Métodos de estudio de la función de proteínas de transporte epitelial y expresión en nativo Intestino y Caco-2 células cultivadas en 3D

Resumen

Se describen métodos sencillos para estudiar la regulación de la función intestinal transportador de serotonina (SERT) y la expresión utilizando una célula in vitro modelo de cultivo de las células Caco-2 crecido en 3D y un modelo ex vivo de los intestinos de ratones. Estos métodos son aplicables al estudio de otros transportadores epiteliales.

Resumen

El epitelio intestinal tiene importantes funciones de transporte y de barrera que juegan un papel clave en las funciones fisiológicas normales del cuerpo al tiempo que proporciona una barrera para las partículas extrañas. el transporte epitelial alterada (iones, nutrientes o medicamentos) se ha asociado con muchas enfermedades y puede tener consecuencias que van más allá de las funciones fisiológicas normales de los transportistas, como por influir en la integridad epitelial y el microbioma intestinal. La comprensión de la función y regulación de las proteínas de transporte es fundamental para el desarrollo de mejores intervenciones terapéuticas. El mayor desafío en el estudio del transporte epitelial está desarrollando un sistema modelo adecuado que recapitula las características importantes de las células epiteliales intestinales nativas. Varios modelos de cultivo celular in vitro, como las células HT-29-Cl.19A Caco-2, T-84, y se utilizan típicamente en la investigación del transporte epitelial. Estas líneas celulares representan un enfoque reduccionista de la modelización del correopithelium y se han utilizado en muchos estudios mecanísticos, incluyendo su examen de las interacciones epitelio-microbiana. Sin embargo, las monocapas de células no reflejan con exactitud las interacciones célula-célula y el microentorno in vivo. Las células cultivadas en 3D han demostrado ser prometedores modelos para estudios de permeabilidad del fármaco. Mostramos que células Caco-2 en 3D se pueden utilizar para estudiar los transportadores epiteliales. También es importante que los estudios en células Caco-2 se complementan con otros modelos para descartar efectos específicos de células y para tener en cuenta la complejidad del intestino nativo. Varios métodos han sido utilizados previamente para evaluar la funcionalidad de los transportadores, tales como saco evertido y la absorción en las células epiteliales aisladas o en vesículas de membrana aisladas plasma. Teniendo en cuenta los desafíos en el campo con respecto a los modelos y la medición de la función de transporte, se demuestra aquí un protocolo para crecer células Caco-2 en 3D y describir el uso de una cámara de Ussing como unaenfoque eficaz para medir el transporte de serotonina, como en el epitelio intestinal polarizadas intactas.

Introducción

El epitelio intestinal está equipado con varias proteínas de transporte (canales, ATPasas, co-transportadores e intercambiadores) que realizan numerosas funciones que van desde la absorción de nutrientes, electrolitos y fármacos para la secreción de fluido y los iones en el lumen. Las proteínas de transporte generan gradientes electroquímicos que permiten el movimiento de los iones o moléculas de un modo vectorial. Esto se consigue mediante las distribuciones asimétricas de los sistemas de transporte en las membranas apical y basolateral de las células epiteliales polarizadas. Además, las uniones estrechas, que atan las células epiteliales adyacentes, juegan un papel importante en este proceso, al servir como una barrera a la difusión intramembrane de componentes entre los dominios de la membrana apical y basolateral. Sistemas modelo apropiado que imitan estos rasgos característicos del intestino nativo (es decir, la polaridad, la diferenciación, y la integridad unión estrecha) son críticos para el estudio de la functionalidad de sistemas de transporte epiteliales.

