驱动染料的特定分区的速率进入亲脂质膜双层。这是实现同时伴随减少游离药物的细胞毒作用〜40%,通过提供它作为一个LCNP配方。预计本文所描述的方法将是研究人员其工作涉及或要求是难溶或在水溶液中完全不溶高度疏水货物的蜂窝递送强大有利的技术。
1. DIO-LCNP和DIO-LCNP-PEG-澈的制备
2. DIO-LCNP和DIO-LCNP-PEG-澈的表征
3.细胞培养皿中准备交货的实验和成像
注:DIO-LCNP标签上的HEK 293T / 17的人胚胎肾细胞(通道5和15之间),为先前4描述的是培养的进行。执行输送实验和如下所述的随后的细胞成像。
4. DIO和DIO-LCNPs的细胞交付和固定细胞成像
活细胞DIO和DIO-LCNPs和FRET成像5.细胞交付
注:在该方法中,将细胞colabeled 6μM每个DIO-LCNP-PEG-澈(其中DIO是FRET供体)和1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'- tetramethylindocarbocyanine高氯酸(DII 免费 ,其中dii是FRET受体)。 DIO从DIO-LCNP-PEG-澈和其掺入释放到质膜是通过在从DIO施主的能量转移到所述的DiI受体的观察增加确认。
6. DIO的细胞毒性检测和DIO-LCNPs到HEK 293T / 17细胞
注:DIO-LCNP材料的细胞毒性使用基于染料四唑鎓增殖测定17评估。细胞,在不同浓度的物质的存在下模拟交付/标记条件下多孔板中培养。然后将细胞72小时培养以允许增殖。的染料(MTS,(3-(4,5-二甲基-2-基)-5-(3-羧基甲氧基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)然后被加入到孔中,以及代谢活性细胞将染料成蓝色甲产物。颜色形成的量成正比的活细胞的数量。
7.数据分析
制备LCNPs其中对NP的疏水核心中装入一个代表膜标记探针来演示LCNP的效用作为有效递送载体为疏水货物。为此目的,选择的货物是高度不溶于水的电位膜标记染料,DIO。 DIO-装载LCNPs(DIO-LCNPs)用与化学成分DACTP11,AC10COONa,和DIO两相微乳液技术合成, 如图 1 18。在这个NP系统中,结晶交联剂DACTP11的共价连接的聚合物网络提供其中DIO驻留的交联网络中的间?...
NMDD的一个持续目标是控制目标和药物制剂的细胞和组织的递送,并同时提高药物疗效相结合。对于此已经构成了显著挑战的一种特定类的药物分子是有节制地在水介质中不溶于疏水性药物/显像剂。这个问题一直困扰的强效药物的转变,从体外细胞培养系统,临床上并导致了一些有前途的药物分子被"搁置",或遗弃,而不是在临床上进一步推行。渥曼青霉素(Wtmn),例如是磷脂酰肌醇3'?...
作者宣称,他们没有竞争的经济利益。
这项工作是由夺标基地的经费计划(工作单位MA041-06-41-4943)的支持。 ON由国家研究理事会博士后研究会士的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37 °C before use |
Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C |
Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous; dilute to 4% using DPBS |
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37 °C before use |
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
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