Sıvı Kristal Nanopartikül Carrier bir Hidrofobik Kargo Encapsulated, hedeflenen Plazma Zarı Teslimat

Özet

Bir sıvı kristal nanopartikül (LCNP) nanocarrier canlı hücrelerin plazma zarına bir hidrofobik yük sürekli verilme için uygun bir araç olarak kullanılarak.

Özet

hücrelere ilaç / görüntüleme maddeleri kontrollü dağıtım terapötik maddelerin geliştirilmesi için ve hücresel sinyal işlev çalışmaları için önemlidir. Son zamanlarda, nanopartiküller (NPS), teslimat sistemlerinin gelişiminde önemli söz göstermiştir. Burada, sıvı kristal NP (LCNP) tabanlı dağıtım sistemi, bir plazma hidrofobik bölgeye NP çekirdek içinde bir suda-çözünmeyen boya, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) kontrollü olarak bırakılmaları için kullanılmaktadırlar edilmiştir membran iki tabakalı. NPlerin sentezi sırasında, boya verimli çoklu spektroskopik analizleri ile teyit edildiği gibi, hidrofobik LCNP orta tabakasına dahil edilmiştir. NP yüzeyi (DIO-LCNP-PEG-Chol) bir PEG'lenmiş kolesterol türevi çekimi HEK 293T / 17 hücrelerinde plazma zarı boya yüklü NPS bağlanmasını sağladı. Zamana bağımlı lazer tarama konfokal mikroskopi ve Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme geçmek doğruladıLCNP çekirdek ve plazma zarı bilayeri içine yerleştirilmesi gelen Dio çıkışını ive. Son olarak, bir LCNP-PEG-Chol olarak Dio teslim Dio sitotoksisitesini zayıflatılmış; Dio NP formu Dio _ücretsiz toplu bir çözüm teslim kıyasla ~% 30-40 daha az toksisite sergiledi. Bu yaklaşım, bir hidrofobik molekül yüklerin membran spesifik gönderimi ve düzenlenmesi için etkili bir yöntem olarak LCNP platformun faydasını ortaya koyar.

Giriş

canlı hücreler ile (en azından bir boyutta malzeme ≤100 nm) nanomalzemeler arayüz gelişiyle bu yana, sürekli bir gol çeşitli uygulamalar için nanopartiküller (NPS) benzersiz boyut özelliklerine yararlanmak olmuştur. Bu uygulamalar, hücre ve doku markalama / görüntüleme (in vitro ve hem de in vivo), gerçek zamanlı algılama ve ilaç ve diğer yüklerin ¹ kontrollü olarak verilmesini içerir. Böyle İlgili NP özelliklerin örnekleri yarı iletken Nanokristallerin boyutu bağımlı emisyon (kuantum noktaları, QD'lerin) arasında; altın nanopartiküllerin fototermal özellikleri; Lipozomlar sulu iç kısım büyük yükleme kapasitesi; Bu tür tek duvarlı karbon nanotüpler ve grafen olarak karbon allotropes, ve balistik iletkenlik.

Daha yakın zamanlarda, önemli derecede bir faiz gibi kontrast / görüntüleme a gibi ilaçlar ve diğer yükler, kontrollü modülasyonu için NPS kullanımında ortaya çıkmıştırbeyler. Burada, gerekçe anlamlı / geliştirmek bir NP formülasyonu olarak sunarak ilaç kargo genel çözünürlüğü, teslim dozu, dolaşım süresi ve nihai açıklığı optimize etmektir. Bu NP-aracılı ilaç dağıtım (NMDD) olarak bilinen hale geldi ve çeşitli kanserler ve klinik çalışmaların çeşitli aşamalarında daha yüzlerce tedavisinde klinikte kullanılmak üzere yedi FDA onaylı NP ilaç formülasyonları şu anda. "Daha az ile daha başarmak;" Özünde, amaç etmektir diğer bir deyişle, geniş yüzey alanı yararlanarak daha az dozaj idareleri devamı getirilmiş ilacı uygulamak için bir iskele olarak NP kullanımı: hacim (örneğin, bu tür QDS ve metal oksitler gibi sert parçacıklar) NPS veya yükleme için geniş iç hacme büyük kargo yükleri (örneğin, lipozomlar veya miseller). Buradaki amaç, sulu istikrar ve gelişmiş dolaşımını teşvik ederken aynı zamanda, özellikle için, birden fazla sistemik teslim doz rejimleri için gerekliliğini azaltmakÇok etkili olmakla beraber, sulu ortamda çok az çözünen, zor hidrofobik ilaç yükler.

