Целенаправленное плазматической мембраны Поставка гидрофобной Cargo инкапсулированы в жидком кристалле наночастицы Carrier

Резюме

Жидкокристаллический наночастицами (LCNP) nanocarrier эксплуатируется в качестве носителя для контролируемой доставки гидрофобного груза к плазматической мембране живых клеток.

Аннотация

Контролируемая поставка агентов лекарственного средства / визуализации для клеток имеет решающее значение для развития терапевтических средств и для изучения процессов клеточной сигнализации. В последнее время наночастицы (NPS) показали значительные перспективы в развитии таких систем доставки. Здесь жидкокристаллическая НП (LCNP) система доставки основанное была использована для контролируемой доставки нерастворимого в воде краситель, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO), внутри ядра НП в гидрофобной области плазмы мембранный бислой. Во время синтеза наночастиц, краситель эффективно включен в гидрофобное ядро ​​LCNP, как это было подтверждено с несколькими спектроскопических анализов. Конъюгирование производное холестерина пегилированного к поверхности NP (DIO-LCNP-ПЭГ-Хол) позволило связывание красителя загруженным NPs к плазматической мембране в клетках НЕК 293T / 17. Времяразрешенная лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) томография подтвердила пропускив оттоку Диу из ядра LCNP и его введения в плазму мембранный бислой. И, наконец, поставка DiO как LCNP-PEG-Чхоль ослабляется цитотоксичность DiO; НП форма DiO выставлены ~ 30-40% меньшую токсичность по сравнению с DiO _{свободным} избавлены от массы раствора. Такой подход демонстрирует полезность LCNP платформы в качестве эффективного механизма для доставки мембраны специфических и модуляции гидрофобных молекул грузах.

Введение

С момента появления взаимодействия наноматериалов (материалов ≤ 100 нм, по меньшей мере, в одном измерении) с живыми клетками, постоянная цель состояла в том, чтобы воспользоваться уникальными размерами зависящих от свойств наночастиц (NPS) для различных областей применения. Эти приложения включают клеток и тканей маркировки / обработки изображений (как в пробирке и в естественных условиях), в режиме реального времени зондирования, и контролируемой доставки лекарств и других грузов ^1. Примерами таких соответствующих свойств NP включают в себя зависящее от размера эмиссии полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек, квантовых точек); в фототермические свойства наночастиц золота; большая несущая способность водной сердцевины липосом; и баллистическая проводимость углерода аллотропов, такие как одностенных углеродных нанотрубок и графена.

В последнее время значительный интерес возник в использовании NPs для контролируемой модуляции лекарственных средств и других грузов, таких как контраст / построения изображенияджентльмены. Здесь суть заключается в существенно повысить / оптимизировать общую растворимость, обеспеченную дозу, время циркуляции, и в конечном итоге оформление груза наркотиков, поставляя его в качестве препарата NP. Это стало известно как NP-опосредованной доставки лекарств (NMDD), и в настоящее время имеется семь FDA утвержденных лекарственные NP для использования в клинике для лечения различных видов рака и сотни больше на различных стадиях клинических испытаний. По сути, цель состоит в том, чтобы "достичь большего с меньшими затратами;" то есть, чтобы использовать NP как строительные леса , чтобы доставить больше лекарства с меньшим количеством дозирующих администраций, пользуясь большой площади поверхности: объем (например, твердые частицы, такие как КТ и оксидов металлов) ЯЭУ или их большой внутренний объем для загрузки большие грузовые полезных нагрузок (например, липосомы или мицеллы). Целью здесь является снижение необходимости в нескольких системно доставленных режимов дозирования в то время как в то же время продвижения водной стабильности и улучшения циркуляции, в частности, длясложные гидрофобные грузов наркотиков, что, в то время как высокоэффективна, плохо растворимы в водных средах.