Con respecto a los modelos, las líneas celulares típicos utilizados actualmente en la investigación del transporte epitelial intestinal son células Caco-2, un modelo de completamente diferenciada, absortivas pequeñas células epiteliales intestinales; y las células T84 o HT-29 subclones, modelos de grandes células epiteliales intestinales de las criptas derivado ^1. Convencionalmente, estas líneas celulares se cultivan como monocapas en superficies de plástico o en insertos transwell recubiertos. Trans-así insertos de cultivo celular, en cierta medida se asemejan el medio ambiente in vivo al permitir que las células polarizadas para alimentar hacia la membrana basolateral. Sin embargo, una limitación en sistemas de cultivo 2D convencionales es que las células se ven obligadas a adaptarse a una superficie artificial, plana y rígida. Así, la complejidad fisiológica del epitelio nativo no se refleja con precisión en un sistema 2D. Esta limitación se ha superado por métodos para hacer crecer las células en 3D en un microambiente específico, como Mixtur proteína gelatinosae, que contiene una variedad de componentes de la matriz extracelular ^{2, 3.} Sin embargo, los cultivos in vitro no pueden simular la complejidad del epitelio intestinal, que tiene múltiples tipos de células y la arquitectura específica de la región en el intestino. Por lo tanto, los estudios que utilizan modelos de cultivos celulares requieren una validación adicional en el intestino nativa. Utilizando el cultivo celular in vitro 3D y la mucosa intestinal del ratón, como se describe aquí métodos sencillos para estudiar la regulación del transportador de serotonina intestinal (SLC6A4, SERT).

El transportador SERT regula la disponibilidad extracelular de una importante hormona y neurotransmisor, 5-hidroxitriptamina (5-HT), mediante el transporte rápidamente a través de un Na ⁺ / Cl ^- proceso dependiente. SERT es una diana conocida de antidepresivos y ha surgido recientemente como una nueva diana terapéutica de trastornos gastrointestinales, como la diarrea y la inflamación intestinal.Métodos para investigar la captación de 5-HT en las células epiteliales intestinales se han descrito anteriormente. Por ejemplo, se ha demostrado Caco-2 células cultivadas en soportes de plástico o insertos permeables a exhibir fluoxetina sensibles a la captación de ^3H-5-HT en ambos dominios apical y basolateral ^4. La medición de la función SERT en aislado de borde en cepillo vesículas de membrana (BBMVs) preparado a partir de donantes de órganos humanos intestino delgado también ha sido descrito por ⁵ nosotros. ^{Captación de} 3H-5-HT en BBVMs humanos se demostró que la fluoxetina-sensible y Na ⁺ / Cl ^- dependiente, y que exhibe cinética de saturación con una K _m de 300 nM ^5. Utilizando métodos similares, también medido con anterioridad función de SERT como la captación de ^3H-5-HT en ratones BBMVs intestinales ^6. Sin embargo, la preparación de vesículas de membrana de plasma puro requiere una gran cantidad de mucosa de tejido. Otros métodos, tales como la radiographic la visualización de ³ sitios de captación de H-5-HT, también se han mostrado anteriormente en conejillo de indias y rata intestino delgado ^7.

La cámara de Ussing proporciona un sistema más fisiológico para medir el transporte de iones, nutrientes, y medicamentos a través de diversos tejidos epiteliales. La ventaja principal de la técnica de la cámara Ussing es que permite la medición precisa de los parámetros eléctricos y de transporte de intacta epitelio intestinal, polarizada. Además, para minimizar la influencia del sistema neuromuscular intrínseca, el decapado seromuscular de mucosa intestinal se puede realizar para investigar la regulación de los transportadores en el epitelio ^8.

Se demuestra que las células Caco-2 cultivadas en 3D en proteína gelatinosa forman un lumen de huecos que expresan marcadores apical y basolateral distintas. Estas células muestran una mayor expresión de SERT que las células 2D Caco-2. Los métodos para hacer crecer células en 3D y con PEse describen inmunotinción rforma o ARN y la proteína de extracción. Además, se describen los métodos para estudiar la función SERT y la regulación por el TGF-β1, una citoquina pleiotrópica, en la pequeña mucosa intestinal mediante la utilización de una técnica de cámara de Ussing.

Protocolo

1. Estudio de Transporte intestinal en un sistema de cultivo en 3D de células Caco-2: Crecimiento 3D Caco-2 Cultivo de células en una mezcla de proteínas gelatinoso

