Targeted Plasma Membrane entrega de um hidrofóbica Carga encapsulado em um cristal líquido nanopartículas Transportador

Resumo

Uma nanopartícula cristal líquido (LCNP) nanocarrier é utilizado como um veículo para a libertação controlada de uma carga hidrofóbico à membrana plasmática de células vivas.

Resumo

A entrega controlada de agentes fármaco / imagiologia de células é crucial para o desenvolvimento de agentes terapêuticos e para o estudo de processos de sinalização celular. Recentemente, nanopartículas (PN) mostraram promessa significativa no desenvolvimento de tais sistemas de distribuição. Aqui, um NP (LCNP) sistema de libertação com base na cristal líquido tem sido empregue para a libertação controlada de um corante insolúvel em água, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO), a partir de dentro do núcleo NP para a região hidrofóbica de um plasma bicamada da membrana. Durante a síntese das NPs, o corante foi eficientemente incorporado no núcleo hidrófobo LCNP, tal como foi confirmado por análises espectroscópicas múltiplas. A conjugação de um derivado de colesterol PEGuilado para a superfície da NP (DIO-LCNP-PEG-Chol) permitiu a ligação das NPs carregadas com corante para a membrana plasmática em células HEK 293T / 17. a laser microscopia confocal e Förster transferência de energia por ressonância resolvida no tempo (FRET) imaging confirmou a passagemive efluxo de DiO a partir do núcleo LCNP e sua inserção na bicamada da membrana do plasma. Finalmente, a entrega de DiO como um LCNP-PEG-Chol atenuou a citotoxicidade de DiO; a forma NP da OID exibiu ~ 30-40% menor toxicidade em comparação com Dio _livre entregues a partir de solução em massa. Esta abordagem demonstra a utilidade da plataforma LCNP como uma modalidade eficaz para a entrega específica à membrana e modulação de cargas moleculares hidrofóbicas.

Introdução

Desde o advento da interface (nanomateriais materiais ≤100 nm de, pelo menos, uma dimensão) com as células vivas, um objectivo contínuo tem sido a de tirar partido das propriedades únicas dependente do tamanho das nanopartículas (NPS) para várias aplicações. Estas aplicações incluem células e tecidos rotulagem / imagiologia (tanto in vitro como in vivo), a detecção em tempo real, e a libertação controlada de drogas e de outras cargas ^1. Exemplos de tais propriedades relevantes NP incluem a emissão dependente do tamanho dos nanocristais semicondutores (quantum dots, QDs); as propriedades fototérmicos de nanopartículas de ouro; a grande capacidade de carga do núcleo aquoso de lipossomas; e a condutividade balístico de formas alotrópicas de carbono, tais como os nanotubos de carbono de parede única e grafeno.

Mais recentemente, tem surgido um interesse significativo na utilização de NPS para a modulação controlada de drogas e de outras cargas, tais como o contraste / imagiologia umsenhores. Aqui, a lógica é aumentar / otimizar a solubilidade global, dose administrada, o tempo de circulação, e eventual apuramento da carga de drogas por entregá-lo como uma formulação NP significativamente. Isto veio a ser conhecido como a entrega de drogas NP-mediada (NMDD), e existem actualmente sete formulações de drogas NP aprovados pela FDA para uso na clínica para tratar vários tipos de câncer e outras centenas em várias fases de ensaios clínicos. Em essência, o objectivo é o de "conseguir mais com menos;" isto é, para usar o NP como um andaime para fornecer mais fármaco com menos administrações de dosagem, tirando partido da grande área superficial: volume (por exemplo, partículas duras, tais como QDs e óxidos de metal) de PN ou ao seu grande volume interior para o carregamento grandes cargas de carga (por exemplo, lipossomas ou micelas). O objectivo aqui é reduzir a necessidade de múltiplos regimes de dosagem entregues sistemicamente e, ao mesmo tempo que promove a estabilidade aquosa e melhorada a circulação, em particular paracargas de drogas hidrofóbicas desafiantes que, embora altamente eficaz, são pouco solúveis em meios aquosos.