Bu nedenle, burada tarif edilen çalışmanın amacı lipofilik plazma zarı çift tabakaya hidrofobik yükün spesifik ve kontrollü verilmesi için, yeni bir NP iskele ile canlılığı belirlemekti. iş için motivasyon sulu ortamdan hücrelere hidrofobik moleküllerin teslim doğasında sınırlı çözünürlük ve zorluk oldu. Tipik haliyle, bu tür hidrofobik moleküllerin dağıtım iç yükleme sınırlı toksik ve uzlaşma doku ve hücre canlılığı ² veya misel taşıyıcısı olabilir organik çözücüler (örneğin, DMSO) ya da amfifilik yüzey aktif (örneğin, Poloksamerler) kullanımını gerektirir kapasiteleri. Burada seçilen NP taşıyıcı önceden ³ geliştirilen yeni sıvı kristal NP (LCNP) formülasyonu ve bu ~ 40 kat ulaşmak için daha önce gösterilen olmuştu kültürlenmiş hücrelerde ⁴ antikanser ilaç doksorubisin etkinlikteki artış.

Burada tarif edilen çalışmada seçilmiştir Örnek kargo potansiyometrik membran boya, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) idi. DIO yaşam ve sabit nöronlar, membran potansiyeli ölçümlerde anterograd ve retrograd izleme için kullanılan bir suda çözülmeyen bir boya, ve genel membran etiketleme ^{5, 6, 7, 8, 9.} Dolayı hidrofobik doğası, DIO, genellikle bir kristal formunda ¹⁰ hücre mono tabakaları veya dokulara doğrudan ilave edilir, ya da çok yüksek konsantrasyonlarda kuluçkaya yatırılır Bir konsantrasyon stok solüsyonu ^{11, 12} seyreltme sonra (~ 1-20 mcM).

içerik "LCNP platformuna> Burada, yaklaşımdır kullanımı, DIO. DIO için bir iletim aracı olarak olan iç kısım tam olarak hidrofobiktir ve, yüzeyi aynı zamanda, hidrofilik ve bioconjugation için uygun olan bir çok fonksiyonlu NP, sentez esnasında LCNP çekirdek içine dahil edilen ve NP yüzey daha sonra plazma zarına DIO-LCNP topluluğu zar bağlanmasını teşvik etmek için PEG'lenmiş kolesterol yarımı ile işlevlendirilmektedir. Bu yaklaşım daha fazla doğruluk ve membran ikamet plazma zarına DIO paylaştırıldı bir salma sistemi ile sonuçlanmıştır Dio serbest bir şekilde ana çözeltiye teslim kereden (DIO _serbest). Ayrıca, bu yöntemle Dio LCNP aracılı teslim edilmesini düzenleyen ve lipofilik plazma zarı ikili katmanı içine boyanın özel bir bölme oranını teşvik ettiği görülmüştür. Bu, eş zamanlı bir LCNP formülasyonu olarak sunarak% 40 ~ tarafından serbest ilacın sitotoksisite düşürürken elde etti.

tarifnamede tarif edilen yöntem işin içindeki ya da çok az çözülebilen veya sulu bir çözelti içinde tamamen çözülmez olan oldukça hidrofobik yüklerin hücresel gönderilmesini gerektirir araştırmacılar için güçlü bir izin tekniği olacağı tahmin edilmektedir.