Таким образом, цель работы, описанной здесь в том, чтобы определить жизнеспособность с помощью нового NP помост для специфической и контролируемой доставки гидрофобных грузов к липофильной плазматической мембраны бислой. Мотивация для работы была присуща ограниченная растворимость и трудности в доставке гидрофобных молекул в клетки из водной среды. Как правило, доставка таких гидрофобных молекул требует использования органических растворителей (например, ДМСО) или амфифильных поверхностно -активных веществ (например, полоксамеры), которые могут быть токсичными и компромиссом клеток и тканей жизнеспособность ² или мицеллы носители, которые могут иметь ограниченную внутреннюю нагрузку производственные мощности. NP - носитель выбран здесь был роман жидкокристаллический NP (LCNP) препарат разработан ранее ³ и что было показано ранее для достижения ~ 40 раз Улучшение эффективности противоопухолевого препарата доксорубицина в культивируемых клетках ^4.

В работе, описанной в данном документе, представитель грузовой выбранный был потенциометрического мембранного красителя, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO). DiO представляет собой нерастворимый в воде краситель , который использовался для Антероградный и ретроградной трассировку в живых и фиксированных нейронах, мембранного потенциала измерений, а также для общей мембраны маркировки ^{5, 6, 7, 8, 9.} Благодаря своей гидрофобной природы, DIO , как правило , добавляют непосредственно к монослоев клеток или тканей , в кристаллической форме ^10, или его инкубируют при очень высоких концентрациях (~ 1-20 мкМ) после разбавления от концентрации исходного раствора ^{11, 12.}

Содержание "> Здесь подход был применение к LCNP платформе, многофункциональная НП которого внутреннее ядро ​​полностью гидрофобными и поверхность которого одновременно гидрофильными и поддается биоконъюгации, как средство доставки для DiO. DiO встроен в ядро ​​LCNP в процессе синтеза , а поверхность НП затем функционализированные с холестерином фрагментом пегилированного для продвижения мембраны связывания с DIO-LCNP ансамбля к плазматической мембране. Такой подход привел к системе доставки, которая размечены DIO в плазматической мембране с большей точностью и мембранным жительства времени , чем свободная форма Диу избавлены от массы раствора (DIO _{бесплатно).} кроме того, этот метод показал , что LCNP-опосредованной доставки Диу существенно модулирует и гонит скорость конкретного разделения красителя в липофильной плазматической мембраны бислой. Это достигается при одновременном снижении цитотоксичность свободного препарата на ~ 40%, обеспечивая его в качестве препарата LCNP.

Предполагается, что методология, описанная здесь, будет мощным позволяет технику для исследователей, работа которых связана или требует сотовой доставки сильно гидрофобного грузов, которые плохо растворимы или полностью не растворяется в водном растворе.

протокол

1. Получение DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль

1. Разведите жидкий кристаллический диакрилат сшивающий агент (DACTP11, 45 мг), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO, 2 мг), и инициатор свободных радикалов (азобисизобутиронитрил, 1 мг) в течение полимеризации в 2 мл хлороформа. Добавьте к этому водному раствору акрилата-функционализированного поверхностно-активного вещества (AC10COONa, 13 мг в 7 мл).
2. Смесь перемешивают в течение 1 ч и гомогенат, при амплитуде 80% в течение 5 мин для получения miniemulsion, состоящий из мелких капель органического материала, окруженного полимеризуемого поверхностно-активного вещества в воде.
3. Нагревают смесь до 64 ° C на масляной бане в чтобы инициировать полимеризацию как сшивающего агента и поверхностно-активного вещества, как хлороформ медленно испаряется, оставляя DIO-содержащий NP подвеску, которая стабилизирована поверхностно-активным веществом.
4. Суспензию фильтруют NP (3 раза) через шприц-фильтр 0,2 мкм для удаления какой-либо агрегации. Stoповторно отфильтрованного раствора NP при 4 ° С до дальнейшего использования.
5. Конъюгирование PEG-Чхоль к DIO-LCNP через EDC муфты.
   1. Растворите _{Чхоль-ПЭГ-NH2} & bull ; HCl (ПЭГ-Хол, 0,9 мМ) в 25 мМ HEPES - буфера (рН 7,0).
   2. Приготовить рабочий раствор , содержащий N - гидрокси-sulfosuccinimide натриевой соли (НГС, 40 мМ) и 1-этил-3- (3- (диметиламино) пропил) карбодиимида (EDC, 400 мМ) в буфере HEPES от концентрированных маточных растворов.
   3. Немедленно добавьте 20 мкл свежеприготовленного рабочего раствора НГС / EDC до 1,0 мл DIO-LCNP в буфере HEPES и перемешивают в течение 5 мин.
   4. Добавьте 20 мкл исходного раствора Хол-ПЭГ-NH ₂ · HCl , к этой смеси и перемешивают в течение 2 часов.
   5. Кратко центрифугировать реакционную смесь при максимальной скорости (~ 2000 XG) в течение 30 сек с помощью столообразного мини центрифугу и передать супернатант через PD-10 , размер колонки гель -проникающей хроматографии , уравновешенной ¹³Дульбекко фосфатный буферный солевой раствор (DPBS, 0,1 x).