1. factor de crecimiento de deshielo redujo mezcla de proteína gelatinosa en hielo durante 8 h (o O / N) a 4 ° C. Una vez descongelado, hacer 1 ml o 500 alícuotas de uso o almacenar a -20 ° C para su uso posterior.
2. En el día de la cultura, preenfriar las placas de cultivo (por ARN y proteínas de extracción) o portaobjetos con cámaras (por inmunotinción) en hielo. Añadir 30 l de mezcla de proteína gelatinosa a cada pocillo de un porta de vidrio cámaras ocho pocillos (o 120 l por pocillo de una placa de 6 pocillos) y se extendió uniformemente. Tenga cuidado de no generar burbujas de aire durante el proceso.
3. Colocar los portaobjetos / placas dentro de una incubadora de cultivo celular a 37 ° C durante 15 - 30 min y permita que la mezcla de proteína gelatinosa se solidifique.
4. Mientras que la mezcla de proteína gelatinosa está solidificando, trypsinize un matraz confluente de células Caco-2.
5. Contar el número dede las células y hacerlas girar a 500 xg en una centrífuga de mesa durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular en 3D Caco-2 Medio, según sea necesario.
6. Sembrar los portaobjetos de cámara de vidrio a 4.000 células por pocillo (para placas, 20.000 por pocillo). Permiten a las células crecer en una incubadora humidificada con 5% _{de CO2} a 37 ° C. Cambiar el medio cada 3 - 4 d.

2. La tinción de inmunofluorescencia para epitelial Transportadores en 3D células Caco-2: Día 1

1. Aspirar el medio y fijar las células con 400 l de 2% de paraformaldehído (PFA) (en PBS con el pH ajustado a 8,5 con NaOH) durante 30 min a RT.
   NOTA: La solución de PFA no se debe almacenar durante más de 1 semana a 4 ° C, y la solución recién hecha se puede utilizar. PRECAUCIÓN: PFA es altamente tóxico y carcinógeno potencial. Siempre maneje con precaución en una campana química y el uso de equipo de protección personal.
2. Lavar los pocillos dos veces con PBS 1x y almacenar las diapositivas a 4 ° C en PBS (400 l /bien). Una vez fijado, almacenarlos a 4 ° C durante un máximo de una semana.
3. Calentar los portaobjetos de cámara a temperatura ambiente (esto va a endurecer la cama mezcla de proteína gelatinosa y que sea fácil para aspirar durante las etapas de lavado).
4. Permeabilizar las células con 0,5% Triton en PBS durante no más de 15 min.
5. Preparar tampón PBS-glicina (130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3,5 mM NaH ₂ PO _4, y glicina 100 mM). Enjuagar 3 veces con 1x PBS-glicina durante 10 minutos cada uno a TA.
6. Preparar tampón de inmunofluorescencia (IF): NaCl 130 mM, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3,5 mM NaH ₂ PO _4, mM Glicina 100, 7,7 mM NaN _3, 0,1% de BSA, 0,2% Triton X-100, y 0,05% de Tween-20 .
7. Lavar 3 veces en tampón IF durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente. Bloque en el 5% de suero normal de cabra (NGS) en el tampón IF. Incubar con el anticuerpo primario diluido en suero de cabra SI + 1%, 200 l / pocillo, durante 1 - 2 horas a temperatura ambiente. Lavar con SI 3x tampón durante 10 minutos cada uno.
8. Incubar con anti secundariacuerpo (1: 200) diluido en IF + 1% de NGS, 200 l / pocillo, durante 1 h a TA.
9. Se lava con tampón IF tres veces durante 10 minutos cada uno. Mantenga las diapositivas de la oscuridad de este paso adelante. Levante las cámaras de plástico de las placas de vidrio mediante la colocación de la corredera de cámara en un soporte negro y arrastrando un levantador de blanco a través del soporte hasta que su borde contacto con el borde de los pozos. tire suavemente hacia arriba las cámaras (el titular y el levantador debe venir con las portas de cultivo).
10. Montaje con medio anti-desvanecimiento lento y deje que se seque durante 10 minutos a temperatura ambiente.
11. Una vez secado por completo, selle las diapositivas con esmalte de uñas y les imagen con microscopía confocal. Almacenar las diapositivas a 4 ° C durante dos semanas oa -20 ° C durante varios meses.

3. ARN y extracción de proteínas a partir de 3D células Caco-2

1. Tratar las células cultivadas en mezcla de proteína gelatinosa para 12 - 14 d con un agente de ensayo, tales como TGF-β1 (10 ng / ml, 1 h).
2. Después del tratamiento, se lavan las células con 1x PBS. Mantener las células en hielo durante 30 min para licuar la mezcla de proteína gelatinosa.
3. Lavar los pocillos con PBS enfriado y recoger las células en tubos de centrífuga individuales. Recoger las células mediante centrifugación a baja velocidad a 500 x g y 4 ° C durante 10 minutos. Se extrae el ARN utilizando procedimientos estándar y utilizar el tiempo real de RT-PCR.
4. Para la extracción de proteínas, lisar las células por medio de 1x tampón de lisis celular suplementado con cóctel inhibidor de proteasa 1x. Después de la adición de tampón de lisis celular al sedimento, lisar las células por sonicación y eliminar los restos celulares por centrifugación a 7500 xg y 4 ° C durante 10 min.