Protokol

Dio-LCNP ve Dio-LCNP-PEG-Chol 1. Hazırlık

1. sıvı kristalin diakrilat çapraz bağlama maddesi (DACTP11, 45 mg) içinde çözülür, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO, 2 mg) ve 2 ml kloroform içinde polimerizasyonu için bir serbest radikal başlatıcı (azobisizobütironitril, 1 mg) eklenmiştir. akrilat işlevselleştirilmiş yüzey aktif maddenin bir sulu çözelti (AC10COONa, 7 ml, 13 mg), bu ekleyin.
2. su içinde polimerize yüzey ile çevrili bir organik malzemenin küçük damlacıklar içeren bir miniemulsion üretilmesi için 5 dakika için% 80 genlik de 1 saat süreyle karışımın sonikasyon karıştırın.
3. Bir yağ banyosu içinde 64 ° C'ye ısıtın karışımı Kloroform yavaş yüzey aktif madde ile stabilize edilmiş olan bir DIO-ihtiva eden NP süspansiyon bırakarak buharlaştıkça çapraz bağlama maddesi ve yüzey aktif madde hem de polimerizasyonunu başlatmak için.
4. bir toplama ayrılması için bir 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir NP süspansiyon (3 kez) filtre. Stosonraki kullanıma kadar 4 ° C sıcaklıkta filtre edildi NP çözelti yeniden.
5. EDC bağlantı yoluyla Dio-LCNP PEG-Chol çekimi.
   1. _Kol-PEG-NH2 çözülür · 25 mM HEPES tampon maddesi (pH 7.0) içerisinde HCI (PEG-kol, 0.9 mM).
   2. N-hidroksi-sülfosukkinimid sodyum tuzu (NHSS, 40 mM) ve konsantre stok çözeltilerinden HEPES tampon maddesi içinde 1-etil-3- (3- (dimetilamino) -propil) karbodiimid hidroklorür (EDC, 400 mM) ihtiva eden bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
   3. Hemen HEPES tamponunda DIO-LCNP ve 1.0 ml NHSS / EDC yeni hazırlanmış çalışma çözeltisinin 20 ul ekle ve 5 dakika karıştırın.
   4. Bu karışıma, _kol-PEG-NH2 HCI stok çözeltisi 20 ul ilave edin ve 2 saat karıştırın.
   5. Kısaca, bir masa üstü santrifüj kullanılarak küçük ile dengelenmiş bir PD-10 ebat eksklüzyon kromatografi kolonundan ¹³ süpernatanın geçen 30 saniye için maksimum hızda (~ 2.000 x g), reaksiyon karışımı santrifüjDulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS, 0.1X).

Dio-LCNP ve Dio-LCNP-PEG-Chol 2. Karakterizasyonu

1. Jel elektroforezi ile Dio-LCNP yüzeye PEG-Chol başarılı kovalent çekimlerini onaylayın.
   1. (; 89 mM Tris (pH 7.6), 89 mM borik asit, 2 mM EDTA, TBE) tampon maddesi 50 tris-borat elektroforezinin ml (1 x) 'de agaroz 0.5 g çözündürülür. agaroz çözmek için bir mikrodalga fırında çözüm ısıtın. Çözelti biraz soğumasını ve elektroforez kutusuna bir jel tabakası içine içeriğini dökün izin verin. numune kuyuları oluşturmak için bir jel tarağı yerleştirin.
   2. Jel katılaşmış sonra, bölmeye çalışan tampon TBE içinde (bölme jel daldırın kadar) gerekli miktarda ilave edin.
   3. DIO-LCNP örnek 35 ul ekle jel oyuklarına 110 V'luk bir gerilim 20 dakika boyunca çalışması (% 5 hacim / hacim gliserol ile değişik)
   4. Görüntü jel görüntüleme sistemi wi kullanarak jelinci uyarılma ve radyasyon filtreleri, sırasıyla 488 nm ve 500-550 nm'de.
2. PBS içinde DIO-LCNP çözeltisi (~ 200-kat seyreltme) (pH-8, 0.1X) seyreltilmesi ve DLS cihazının ¹⁴ ölçüm dinamik ışık saçılımı (DLS) ile partikül ebadı ve dağılımı değerlendirilmesi. Uygun bir zeta potansiyeli ölçüm aleti kullanılarak Dio-LCNPs zeta-potansiyelini ölçün.