Assim, o objectivo do trabalho aqui descrito foi o de determinar a viabilidade de utilização de um novo NP andaime para a entrega controlada e específica de cargas hidrofóbicas na bicamada de membrana plasmática lipofílico. A motivação para o trabalho foi a solubilidade limitada inerente e dificuldade na entrega de moléculas hidrofóbicas para as células a partir de meios aquosos. Tipicamente, o fornecimento de tais moléculas hidrofóbicas requer o uso de solventes orgânicos (por exemplo, DMSO) ou agentes tensioactivos anfifílicos (por exemplo, poloxâmeros), que pode ser celular e do tecido viabilidade tóxico e compromisso ^2, ou transportadores de micelas, o qual pode ter limitados carga interna capacidades. O transportador escolhido NP aqui era um cristal líquido NP (LCNP) nova formulação desenvolvida anteriormente ³ e que tinha sido mostrado anteriormente para conseguir um ~ 40 vezes maior melhoria na eficácia do fármaco anticancro doxorrubicina em células de cultura ^4.

No trabalho aqui descrito, a carga representativo seleccionado foi o corante membrana potenciométrica, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO). DiO é um corante insolúvel em água que tem sido utilizado para anterógrada e rastreamento retrógrado em vida e neurônios fixos, membrana medidas de potencial, e por membrana geral rotulagem ^{5, 6, 7, 8, 9.} Devido à sua natureza hidrofóbica, a DIO é tipicamente adicionado directamente a monocamadas de células ou tecidos numa forma cristalina ^10, ou que é incubada a concentrações muito altas (~ 1-20 uM) após diluição a partir de uma solução de estoque de concentração ^{11, 12.}

conteúdo "> Aqui, a abordagem foi a utilização para a plataforma LCNP, um NP multifuncional cujo núcleo interior é completamente hidrofóbico e cuja superfície é simultaneamente hidrófilo e passíveis de bioconjugação, como um veículo de entrega para DiO. DiO é incorporado no núcleo LCNP durante a síntese , e a superfície de NP é então funcional izado com uma porção de colesterol PEGuilado para promover a ligação do conjunto DIO-LCNP para a membrana do plasma da membrana. Esta abordagem resultou em um sistema de entrega que particionado DIO na membrana de plasma com uma maior fidelidade e residência membrana tempo do que a forma livre do DiO libertos de solução em massa (DiO _livre). Além disso, este método mostrou que o transporte mediado por LCNP de DiO substancialmente modula e dirige a taxa de partição específica do corante na bicamada da membrana do plasma lipofilico. esta é alcançados enquanto reduzindo concomitantemente a citotoxicidade do fármaco livre por ~ 40% por entregá-lo como uma formulação LCNP.

Prevê-se que a metodologia aqui descrita será uma técnica que permite poderosa para os pesquisadores, cujo trabalho envolve ou exige a entrega celular de cargas altamente hidrofóbicos que são pouco solúveis ou completamente insolúvel em solução aquosa.

Protocolo

1. Preparação de DIO-LCNP e DIO-LCNP-PEG-Chol

1. Dissolve-se diacrilato de líquido cristalino agente de reticulação (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DiO, 2 mg), e um iniciador de radical livre (azobisisobutironitrilo, 1 mg) para a polimerização em 2 ml de clorofórmio. Adicionar esta a uma solução aquosa de tensioactivo funcionalizado com acrilato (AC10COONa, 13 mg em 7 ml).
2. Agita-se a mistura durante 1 hora e sonicado a 80% de amplitude, durante 5 min para produzir uma miniemulsão constituído por pequenas gotículas do material orgânico polimerizável rodeado por agente tensioactivo em água.
3. Aquecer a mistura a 64 ° C num banho de óleo para iniciar a polimerização de ambos o agente de reticulação e surfactante como o clorofórmio se evaporar lentamente, deixando uma suspensão contendo NP-DiO que é estabilizado pelo tensioactivo.
4. Filtra-se a suspensão NP (3 vezes) através de um filtro de seringa 0,2 fim para remover qualquer agregação. Store a solução NP filtrado a 4 ° C até uso posterior.
5. Conjugação de PEG-Chol para Dio-LCNP através de acoplamento EDC.
   1. _{Dissolve-Chol-PEG-NH2-HCl} (PEG-Chol, 0,9 mM) em tampão HEPES 25 mM (pH 7,0).
   2. Preparar uma solução de trabalho contendo sal N- -hidroxi-sulfossuccinimida de sódio (NHSs, 40 mM) e 1-etil-3- (3- (dimetilamino) -propil) carbodiimida (EDC, 400 mM) em tampão HEPES a partir de soluções stock concentradas.
   3. Imediatamente adicionar 20 ul da solução de trabalho preparada de fresco de NHSs / EDC, para 1,0 ml de DIO-LCNP em tampão HEPES e agita-se durante 5 min.
   4. Adicionar 20 ul de solução de estoque de _{Chol-PEG-NH2-HCl} a esta mistura e agita-se durante 2 h.
   5. Resumidamente, centrifugar a mistura de reacção à velocidade máxima (~ 2000 x g) durante 30 segundos usando um tampo de mesa e mini-centrifugador passar o sobrenadante através de um PD-10 coluna de cromatografia de exclusão de tamanho ¹³ equilibrada comsolução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS, 0,1X).

