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요약

액정 나노 입자 (LCNP) nanocarrier는 살아있는 세포의 세포막에 소수성화물의 제어 전달을위한 수단으로 이용된다.

초록

세포에 약물 / 조영제의 제어 전달은 치료제의 개발 및 세포 신호 전달 과정의 연구에 중요하다. 최근에는 나노 입자 (NPS는) 이러한 전달 시스템의 개발에 상당한 가능성을 보여 주었다. 여기서, 액정 NP (LCNP) 기반 전달 시스템은 플라즈마의 소수성 영역으로 NP 코어 내에서 수 불용성 염료, 3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine 퍼클로레이트 (DIO)의 제어 전달을 위해 사용되어왔다 막 이중층. 국민 연금의 합성 중에 색소를 효율적으로 다중 분광 분석에 의해 확인 된 바와 같이, 소수성 LCNP 코어에 통합 하였다. 만약 NP 표면 (DIO-LCNP-PEG-Chol을)에 PEG 화 콜레스테롤 유도체의 활용은 HEK 293T / 17 세포의 세포막에 염료 로딩 NP에 결합 할 수 있었다. 시분 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 및 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 이미징 통과를 확인LCNP 코어와 세포막 이중층에의 삽입에서 DIO의 유출을 필자. 마지막으로, LCNP-PEG-Chol을 같은 DIO의 전달은 DIO의 세포 독성을 약화; DIO의 NP 양식 디오 무료 벌크 용액으로부터 전달에 비해 ~ 30~40% 적은 독성을 나타냈다. 이 접근법은 소수성 분자화물의 막 - 특정 전송 및 변조를위한 효율적인 양상으로서 LCNP 플랫폼의 유용성을 보여준다.

서문

살아있는 세포를 (적어도 하나의 차원에서 재료 ≤100 ㎚) 나노 인터페이싱의 출현 이후 지속적인 목표는 다양한 애플리케이션을위한 나노 입자 NPS ()의 고유 사이즈 - 의존 특성을 활용할 수있다. 이러한 응용 프로그램은 세포와 조직 라벨 / 영상 (생체 외 및 생체 내에서 모두), 실시간 감지, 약물 및 기타화물 1의 제어 전달을 포함한다. 이러한 관련 NP 속성의 예는 반도체 나노 결정의 크기에 의존 방출 (양자점, 양자점)를 포함; 금 나노 입자의 광열 특성; 리포좀의 수성 코어의 큰 적재량; 이러한 단층 카본 나노 튜브와 그래 핀 등의 탄소 동소체의 전도도 및 탄도.

최근에 상당한 관심 콘트라스트 / 영상 A와 약물 및 다른화물의 제어 NP에 대한 변조의 사용이 생겨났다남자용 화장실. 여기서의 이론적 근거는 크게 / 강화에서 NP 제형으로 제공함으로써 약물화물의 전체 용해도 전달 용량 순환 시간 및 최종 허가를 최적화하는 것이다. 이 NP-매개 약물 전달 (NMDD)로 알려지게하고 있으며, 다양한 암 임상 시험의 다양한 단계에서 더 많은 수백을 치료하는 병원에서 사용하기위한 일곱 FDA 승인 NP 약물 제형은 현재이 있습니다. "적은 비용으로 더 많은 달성;"본질적으로, 목표는 것입니다 즉, 넓은 표면적을 이용하여 적은 투여 투여보다 약을 전달하기위한 골격으로 NP를 사용하려면 부피 (예를 들어, 이러한 양자점 및 금속 산화물 등의 경질 입자) NP에 또는 로딩 그들의 큰 내부 체적 대형화물 페이로드 (예를 들어, 리포좀 또는 미셀). 여기서의 목적은 수성 안정성 및 향상된 순환을 촉진하는 동시에, 특히 대한 여러 전신적 전달 투여 요법에 대한 필요성을 감소시키는매우 효과적인 반면, 수성 매질에 난용이며, 도전 소수성 약물화물.

따라서, 본원에 기술 된 작업의 목적은 친 지성 세포막 이중층 소수성화물의 특정 제어 및 전달을위한 신규 NP 지지체의 사용 가능성을 확인 하였다. 일에 대한 의욕은 수성 미디어에서 세포에 소수성 분자의 전달에 고유 제한 용해도 어려움이었다. 전형적으로, 이러한 소수성 분자의 전달은 내부 부하를 제한 할 수 독성 손상 세포 및 조직 생존 2 또는 미셀 담체 수있는 유기 용매 (예를 들어, DMSO) 또는 양쪽 성 계면 활성제 (예, 폴록 사머)의 사용을 필요 용량. 여기에 선택된 NP 캐리어는 이전에 3를 개발 한 새로운 액정 NP (LCNP) 배합이었고, 그건 ~ 40 배를 달성하기 위해 이전에 표시했다 배양 된 세포를 4 항암제 독소루비신의 효능 향상.