Teslim Deney ve Görüntüleme Hücre Kültürü Yemekleri 3. hazırlanması

Not: DIO-LCNP markalama daha önce tarif edildiği gibi ⁴ kültürlenir HEK 293T (geçitler 5 ile 15 arasında) / 17, insan embriyonik böbrek hücreleri üzerinde gerçekleştirilir. aktarma deneyleri ve aşağıda tarif edildiği gibi daha sonra hücre görüntüleme gerçekleştirin.

1. 20 ug konsantrasyonunda ~ sığır fibronektin (ile kaplanarak 100 ul (14 mm No 1 coverglass uçlar ile donatılmış) 35 mm çapında bir doku kültür tabakları hazırlanması37 ° C'de 2 saat boyunca DPBS / ml).
2. kültür çanak fibronektin kaplama çözüm çıkarın. Hasat HEK İlk yıkama T-25 balonuna 293 T1 / 7 hücreleri DPBS 3 ml ve daha sonra tripsin-EDTA (% 0.5 tripsin,% 0.25 EDTA) 2 ml eklenerek hücre tekli-tabakası.
3. ~ 3 dakika için 37 ° C 'de balon inkübe edin. tripsin-EDTA çıkarın ve inkübatör şişeyi geri dönün. Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, tam bir ortamda 4 ml ekleyerek tripsin nötralize şişeye (; DMEM Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal sığır serumu,% 5 sodyum piruvat ve% 5 antibiyotik / antimikotik içeren değiştirilmiş) . hücre sayacında sayarak göre süspansiyon içindeki hücre konsantrasyonunu saptamak.
4. Büyüme ortamı ile yaklaşık 8 x 10 ⁴ hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlayın. Gece boyunca kuluçka makinesi içinde çanak ve kültür hücre süspansiyonu 3 ml ilave edilir Sonraki gün, hücreler,% 70 ortak akışkanlığa olmalıdır ve kullanıma hazır olması gerekir. YeterliHücre yoğunluğu, hücrelerin yüksek oranda sağlam ve etkili bir etiketleme için kritik önem taşır.

4. Hücresel Dio ve Dio-LCNPs teslimi ve Sabit Hücre Görüntüleme

1. Teslimat ortamında Dio, Dio-LCNP ve Dio-LCNP-PEG-Chol 1 ml çözümleri hazırlayın (HEPES-DMEM; DMEM 25 mM HEPES içeren) Dio _ücretsiz ve Dio-LCNPs stok çözümleri seyreltilmesi ile; hücreler üzerindeki inkübasyon için uygun Dio konsantrasyonları (DIO DIO-LCNP şeklinde _serbest veya Dio konsantrasyonu ya da ifade edilir) ~ 1-10 mcM olacaktır.
2. serolojik bir pipet kullanılarak kültür kaplarından büyüme ortamı çıkarın ve hücre tek tabakaları yıkama HEPES-DMEM (her biri 2 ml yıkama) ile iki kez (adım 3). yavaşça ekleme ve yemekler kenarından için / bir pipet kullanarak HEPES-DMEM kaldırarak yıkar gerçekleştirin.
3. Kültür kaplarına merkezine hazırlanan Dio _ücretsiz veya Dio-LCNP teslim çözümleri 0.2 ml ekleyin ve i yemekler dönmekncubator uygun bir zaman süresi (deney ihtiyaçlarına bağlı olarak, tipik olarak 15 ya da 30 dakika) için. Daha uzun inkübasyon süreleri olmayan membranöz alanlarda daha nonspesifik hücresel etiketleme (örneğin, sitosol) ekleyin.
4. Kuluçka döneminden sonra, serolojik bir pipet kullanarak dağıtım çözümleri çıkarın. DPBS (2 ml her yıkama) ile hücre tekli iki kez yıkayın. yavaşça yemeğin kenarından / 'e DPBS ekleyerek ve çıkararak yıkar gerçekleştirin.
5. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (DPBS hazırlanmıştır)% 4 paraformaldehid kullanılarak hücre mono tabakaları sabitleyin.
   UYARI: Paraformaldehyde yanıcı, bir solunum tahriş ve şüpheli kanserojen.
6. bir pipet kullanılarak paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve yavaşça eklenmesi ve yemekler kenarı için / pipet kullanılarak DPBS kaldırarak hücreler DPBS ile 1 kez (2 mi) yıkayın.
7. Sabitlenen hücreler konfokal lazer tarama kullanılarak bir zar floresans sinyalinin varlığı için görüntülenmek üzere hazırmikroskobu (CLSM). Görüntülemeden hemen önce gerçekleştirmek ya da seçenek olarak, _NaN3,% 0.05 ihtiva eden DPBS orta yerine ve 4 ° C'de yemekler saklayın.
   DİKKAT: _NaN3 zehirlidir; NaN ₃ kullanırken çok dikkatli.
   NOT: Bu şekilde depolanan sabit numuneler en iyi sonuçlar için 48 saat içinde görüntülü olmalıdır.