2. Caracterização do DIO-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol

1. Confirmar o sucesso a conjugação covalente de PEG-Chol à superfície do DIO-LCNP por electroforese em gel.
   1. Dissolve-se 0,5 g de agarose em 50 ml (1x) de electroforese Tris-borato (TBE; Tris 89 mM (pH 7,6), ácido bórico 89 mM e EDTA 2 mM) tampão. Aquece-se a solução num forno de microondas para dissolver a agarose. Deixe a solução esfriar um pouco e despeje o conteúdo em uma placa de gel na caixa de eletroforese. Insira um pente de gel para criar poços de amostra.
   2. Uma vez que o gel tem solidificado, adicione a quantidade necessária (suficiente para submergir o gel na câmara) de TBE tampão de corrida para a câmara.
   3. Adicionar 35 ul de amostra DIO-LCNP (alterado com glicerol, 5% v / v) para os poços do gel e correr durante 20 min a uma voltagem de 110 V.
   4. Imagem do gel usando um sistema de imagem wi gelfiltros de excitação e emissão de th a 488 nm e 500-550 nm, respectivamente.
2. Avaliar o tamanho de partículas e distribuição por dispersão de luz dinâmica (DLS), diluindo a solução DIO-LCNP (diluição ~ 200 vezes) em PBS (pH ~ 8, 0,1x) e medição de um instrumento de DLS ^14. Medir o potencial zeta do DIO-LCNPs utilizando um instrumento de medição de potencial zeta apropriado.

3. Preparação de Cultura Celular Loiça para Experimentos de entrega e de imagem

NOTA: rotulagem DIO-LCNP é realizada em células HEK 293T / 17 células de rim embrionário humano (entre as passagens 5 e 15) que são cultivadas tal como descrito anteriormente ^4. Execute as experiências de entrega ea imagens de células subsequente conforme descrito abaixo.

1. Preparar 35 mm pratos de cultura de tecido de diâmetro (14 mm equipado com inserções lamela No. 1) por revestimento com fibronectina bovina (~ 100 ul a uma concentração de 20 ug/ Ml) em DPBS durante 2 h a 37 ° C.
2. Remover a solução de revestimento de fibronectina a partir da placa de cultura. Colheita HEK 293 T1 / 7 células do frasco T-25 por primeira lavagem da monocamada de células com 3 ml de DPBS e depois pela adição de 2 ml de tripsina-EDTA (0,5% de tripsina-EDTA a 0,25%).
3. Incubar o balão a 37 ° C durante ~ 3 min. Remover a tripsina-EDTA e devolver o balão para a incubadora. Uma vez que as células são separadas do balão, neutralizar a tripsina por adição de 4 ml de meio completo (Dulbecco Modified Eagle Médium; DMEM; alterado de modo a conter 10% de soro fetal bovino, 5% de piruvato de sódio, e 5% de antibiótico / antimicótico) ao balão . Determinar a concentração de células na suspensão fazendo a contagem num contador de células.
4. Ajustar a concentração de células a 8 x 10 ~ ⁴ células / ml com meio de crescimento. Adicionar 3 mL da suspensão de células para o prato e a cultura na incubadora durante a noite; no dia seguinte, as células devem estar a ~ 70% de confluência e deve estar pronto para uso. Adequadodensidade celular é crítica para a rotulagem robusto e eficiente de uma percentagem elevada de células.