여기에 기술 된 연구에서, 선택된 대표화물은 전위차 막 염료, 3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산 (DIO)을했다. DIO 거실 고정 신경 세포막 전위 측정에 선행 성 역행 추적을 위해 사용 된 수 불용성 염료 및 일반 멤브레인 라벨링 5, 6, 7, 8, 9. 인해 소수성 특성, DIO는 일반적으로 결정질 형태 (10)에 단층 세포 나 조직에 직접 첨가하거나, 매우 높은 농도로 인큐베이션 농도 원액 (11), (12)에서 희석 후 (~ 1-20 μM).

내용의 "LCNP 플랫폼> 여기서, 접근 방식이었다 사용은 DIO. DIO에 대한 배달 차량으로 그 내부 코어를 완전히 소수성 및 표면이 동시에 친수성 및 바이오 콘쥬 게이션 의무가있는 다기능 NP는, 합성시 LCNP 코어에 통합 및 NP 표면이어서 세포막에 DIO-LCNP 앙상블 결합 멤브레인을 촉진하는 PEG 화 콜레스테롤 잔기로 기능화된다.이 접근법은 큰 충실도 멤브레인 레지던스 원형질막으로 DIO 분할 전달 시스템 초래 DIO의 유리 형태는 벌크 용액으로부터 전달보다 시간 (DIO 무료). 또한,이 방법은 DIO의 LCNP 매개 전달이 실질적으로 변조하고 친 유성 세포막 이중층으로 염료의 특정 파티션의 속도를 구동하는 것을 보여 주었다.입니다 부수적 LCNP 제제로 제공하여 40 % ~하여 유리 약물의 독성을 감소시키는 동안 달성했다.

여기에 기술 된 방법 일 포함 또는 난 용성 또는 수용액에 완전히 용해되지 소수성이 강한화물의 세포 전달을 필요로 연구자를위한 강력한 수 있도록 기술이 될 것으로 예상된다.

프로토콜

DIO-LCNP 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을 1. 준비

  1. 액정 성 디 아크릴 레이트 가교제 (DACTP11 45 mg)을 용해시키고, 3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine 퍼클로레이트 (DIO, 2 mg)을 클로로포름 2ml의 중합을위한 자유 라디칼 개시제 (아조 비스 이소 부티로 니트릴, 1 ㎎)을 얻었다. 아크릴 레이트 작용 계면 활성제의 수용액 (AC10COONa, 7 용액에 13 mg)을이를 추가합니다.
  2. 물에 중합 성 계면 활성제에 의해 둘러싸 이는 유기 재료의 작은 방울로 구성된 미니 에멀젼을 제조하기 위해 5 분 동안 80 % 진폭에서 1 시간 동안 초음파 처리하고, 혼합물을 교반한다.
  3. 오일 욕에서 64 ℃까지 혼합물을 가열 클로로포름 서서히 계면 활성제에 의해 안정화 된 DIO 함유 NP 현탁액을두고 증발 가교제 및 계면 활성제 양쪽의 중합을 개시한다.
  4. 전혀 응집을 제거하기 위해 0.2 ㎛의 주사기 필터를 통해 NP 서스펜션 (3 회) 필터. 스토추가 사용까지 4 ° C에서 필터링 된 NP 솔루션 다시.
  5. EDC의 결합을 통해 DIO-LCNP에 PEG-Chol을의 활용.
    1. Chol을-PEG-NH 2를 용해 · 25 mM의 HEPES 완충액 (pH 7.0)에 염산 (PEG-Chol을, 0.9 mm)이다.
    2. N - 히드 록시 sulfosuccinimide 나트륨 염 (NHSS 40 mM)을 농축 모액으로부터 HEPES 완충액에 1- 에틸 -3- (3- (디메틸 아미노) 프로필) 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC, 400 mm)를 함유하는 작업 용액을 제조 하였다.
    3. 즉시 HEPES 완충액 DIO-LCNP 1.0 ml의 NHSS / EDC의 새로 제조 된 작업 용액 20 μL를 추가로 5 분 동안 교반한다.
    4. 이 혼합물에 Chol을-PEG-NH 2 · 염산의 원액 20 μl를 추가하고 2 시간 동안 교반한다.
    5. 간단히 테이블 탑 미니 원심 분리기를 사용하여 평형화 PD-10 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼 (13)를 통해 뜨는을 전달하는 30 초 동안 최대 속도 (~ 2000 XG)에서 반응 혼합물을 원심 분리둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS, 0.1X).