Canlı hücreler Dio ve Dio-LCNPs ve FRET Görüntüleme 5. Hücresel Teslimat

NOT: Bu yöntemde, hücreler 6 uM (DIO FRET donör) her bir DIO-LCNP-PEG-kol ve 1,1'-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DII ile colabeled edilir _ücretsiz DII) FRET alıcı olduğu. plazma zarı içine Dio-LCNP-PEG-Chol ve kurulduğu gelen Dio salınımı DII alıcısı için Dio donörden enerji transferi gözlenen artış ile teyit edilir.

1. Dio-LCNP-PEG-Chol ve DII _fre ile sırayla etiket hücrelerie aşama 4'te tarif edilen yöntem kullanılarak.
2. Boyama işleminden sonra hücreler DPBS ile 1 kez (2 mi) bir serolojik bir pipet kullanarak yıkama ve canlı hücre görüntüleme çözeltisi, 2 ml (LCIS) ile yıkama tamponu değiştirin.
3. ısıtılmış bir kuluçka odasına, resim tam emisyon 488 nm heyecanlı Dio donör tarafından 4 saatlik bir süre boyunca 30 dakika aralıklarla bir FRET görüntüleme yapılandırma ile bir konfokal mikroskop (60X objektif) kullanılarak ve toplama canlı hücre örneği ile donatılmış bir mikroskop sahnede Dio donör ve 32 kanallı spektral dedektörü ile 490-700 nm DII alıcısı hem spektrumları.
4. NOT: FRET görüntüleme hakkında daha fazla bilgi için, ¹⁵ başvuru bakın.
5. Dio donör ve Dio-LCNP-PEG-Chol ve DII ile boyanmış hücrelerden DII alıcısı hem zamana bağımlı emisyon yoğunluğunu belirler. Zamana bağımlı alıcı / verici giderek artacak oranını görüntüler için (DII _emi / DIO _emi), ve sonunda plaka FRET hesaplamakau membran içine bölümlenmiş Dio donör miktarı bir kez maksimum ¹⁶ ulaşmıştır.

6. Dio Sitotoksisitenin Deneyi ve Dio-LCNPs HEK 293T / 17 Hücreleri

Not: DIO-LCNP malzeme sitotoksisite bir tetrazolyum boya bazlı proliferasyon analizi ¹⁷ kullanılarak tayin edilir. Hücreler, dağıtım / etiketleme taklit koşulları altında malzemelerin değişen konsantrasyonlarının varlığında, çok oyuklu bir plaka içerisinde kültürlenir. Hücreler daha sonra çoğalması için izin 72 saat boyunca kültürlenir. Bir boya (MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-karboksimetoksifenil) -2- (4-sülfofenil) -2H-tetrazolyum) daha sonra oyuklara ilave edildi ve metabolik olarak aktif olan hücreler mavi formazan ürüne boya dönüştürün. renk oluşumu miktarı canlı hücre sayısı ile doğru orantılıdır.