4. La medición de la captación de 5-HT en el íleon ratón Utilizando una cámara de Ussing: Preparación Intestinal y seromuscular de desmontaje

1. Después de la eutanasia, diseccionar los ratones y quitar el intestino delgado (después del estómago y antes de que el ciego). Se divide el intestino delgado en tres partes. Desechar el tercio medio, utilice el tercio proximalcomo yeyuno, y utilizar el tercio distal como íleon. Evitar tirar el intestino de su unión mesentérica para evitar daños en el epitelio. Mantenga la sección de tejido frío cubriéndolo con tampón enfriado con hielo de bicarbonato de Krebs-Ringer (KBR).
2. Abra el intestino longitudinalmente con unas tijeras. Incubar las secciones intestinales recién extirpadas en helado, gaseado KBR que contiene indometacina 1 M durante 10 min antes de la seromuscular de extracción.
3. Pin de la sección intestinal (~ 1 cm de longitud) del lado de la mucosa hacia abajo a una placa que contiene 7% de agarosa o elastómero de silicona curado (0,5 cm de espesor).
4. Pelar las capas seromusculares bajo un microscopio estereoscópico de disección con iluminación de fondo. Cortar la capa seromuscular utilizando una hoja de bisturí pluma. Utilice unas pinzas finas para obtener el borde de la capa a lo largo del eje longitudinal del intestino.
   NOTA: Durante el proceso de extracción, la iluminación de la parte inferior del microscopio estereoscópico ayuda a identificar y evitar las zonas con placas de PeyerES.
5. Después de la finalización de la Stripping seromuscular, montar la mucosa cuidadosamente sobre los pasadores de un medio de la cámara de Ussing. Durante todo el proceso, tenga cuidado para mantener el tejido de la mucosa despojado por los bordes para evitar que se rompa.

5. La equilibración y de tratamiento de tejido

1. Preparar la solución de Krebs: NaCl 115 mM, _NaHCO3 25 mM, 2,4 mM de K ₂ HPO _4, 1,2 mM _CaCl2, 1,2 mM de MgCl _2, y 0,4 mM KH ₂ PO ₄ a pH 7.4, gaseado con un 95% _{de O2} / 5% _{de CO2} a 37 ° C. Añadir glucosa 10 mM al baño seroso para servir como sustrato energético y manitol 10 mM al baño de la mucosa para mantener el equilibrio osmótico.
   NOTA: la solución de Krebs se complementa con ácido L-ascórbico (100 M) y pargilina (100 mM, inhibidor de monoamina oxidasa) para evitar la degradación intracelular 5-HT.
2. Insertar el control deslizante en la cámara para exponer tanto el Si (luminal) apicalde y el lado basolateral (seroso) del tejido a la solución de Kreb.
3. Después de un periodo de equilibrio de 10 min, el tratamiento previo del tejido ileal con fluoxetina (10 M) durante 30 min en el lado apical de J _ms (de flujo de la mucosa a la serosa).
4. Tratar el tejido con TGF-β1 (10 ng / ml) durante 1 h en el lado basolateral y luego incubar con ³ [H] -5-HT (20 nM) durante 30 min en el lado apical.