DIO-LCNP 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을 2. 특성

  1. 겔 전기 영동에 의해 DIO-LCNP 표면에 PEG-Chol을 성공적으로 공유 결합을 확인합니다.
    1. (89 mM 트리스 (산도 7.6), 89 mM의 붕산, 2 mM의 EDTA TBE) 버퍼 (50) 트리스 - 붕산 전기의 ㎖ (1 배)에서 아가로 오스 0.5 g을 녹여. 아가로 오스를 분해하는 전자 레인지의 용액을 가열한다. 이 솔루션은 약간 냉각 및 전기 상자에 젤 판에 내용을 부어 할 수 있습니다. 샘플 우물을 만들 겔 빗를 삽입합니다.
    2. 겔이 고체화되면, 버퍼 챔버의 실행 TBE (챔버 내의 겔 잠길 정도로) 요구량을 추가한다.
    3. DIO-LCNP 시료 35 μL를 추가 겔의 웰에 110 V.의 전압으로 20 분 동안 실행 (5 %가 V / V, 글리세롤 개정)
    4. 이미지 겔 촬상 시스템 (WI)를 사용하여 젤일 여기 및 방출 필터는 각각 488 nm의 500-550 nm의,에.
  2. PBS에서 DIO-LCNP 용액 (~ 200 배 희석) (PH ~ 8 0.1X)을 희석하고, DLS 장비 (14) 상에 측정하여 동적 광산란 (DLS)에 의해 입도 분포를 평가한다. 적절한 제타 전위 측정 장치를 이용하여 DIO-LCNPs의 제타 전위를 측정한다.

배달 실험 및 이미징을위한 세포 배양 접시 3. 준비

주 : DIO-LCNP 라벨링 나란히 네 바와 같이 배양 된 HEK 293T (통로 5 ~ 15) / (17), 인간 배아 신장 세포에서 수행된다. 전달 실험과 후술하는 바와 같이 후속 세포 이미징을 수행한다.

  1. 20 μg의 농도로 ~ 소 피브로넥틴 (로 코팅하여 100 μl를 (14mm 1 위의 coverglass 삽입 장착) 35mm 직경의 조직 문화 요리를 준비37 ° C에서 2 시간 동안의 DPBS / ㎖).
  2. 배양 접시에서 피브로넥틴 코팅 용액을 제거한다. 수확 HEK 먼저 세정하여 T-25 플라스크에서 293 T1 / 7 세포 DPBS 3 ㎖로 한 후 트립신 EDTA (0.5 % 트립신, 0.25 % EDTA) 2 ㎖를 첨가하여 세포 단층.
  3. ~ 3 분 동안 37 ° C에서 플라스크를 품어. 트립신 - EDTA를 제거하고 인큐베이터에 플라스크를 반환합니다. 세포를 플라스크에서 분리되면, 완전 배지 4㎖를 첨가함으로써 트립신을 중성화 플라스크에 (; DMEM 둘 베코 변형 이글 중간 10 % 소 태아 혈청, 5 % 소듐 피루 베이트, 5 % 항생제 / 항진균제를 포함하도록 수정) . 셀 카운터들을 계산하여 상기 현탁액의 세포 농도를 결정한다.
  4. 성장 배지 ~ 8 × 104 세포 / ml의 세포 농도를 조정한다. 하룻밤 인큐베이터에있는 접시와 문화에 세포 현탁액 3 ML을 추가 다음 날, 세포 ~ 70 % 포화 상태에 있어야하고 사용할 준비해야한다. 알맞은세포 밀도는 세포의 높은 비율의 강력하고 효과적인 라벨 중요하다.