4. Entrega Cellular da OID e Dio-LCNPs e imagem das células fixas

1. Prepare 1 ml de soluções de Dio Dio-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol em meio de entrega (HEPES-DMEM; DMEM contendo HEPES 25 mM) por diluição de soluções de reserva da OID _gratuito e Dio-LCNPs; Dio concentrações adequadas para a incubação sobre as células serão ~ 1-10 uM (expresso como a concentração de DiO _livre ou DiO sob a forma de DIO-LCNP).
2. Remover o meio de crescimento a partir das placas de cultura, utilizando uma pipeta serológica e lava-se as monocamadas de células (ver etapa 3), duas vezes com HEPES-DMEM (2 ml cada lavagem). Realizar as lavagens por adição e remoção de HEPES-DMEM, usando uma pipeta para / a partir do bordo dos pratos suavemente.
3. Adicionar 0,2 ml das soluções de entrega _livre ou DIO-LCNP preparados Dio para o centro das placas de cultura e devolver os pratos à incubator por um período de tempo adequado (tipicamente 15 ou 30 minutos, dependendo das necessidades da experiência). Períodos de incubação mais longos adicionar à rotulagem celular mais não específica de áreas não-membranoso (por exemplo, citosol).
4. Após o período de incubação, remove as soluções de transferência, usando uma pipeta serológica. Lavam-se as monocamadas de células duas vezes com DPBS (2 ml cada lavagem). Realizar as lavagens, adicionando suavemente e removendo DPBS para / a partir da borda do prato.
5. Fixar as monocamadas celulares utilizando 4% de paraformaldeído (preparado em DPBS) durante 15 min à temperatura ambiente.
   CUIDADO: O paraformaldeído é inflamável, um irritante respiratório, e um cancerígeno.
6. Remover a solução de paraformaldeído, utilizando uma pipeta e lavar cuidadosamente as células uma vez com DPBS (2 ml) por adição e remoção de DPBS utilizando pipeta para / a partir do bordo dos pratos.
7. As células fixadas são pronto a ser trabalhada para a presença de um sinal de fluorescência utilizando membranosa confocal de varrimento lasermicroscopia (CLSM). Realizar a imagiologia imediatamente, ou, alternativamente, substituir o meio com DPBS contendo 0,05% de NaN ₃ e armazenar os pratos a 4 ° C.
   CUIDADO: NaN ₃ é tóxico; exercer extrema cautela quando se utiliza NaN _3.
   NOTA: Fixo amostras armazenadas deste modo deverão ser trabalhada dentro de 48 horas para os melhores resultados.

5. Entrega Cellular da OID e Dio-LCNPs e FRET imagem latente em células vivas

NOTA: Neste método, as células são colabeled com 6 uM cada DIO-LCNP-PEG-Chol (onde DiO é um dador FRET) e 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-perclorato tetramethylindocarbocyanine (DII _livre, onde DII é um aceitador FRET). O lançamento do DIO junto da DIO-LCNP-PEG-Chol e sua incorporação na membrana plasmática é confirmada por um aumento observado na transferência de energia do doador DiO ao aceitante DII.

1. Células de etiquetas sequencialmente com Dio-LCNP-PEG-Chol e DII _freE Utilizando o método descrito no passo 4.
2. Após a coloração, lavar as células uma vez com DPBS (2 ml) usando uma pipeta serológica e substituir o tampão de lavagem com 2 ml de solução de imagem de células vivas (LCI).
3. Em um estágio do microscópio equipado com uma câmara de incubação aquecida, imagem da amostra de células vivas usando um microscópio confocal (objetiva 60X) com uma configuração de imagens FRET em intervalos de 30 min durante um período de 4 horas por emocionante o doador DiO a 488 nm e recolhendo a emissão completa os espectros de ambos o dador e o aceitador DiO DII 490-700 nm com um detector espectral 32 canais.
4. NOTA: Para mais informações sobre imagens FRET, por favor ver referência ^15.
5. Determinar a intensidade de emissão resolvida no tempo do dador e do aceitador DiO DII a partir de células coradas com o DIO-LCNP-PEG-Chol e DII. Calcule o tempo resolvido doador / receptor FRET relação (DII _emi / DiO _emi) para as imagens, o que irá aumentar de forma constante e, eventualmente, placaau uma vez que a quantidade de doador DiO particionado na membrana atingiu um máximo ^{de 16.}

6. Ensaio de Citotoxicidade de DiO e DIO-LCNPs para os HEK 293T / 17 células

NOTA: A citotoxicidade dos materiais DIO-LCNP é avaliada utilizando um ensaio de proliferação com base-corante de tetrazólio ^17. As células são cultivadas numa placa de poços múltiplos na presença de várias concentrações dos materiais, sob condições que simulam a entrega / rotulagem. As células são então cultivadas durante 72 horas para permitir a proliferação. Um corante (MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio) é então adicionada aos poços, e metabolicamente ativo células converter o corante num produto de formazano azul. a quantidade de formação de cor é directamente proporcional ao número de células viáveis.