2. Характеристика DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль

1. Подтвердите успешную ковалентной конъюгации ПЭГ-Чхоль к поверхности DIO-LCNP с помощью гель - электрофореза.
   1. Растворить 0,5 г агарозы в 50 мл (1x) трис-борат-электрофореза (КЭ; 89 мМ Трис (рН 7,6), 89 мМ борной кислоты и 2 мМ ЭДТА) буфере. Раствор нагревают в микроволновой печи для растворения агарозы. Дайте раствору немного остыть и вылить содержимое в гелевой пластине в поле электрофорез. Вставьте гель гребень для создания образцов скважин.
   2. После того, как гель затвердеет, добавьте необходимое количество (достаточно, чтобы погрузить гель в камере) КЭ рабочего буфера в камеру.
   3. Добавьте 35 мкл DIO-LCNP образца (с поправками с глицерином, 5% об / об) в лунки геля и работать в течение 20 мин при напряжении 110 В.
   4. Изображение геля с использованием системы визуализации геля Wiго возбуждения и эмиссии фильтров при длине волны 488 нм и 500-550 нм соответственно.
2. Оценить размер частиц и распределение с помощью динамического рассеяния света (DLS) путем разбавления DIO-LCNP раствор (~ 200-кратное разведение) в PBS (рН ~ 8, 0.1x) и измерения на DLS инструмента ^14. Мера дзета-потенциал DIO-LCNPs с помощью соответствующего дзета-потенциала, измерительный прибор.

3. Получение клеточных культуральных чашках для экспериментов Доставка и обработка изображений

Примечание: маркировка DIO-LCNP выполняется на НЕК 293T / 17 эмбриональные клетки почки человека (между проходами 5 и 15), которые культивировали , как описано ранее ^4. Выполните эксперименты доставки и последующую ячейки изображения, как описано ниже.

1. Готовят 35 мм чашках культуры ткани диаметром (оснащенную 14 мм № 1 покровного стекла вкладышами) путем нанесения на них с бычьим фибронектином (~ 100 мкл при концентрации 20 мкг/ Мл) в DPBS в течение еще 2 ч при 37 ° С.
2. Удалите раствор фибронектина покрытия от культуральной чашки. Урожай НЕК 293 Т1 / 7 клеток, отобранных из Т-25 колбы первой промывки монослой клеток с 3 мл ДЗФР и затем путем добавления 2 мл трипсин-ЭДТА (0,5% трипсина-0,25% ЭДТА).
3. Выдержите в колбу при температуре 37 ° С в течение ~ 3 мин. Удалите трипсин-ЭДТА и возвращают колбу в инкубаторе. После того, как клетки отделяют от колбы, нейтрализовать трипсина путем добавления 4 мл полной среды (среда Игла в модификации Дульбекко; DMEM; внесены поправки содержат 10% фетальной бычьей сыворотки, 5% пирувата натрия и 5% антибиотик / противогрибковым) в колбу , Определить концентрацию клеток в суспензии путем подсчета их в счетчике клеток.
4. Отрегулируйте концентрацию клеток до ~ 8 × 10 ⁴ клеток / мл среды роста. Добавьте 3 мл суспензии клеток к блюду и культуры в инкубаторе в течение ночи; На следующий день, клетки должны быть ~ 70% сплошности и должен быть готов к использованию. адекватныйплотность клеток имеет решающее значение для надежной и эффективной маркировки высоким процентом клеток.