1. Hasat HEK aşama 3.2.Seed tarif edilen prosedür takip edilerek, T-25 balonuna 293 T1 / 7 hücreleri24 saat için 96-yuvalı doku kültürü ile muamele edilmiş levha ve kültür çukurlarına HEK 293T / 17 hücreleri (/ 100 ul / oyuk 5.000 hücre).
2. Tamamen _ücretsiz dio içeren HEPES-DMEM 50 ul bir mikropipet kullanarak kuyulardan kültür ortamı çıkarın ve ekleyin, kuyu çoğaltmak Artan konsantrasyonlarda DIO-LCNPs veya Dio-LCNP-PEG-Chol. 30 dakika boyunca, 37 ° C'de hücreler üzerinde inkübe edin.
   Not: Genellikle, üç kopya ya da dört yapılan çoğaltır istatistiksel güvenilir veri elde etmek için yeterlidir.
   1. İnkübasyondan sonra, bir mikropipet kullanılarak malzemeler ihtiva eden dağıtım orta kaldırmak ve büyüme ortamında 100 ul ile değiştirin. Kültür 72 saat boyunca hücre.
3. Her bir oyuğa tetrazolyum alt-tabaka 20 ul ekle inkübatör plaka dönüş ve renk oluşumu 4 saat 37 ° C'de ilerlemesine izin. 570 nm (bu stu kullanılan Dio-LCNPs için emme minimada formazan ürünün absorbansı (abs) Okudy) ve spesifik olmayan arka plan emmesinin çıkartma için 650 nm () bir mikrotitre plaka okuyucusu kullanılarak.
4. Ayırıcı emme değeri (ABS ₅₇₀ - ABS ₆₅₀₎ Konu malzeme konsantrasyonuna karşı ve kontrol hücre çoğalması (hücre kültür ortamı, yalnızca hücrelerin proliferasyonunun derecesi) yüzdesi olarak sonuçları şu şekildedir.

7. Veri analizi

1. İstatistiksel varyansın tek değişkenli analizi (ANOVA) ile verileri analiz. çoklu karşılaştırmalar için, Bonferroni post hoc testi uygulayın. ortalama ± standart hata olarak belirtilmiştir (SEM) gibi tüm ortalama değerler sağlamak.
   NOT: anlamlılık için kabul edilebilir olasılık p <0.05 idi.

Sonuçlar

LCNPs olan NP hidrofobik merkez hidrofobik yükler için etkili bir taşıma aracı olarak LCNP yararını göstermek için temsili bir zar markalama probu ile yüklenmiştir hazırlanmıştır. Bu amaç için, seçilen kargo yüksek ölçüde suda çözünür olmayan potansiyometrik membran etiketleme boya dio idi. Şekil 1 ila ¹⁸ 'de gösterildiği gibi, DIO-yüklü LCNPs (DIO-LCNPs), kimyasal bileşenleri DACTP11, AC10COONa ve Dio iki fazlı bir mini emül...

Tartışmalar

NMDD bir sürekli amacı aynı anda geliştirilmiş ilaç etkinliği ile kombine kontrol hedefleme ve hücre ve dokulara ilaç formülasyonlarının içerisinden dağıtım olmaktadır. Bu önemli bir sorun teşkil ettiği için ilaç moleküllerinin belirli bir sınıf sulu ortamda hiçbir çözünürlüğüne idareli sahip hidrofobik ilaçlar / görüntüleme ajanları olduğunu. Bu sorun, klinik ortamda in vitro hücre kültür sistemleri ile ilgili potansiyel ilaçların geçişi saran ve "raf...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)	ThermoFisher	E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)	Sigma Aldrich	D4292-20MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride	Nanocs, Inc.	PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter	ThermoFisher	C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher	14040182	Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma	ThermoFisher	33010018	Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V)	ThermoFisher	28906	Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)	American Type Culture Collection	ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS)	ThermoFisher	A14291DJ	Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS)	ThermoFisher	24510
Nikon A1si spectral confocal microscope	Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)	ThermoFisher	T10282	mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor	Sonics and Materials Inc	GEX 600-5
Mini Cetntrifuge	Benchmark	Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium	GE Healthcare	17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System	Bio-RAD	76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056