1. Colheita HEK 293 T1 / 7 células do frasco T-25, seguindo o procedimento descrito no passo 3.2.SeedHEK 293T 17 / células (5000 células / 100 ^ l / poço) para os poços de uma placa de 96 poços de cultura de tecidos tratados com cultura e durante 24 h.
2. Remover completamente os meios de cultura dos poços utilizando uma micropipeta e adicionar 50 ul de HEPES-DMEM contendo DiO _livre, Dio-LCNPs ou DIO-LCNP-PEG-Chol em concentrações crescentes para replicar poços. Incubar as células em a 37 ° C durante 30 min.
   NOTA: Normalmente, replica feito em triplicado ou quadruplicado são suficientes para produzir dados estatisticamente fiáveis.
   1. Após a incubação, remover o meio de entrega que contém os materiais utilizando uma micropipeta e substituí-la com 100 ul de meio de crescimento. Cultura das células durante 72 horas.
3. Adicionar 20 uL de substrato a cada poço de tetrazólio, o retorno da placa para a incubadora, e permitir a formação de cor para prosseguir a 37 ° C durante 4 h. Leia a absorvância (Abs) do produto formazano a 570 nm (absorção mínimos para os DIO-LCNPs utilizados neste Study) e 650 nm (para subtracção do fundo não específico absorvância) utilizando um leitor de placas de microtitulação.
4. A partir do valor de absorvância diferencial (abs ₅₇₀ - Abs ₆₅₀₎ versus a concentração de material e de comunicar os resultados como percentagem de controlo da proliferação celular (grau de proliferação de células apenas em meio de cultura celular).

Análise 7. Os dados

1. Analisar estatisticamente os dados com uma análise de variância univariada (ANOVA). Para comparações múltiplas, aplicar o teste post hoc de Bonferroni. Fornecer todos os valores médios ± erro padrão da média (SEM), a menos que mencionado de outro modo.
   NOTA: A probabilidade aceitável para significância foi p <0,05.

Resultados

LCNPs foram preparados na qual o núcleo hidrófobo da NP foi carregado com uma sonda de marcação da membrana-representativo para demonstrar a utilidade do LCNP como um veículo de entrega eficiente para cargas hidrofóbicas. Para este efeito, a carga foi escolhido o corante-marcação da membrana potenciométrica altamente insolúvel em água, DiO. LCNPs DIO-carregados (DIO-LCNPs) foram sintetizados usando uma técnica mini-emulsão de duas fases, com os componentes químicos DACTP11, AC10COONa, e DiO, como mostrado ...

Discussão

Um objectivo permanente de NMDD é a segmentação controlada e entrega de formulações de droga para as células e tecidos, combinada com a eficácia da droga melhorada simultânea. Uma classe específica de moléculas de fármaco para o qual este tem sido um desafio significativo é agentes de drogas / imagiologia hidrófobos que têm moderação para nenhuma solubilidade em meios aquosos. Este problema tem atormentado a transição dos fármacos potentes em sistemas de cultura celular in vitro para...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)	ThermoFisher	E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)	Sigma Aldrich	D4292-20MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride	Nanocs, Inc.	PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter	ThermoFisher	C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)	Sigma Aldrich	468495-100MG	Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	ThermoFisher	14040182	Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma	ThermoFisher	33010018	Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V)	ThermoFisher	28906	Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)	American Type Culture Collection	ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS)	ThermoFisher	A14291DJ	Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES	ThermoFisher	21063045	Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS)	ThermoFisher	24510
Nikon A1si spectral confocal microscope	Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)	ThermoFisher	T10282	mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument	ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor	Sonics and Materials Inc	GEX 600-5
Mini Cetntrifuge	Benchmark	Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium	GE Healthcare	17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System	Bio-RAD	76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	ThermoFisher	25200056