4. 휴대 DIO 및 DIO-LCNPs 납품 및 고정 세포의 이미징

  1. 전달 매체에 DIO, DIO-LCNP 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을 1 ml의 솔루션을 준비합니다 (HEPES-DMEM, DMEM 25 mM의 HEPES를 포함) DIO 무료 DIO-LCNPs의 원액을 희석하여; 세포 배양에 적합한 DIO 농도는 (DIO DIO-LCNP의 형태로 무료 또는 DIO의 농도 중 하나로 표시) ~ 1-10 μM 될 것입니다.
  2. 혈청 학적 피펫을 사용하여 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 세포 단층을 세척 HEPES-DMEM (2 ㎖ 각각 세척)로 2 회 (단계 3). 부드럽게 추가하고 요리의 가장자리로 / 피펫을 사용하여 HEPES-DMEM를 제거하여 세척을 수행합니다.
  3. 배양 접시의 중심에 준비된 DIO 무료 또는 DIO-LCNP 전달 솔루션의 0.2 ML을 추가하고 난에 요리를 반환ncubator 적절한 기간 (실험의 필요에 따라 일반적으로 15 ~ 30 분)합니다. 긴 배양 시간이 아닌 멤브레인 영역의 더 특이 세포 라벨 (예를 들어, 세포질)에 추가 할 수 있습니다.
  4. 잠복기 후, 혈청 학적 피펫을 사용하여 전송 솔루션을 제거합니다. DPBS (2 씩으로 세척)과 세포 단층을 두 번 씻으십시오. 부드럽게 접시의 가장자리로부터 /로 DPBS를 추가하고 제거하여 세척을 수행한다.
  5. 실온에서 15 분 동안 (DPBS 제조) 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 세포 단층을 고정한다.
    주의 : 파라 포름 알데히드는 가연성, 호흡기 자극 및 발암 물질로 의심.
  6. 피펫을 사용하여 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 부드럽게 추가하고 요리의 가장자리로 / 피펫을 사용하여 DPBS를 제거하여 세포를 DPBS 1 시간 (2 ml)에 씻는다.
  7. 고정 세포를 공 초점 레이저 주사를 사용하여 멤브레인 형광 신호의 존재 여부, 촬영 준비현미경 (CLSM). 즉시 이미징을 수행하거나, 또는 NaN이 3 0.05 %를 포함 DPBS와 매체를 교체하고 4 ℃에서 요리를 저장합니다.
    주의 : NaN의 3 독성; NaN의 3 사용할 때 극도의주의를 기울여야.
    참고 :이 방식으로 저장 수정 된 샘플은 최적의 결과를 위해 48 시간 내에 몇 군데해야합니다.

라이브 세포 DIO 및 DIO-LCNPs과 FRET 이미징 5. 세포 배달

참고 :이 방법에서는, 세포를 6 μM (DIO는 FRET 기증자입니다) 각 DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 1,1'- 디 옥타 데실 3,3,3- ', 3'-tetramethylindocarbocyanine 과염소산 염 (DII와 colabeled된다 무료 DII)는 FRET 수용체이다. 세포막에 DIO-LCNP-PEG-Chol을 그 법인에서 DIO의 자료는 DII 수용체에 DIO 기증자에서 에너지 전달에서 관찰 된 증가에 의해 확인된다.

  1. DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 DII FRE 순차적 라벨 세포E 단계 4에 기재된 방법을 사용.
  2. 염색 후, 세포를 DPBS 1 시간 (2 ㎖) 혈청 학적 피펫을 사용하여 세척 및 생균 촬상 용액 2 ㎖ (LCIS)로 세척 버퍼를 교체한다.
  3. 가열 배양 챔버, 화상 전체 방출 488 nm에서 흥미로운 DIO 공여체에 의해 4 시간 동안 30 분 간격으로 FRET 이미징 구성의 공 초점 레이저 주사 현미경 (60X 대물 렌즈)를 사용하여 수집 생균 샘플 장착 된 현미경 스테이지 Remote 페이지 공여체 및 32 채널 스펙트럼 검출기 490-700 나노 미터에서 DII 수용체 모두 스펙트럼.
  4. 참고 : FRET 영상에 대한 자세한 내용은 15를 참조 참조하시기 바랍니다.
  5. DIO 기증자 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 DII으로 염색 된 세포에서 DII 수용체 모두의 시간 해결 발광 강도를 결정합니다. 시간 해결 수용체 / 기증자가 꾸준히 증가 비율 이미지 (DII EMI / DIO EMI), 결국 판을 FRET 계산AU 막에 분배 DIO 공여체의 양 일단 최대 16 도달했다.

6. DIO의 세포 독성 분석 및 DIO-LCNPs HEK 293T / 17 셀에

주 : DIO-LCNP 물질의 세포 독성은 테트라 졸륨 염료 계 증식 분석 17 사용하여 평가된다. 세포 전달 / 라벨링을 에뮬레이트 조건 하에서 물질의 다양한 농도의 존재 하에서 멀티 웰 플레이트에서 배양 하였다. 세포는 증식을 허용하도록 72 시간 동안 배양한다. 염료 (MTS는, (3- (4,5- 디메틸이 -2- 일) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4- 술포 페닐) -2H- 테트라 졸륨)을 웰에 첨가하고, 대사 적으로 활성되고 세포 청색 포르 마잔 생성물로 전환 염료. 색 형성 량은 생세포 수에 정비례한다.