6. Cuantificación de las mucosas de Serosal Flux (J _m) y ³ [H] -5-HT La acumulación en el tejido

1. Recoger 0,75 ml de alícuotas de la serosa depósito (total de 5 ml) para medir la radiactividad en un contador de centelleo líquido y para calcular mucosal a serosal (J _ms) velocidades de flujo; fluoxetina sensible flujo representa SERT mediada por ^la captación ^{de 3} [H] -5-HT.
2. Para evitar diferencias de presión hidrostática a través de la mucosa durante un período de flujo, tomar muestras de lado seroso y recolocarlos con volúmenes iguales de medio de baño.
   NOTA: El cálculo de flujo corrige para la dilución de la muestra final (4,25 ml / 5 ml = 0,85).
3. Para la cuantificación de ³ [H] -5-HT acumulado en el tejido, desmontar la mucosa de la corredera, se lava una vez con tampón KRB enfriado con hielo, y lo coloca en tubos de cultivo de vidrio.
4. Incubar la mucosa en 0,5 ml de KOH al 10% durante la noche a 37 ° C. Medir la radioactividad en alícuotas de 150 l de los lisados ​​(por triplicado) utilizando un contador de centelleo líquido.
5. Use alícuotas (3-5 mu l) de los lisados ​​para medir la concentración de proteínas utilizando el método de Bradford.
   NOTA: 10 ml de medio de incubación que contiene la serotonina radiactivo se utiliza como un estándar. 5-HT retenido en el tejido se expresa como pmol / mg de proteína / min.

Resultados

La inmunotinción en 3D Caco-2 quistes se muestra en la Figura 1. Una imagen representativa de un plano XY que muestra lumen bien delimitadas en el quiste 3D teñidas con faloidina actina se representa en la Figura 1A. El lado que da al lumen denota el lado apical. Las células epiteliales cultivadas en un entorno 3D resultado en un fenotipo epitelial robusto. Diferentes Caco-2 quistes en día 12, cuando la actina y SERT fueron co-manchado, se muestran e...

Discusión

Monocapas de Caco-2 de células completamente diferenciadas se han utilizado ampliamente como polarizado monocapas epiteliales para estudiar el transporte intestinal ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Sin embargo, para imitar la organización fisiológica de las células epiteliales intestinales, ha habido un considerable interés en e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X PBS	ATCC	ATCC® HTB­37™	Cells
10X PBS	Carl Zeiss		Microsope for confocal Imaging
3[H]-5-HT	LabtekII	152453	Culturing cells for microscopy
5-HT	Gibco	70013-032	Not a hazardous substance
95%O2- 5%Co2 cylinder	KPL	71-00-27	Not a hazardous substance
Agar (for Agar plates)	Fischer	BP151-100	Acute toxicity, Ora
Agar (for electrode)	Sigma	G7126-1KG	Not a hazardous substance
Alexa FluorPhalloidin	Sigma	C3867-1VL	Not a hazardous substance
BSA	Sigma	P6148-500G	Harmful if swallowed or if inhaled
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	Not a hazardous substance
CaCo2 Cells	Sigma	A8806-5G	Not a hazardous substance
Cell lysis Buffer	Fischer	BP337-100	Not a hazardous substance
Chabered slides	Sigma	S5886-1KG	Not a hazardous substance
Collagen Type-1Solution	Sigma	S8045-500G
Electrodes	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco by Life Technologies	25200-056
Fetal bovine serum	Corning	356234	Used as Extracellular matrix
Fluoxetine	Qiagen	74104
Gentamicin	ATCC	30-2003	Cell culture Media
Glycin	Cell Signaling, Danvers, MA
Hepes	Roche	11836145001
Indomethacin	Gibco by Life Technologies	15070-063
K2HPO4	Gibco by Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco by Life Technologies	15630-080
L-ascorbic acid	Gibco by Life Technologies	10082147
Liquid scintillation counter	Gibco by Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Physiologic Instruments, San Diego, CA	EM-CSYS-8
Mannitol	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2304
Matrigel	Physiologic Instruments, San Diego, CA	VCC MC8
MgCl2	Physiologic Instruments, San Diego, CA	DM MC6
Multichannel Voltage/current Clamp	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2300
NaCl	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	S5886
Normal Goat Serum (10%)	Fisher Scientific, Hampton, NH	S233
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	C3881
Protein assay reagent	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	10420
Proteinase Inhibitor Cocktail	MEDOX, Chicago, IL	style G- 12300
RNA easy Mini kit	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	M4125
Single Channel Electrode Input Module	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A92902
Sliders for snapwell Chambers	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	H9523
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	F132
Sodium-Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	T7039
TGF-β1	Perkin-Elmer,Waltham, MA	NFT1167250UC
TritonX-100	Packard Instruments, Downers Grove, IL	B1600
Trypsin EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories, Hercules, CA	5000006
Ussing Chamber (chamber only)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	I7378
Ussing Chamber Systems	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A1296