4. Клеточная Поставка Дио и DIO-LCNPs и визуализации фиксированных клеток

1. Подготовить 1 мл растворов Dio, DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль в доставочной среде (HEPES-DMEM; DMEM , содержащей 25 мМ HEPES) путем разбавления исходных растворов Диу _{свободной} и DIO-LCNPs; соответствующие концентрации DIO для инкубации на клетках будет ~ 1-10 мкМ (выраженное в любой концентрации Диу _{свободной} или DiO в виде DIO-LCNP).
2. Удалите среду для роста из чашек для культивирования с использованием серологических пипетки и промыть монослоев клеток (см шаг 3) два раза HEPES-DMEM (2 мл каждого мытья). Выполните промывок, осторожно добавляя и удаляя HEPES-DMEM с помощью пипетки к / от края посуды.
3. Добавить 0,2 мл приготовленных растворов Dio _{бесплатно} или DIO-LCNP доставки в центре блюда культуры и возвращают блюда в Incubator в течение соответствующего периода времени (как правило, 15 или 30 мин, в зависимости от потребностей эксперимента). Более длительное время инкубации добавить к более неспецифической клеточной маркировки не-мембранными областей (например, цитозольных).
4. После периода инкубации, удалите растворы доставки с помощью серологических пипетки. Промыть клеточные монослои два раза с ДЗФР (2 мл каждой промывки). Выполните промывок, осторожно добавляя и удаляя DPBS к / от края тарелки.
5. Закрепить монослоев клеток с использованием 4% параформальдегида (полученного в ДЗФР) в течение 15 мин при комнатной температуре.
   ВНИМАНИЕ: параформальдегид является горючим, раздражает дыхательные и канцероген.
6. Удалите раствор параформальдегида с помощью пипетки и осторожно промыть клетки 1 раз с ДЗФР (2 мл), добавляя и удаляя DPBS с помощью пипетки / от края посуды.
7. Фиксированные клетки готовы быть отображены на наличие мембранном флуоресцентного сигнала с помощью конфокальной лазерной сканирующеймикроскопии (CLSM). Выполнить визуализацию немедленно или, в качестве альтернативы, замените носитель с ДЗФР , содержащим 0,05% NaN ₃ и хранить посуду при температуре 4 ° С.
   ВНИМАНИЕ: NaN ₃ является токсичным; проявлять крайнюю осторожность при использовании NaN _3.
   Примечание: Фиксированные образцы, хранящиеся таким образом, должны быть отображены в течение 48 часов для достижения оптимальных результатов.

5. Клеточная Поставка Дио и DIO-LCNPs и FRET изображений в живых клетках

Примечание: В этом методе клетки colabeled с 6 мкМ каждого DIO-LCNP-ПЭГ-ХОЛ (где DiO является донором FRET) и 1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (DII _{свободный,} где DiI является FRET акцептором). Освобождение DiO от DIO-LCNP-PEG-Чхоль и его включения в мембрану плазмы подтверждается наблюдаемым увеличением передачи энергии от донора к DiO DiI акцептора.

1. Этикетка клетки последовательно с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI _Freе используя метод , описанный на этапе 4.
2. После окрашивания промыть клетки 1 раз с ДЗФР (2 мл) с использованием серологических пипетки и замените промывочный буфер с 2 мл раствора изображений живых клеток (LCIS).
3. На стадии микроскопа, снабженного инкубационной камеры с подогревом, изображение образце живой клетки с помощью конфокальной микроскопии (60X цель) с конфигурацией FRET изображений с интервалом в 30 мин в течение 4 ч при возбуждении донора DiO при длине волны 488 нм и собирают полный выброс спектры как донора DiO и DiI акцептора от 490-700 нм с 32-канального детектора спектральной.
4. Примечание: Для получения дополнительной информации о визуализации FRET см ссылке ^15.
5. Определить с временным разрешением интенсивности излучения как донора DiO и DiI акцептора из клеток, окрашенных с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI. Рассчитайте с временным разрешением акцептор / донор FRET соотношение (DiI _ЭМИ / DiO _ЭМП) для изображений, который будет неуклонно возрастать и в конце концов пластиныAu раз сумму DiO донора разбито на мембрану достигла максимального ^16.