  1. 수확 HEK 단계 3.2.Seed에 설명 된 절차를 수행하여 T-25 플라스크에서 293 T1 / 7 세포24 시간 동안 96 웰 조직 문화 처리 플레이트와 문화의 우물에 HEK 293T / 17 세포 (/ 100 μL / 잘 5,000 세포).
  2. 완전 무료 DIO를 포함하는 HEPES-DMEM 50 μl를 마이크로 피펫을 사용하여 우물에서 배양 배지를 제거하고 추가, 우물을 복제하기 위해 농도를 증가에서 DIO-LCNPs, 또는 DIO-LCNP-PEG-Chol을. 30 분 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
    참고 : 일반적으로, 세중 또는 4 번씩 수행 복제합니다 통계적으로 신뢰할 수있는 데이터를 산출하기에 충분하다.
    1. 배양 후, 마이크로 피펫을 사용하여 물질을 함유하는 공급 배지를 제거하고 배양 배지 100 ㎕로 교체. 문화 72 시간 동안 세포.
  3. 물론 각각에 테트라 졸륨 기판의 20 μl를 추가 인큐베이터에 접시를 반환하고 색상 형성이 4 시간 동안 37 ° C에서 진행 할 수 있습니다. 570 nm의 (이 스투에 사용되는 DIO-LCNPs에 대한 흡수 극소의 포르 마잔 제품의 흡광도 (ABS)를 읽고DY) 및 비특이적 백그라운드 흡광도 650 nm의 감산 () 미세 적정 플레이트 판독기를 사용.
  4. 차동 흡광도 값 (ABS 570 - ABS 650) 플롯 물질 농도 대를 제어 세포 증식 (세포 배양 배지에서만 세포의 증식 정도)의 비율로 결과를보고한다.

7. 데이터 분석

  1. 통계적 분산의 변량 분석 (ANOVA)를 사용하여 데이터를 분석한다. 다중 비교를 들어, 페로 니의 사후 테스트를 적용합니다. 평균의 ± 표준 오차 달리 언급하지 않는 한 (SEM) 모든 평균 값을 제공합니다.
    참고 : 중요성에 대한 허용 확률은 P <0.05이었다.

결과

LCNPs이되는 NP의 소수성 코어가 소수성화물에 대한 효율적인 배달 차량으로 LCNP의 유용성을 입증하는 대표적인 막 표지 프로브로드 제조 하였다. 이를 위해, 선택된화물은 매우 불용성 전위차 막 - 표지 염료 DIO이었다. 도 1 내지 18에 도시 된 바와 같이, DIO로드 LCNPs (DIO-LCNPs)는 화학 성분 DACTP11, AC10COONa 및 DIO와 2 상 미니 에멀젼 기법을 이용하여 합성 하였?...

토론

NMDD의 지속적인 목표는 동시 개선 된 약효와 결합 된 제어 및 표적 세포 및 조직에 약물 전달 제제이다. 이 중요한 문제를 제기했다있는 약물 분자의 하나의 특정 클래스는 수성 매질에 더 용해도에 드물게이 소수성 약물 / 이미징 에이전트입니다. 이 문제는 임상에 체외 세포 배양 시스템에서 강력한 약물의 전환을 괴롭혀하고 "보류"되는 유망한 약물 분자의 수 결과 또는 포?...

공개

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 작품은 NRL 자료 기금 프로그램 (작업 단위 MA041-06-41-4943)에 의해 지원되었다. ON은 국가 연구위원회 박사후 연구 Associateship에 의해 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA)ThermoFisherE2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO)Sigma AldrichD4292-20MGHazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochlorideNanocs, Inc.PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counterThermoFisherC10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)Sigma Aldrich468495-100MGHazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ThermoFisher21063045Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)ThermoFisher14040182Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrumentZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, PlasmaThermoFisher33010018Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V)ThermoFisher28906Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17)American Type Culture CollectionATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS)ThermoFisherA14291DJWarm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dishMatTek corporationP35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPESThermoFisher21063045Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS)ThermoFisher24510
Nikon A1si spectral confocal microscopeNikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%) ThermoFisherT10282mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrumentZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic ProcessorSonics and Materials IncGEX 600-5
Mini CetntrifugeBenchmarkMini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 MediumGE Healthcare17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging SystemBio-RAD76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermoFisher25200056

참고문헌

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