6. цитотоксичности Диу и DIO-LCNPs к НЕК 293T / 17 клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Цитотоксичность материалов DIO-LCNP оценивается с использованием анализа ¹⁷ пролиферации тетразолиевую на основе красителя. Клетки культивируют в многоямного пластины в присутствии различных концентраций веществ в условиях, которые имитируют доставки / маркировки. Клетки затем культивировали в течение 72 ч, чтобы обеспечить пролиферации. Краситель (МТС, (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолия) затем добавляют в лунки, и метаболически активными клетки превращают краситель в синий формазана. количество образуемого цвета прямо пропорционально числу жизнеспособных клеток.

1. Урожай НЕК 293 Т1 / 7 клеток, отобранных из Т-25 колбы, следуя процедуре, описанной в стадии 3.2.SeedНЕК 293T 17 клеток / (5000 клеток / 100 мкл / лунку) в лунки для культуры ткани обработанной пластины 96-луночного и культуры в течение 24 часов.
2. Полное удаление культуральной среды из скважин с помощью микропипетки и добавить 50 мкл HEPES-DMEM , содержащие Dio _{бесплатно,} DIO-LCNPs или DIO-LCNP-PEG-Чхоль при увеличении концентрации реплицировать скважин. Инкубируют на клетки при 37 ° С в течение 30 мин.
   Примечание: Как правило, реплицируется сделано в трех экземплярах или четырех повторностях достаточны для получения статистически достоверных данных.
   1. После инкубации удалите среду доставки, содержащей материалы, используя микропипетку и заменить его на 100 мкл ростовой среды. Культуры клеток в течение 72 ч.
3. Добавьте 20 мкл тетразолия субстрата в каждую лунку, вернуть пластину в инкубаторе, и позволить образование цвета протекать при температуре 37 ° С в течение 4 часов. Измерить оптическую плотность (ABS) формазана продукта при 570 нм (поглощение минимумов для DIO-LCNPs, используемых в этом СТЮду) и 650 нм (для вычитания неспецифического фона оптической плотности) с использованием ридере.
4. Участок значение дифференциальной оптической плотности (ABS ₅₇₀ - ABS ₆₅₀₎ в зависимости от материала концентрации и сообщить о результатах в процентах пролиферации клеток (контроль степени пролиферации клеток в среде для культивирования клеток только).

7. Анализ данных

1. Статистически анализировать данные с однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для множественных сравнений, применяются после испытания специальной в Бонферрони. Обеспечить все средние значения, как ± стандартная ошибка среднего (SEM), если не указано иное.
   Примечание: Приемлемая вероятность значение имело р <0,05.

Результаты

LCNPs были подготовлены, в котором был загружен гидрофобное ядро ​​NP с репрезентативной мембраной мечения зонда, чтобы продемонстрировать полезность LCNP как эффективное средство доставки для гидрофобных грузов. С этой целью груз был выбран весьма растворимым в воде потенциометрически?...

Обсуждение

Продолжающееся цель NMDD является контролируемое нацеливание и доставку лекарственных средств для клеток и тканей, в сочетании с одновременным улучшением эффективности лекарственного средства. Один конкретный класс молекул лекарственного средства, для которых это представляет серье...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)	ThermoFisher	E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)	Sigma Aldrich	D4292-20MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride	Nanocs, Inc.	PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter	ThermoFisher	C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher	14040182	Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma	ThermoFisher	33010018	Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V)	ThermoFisher	28906	Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)	American Type Culture Collection	ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS)	ThermoFisher	A14291DJ	Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS)	ThermoFisher	24510
Nikon A1si spectral confocal microscope	Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)	ThermoFisher	T10282	mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor	Sonics and Materials Inc	GEX 600-5
Mini Cetntrifuge	Benchmark	Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium	GE Healthcare	17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System	Bio-RAD	76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056