Metodi per studiare epiteliale Trasporti funzione delle proteine ​​e di espressione in nativo Intestino e Caco-2 cellule coltivate in 3D

Riepilogo

Descriviamo semplici metodi per studiare la regolazione del trasportatore della serotonina intestinale funzione (SERT) e l'espressione utilizzando una cella modello in vitro cultura di cellule Caco-2 cresciuto in 3D e un modello ex vivo di intestino di topo. Questi metodi sono applicabili allo studio di altri trasportatori epiteliali.

Abstract

L'epitelio intestinale ha importanti funzioni di trasporto e di barriera che giocano un ruolo chiave nei normali funzioni fisiologiche dell'organismo fornendo una barriera per particelle estranee. Impaired trasporto epiteliale (ioni, nutrienti, o farmaci) è stata associata a molte malattie e può avere conseguenze che si estendono al di là delle normali funzioni fisiologiche dei trasportatori, ad esempio influenzando l'integrità epiteliale e microbioma intestinale. La comprensione della funzione e regolazione delle proteine ​​di trasporto è essenziale per lo sviluppo di migliori interventi terapeutici. La sfida più grande nello studio del trasporto epiteliale sta sviluppando un sistema modello adatto che ricapitola le caratteristiche importanti delle cellule epiteliali intestinali nativi. Diversi modelli in vitro di colture cellulari, come ad esempio Caco-2, T-84, e le cellule HT-29-Cl.19A sono tipicamente utilizzati nella ricerca sui trasporti epiteliale. Queste linee cellulari rappresentano un approccio riduzionista per modellare la postapithelium e sono stati utilizzati in molti studi meccanicistici, tra cui l'esame delle interazioni epiteliali-microbica. Tuttavia, monostrati cellulari non riflettono accuratamente le interazioni cellula-cellula e il microambiente in vivo. Cellule coltivate in 3D hanno dimostrato essere promettente modelli per Studi permeabilità droga. Abbiamo dimostrato che cellule Caco-2 in 3D possono essere utilizzati per studiare trasportatori epiteliali. È inoltre importante che gli studi in cellule Caco-2 sono integrate con altri modelli per escludere effetti specifici di cellule e tener conto della complessità dell'intestino nativo. Diversi metodi sono stati usati in precedenza per valutare la funzionalità dei trasportatori, come sac estroflesso e uptake in cellule epiteliali isolate o in vescicole di membrana plasmatica isolati. Prendendo in considerazione le sfide nel campo rispetto ai modelli e la misura della funzione di trasporto, dimostriamo qui un protocollo di crescere cellule Caco-2 in 3D e descrivere l'uso di una camera di Ussing comeapproccio efficace per misurare il trasporto della serotonina, come ad esempio negli epiteli intestinali polarizzate intatti.

Introduzione

L'epitelio intestinale è dotato di varie proteine ​​di trasporto (canali, ATPasi, co-trasportatori e scambiatori) che eseguono numerose funzioni che vanno dal l'assorbimento di nutrienti, elettroliti, e farmaci per la secrezione di fluido e ioni nel lume. proteine ​​di trasporto generano gradienti elettrochimici che permettono il movimento di ioni o molecole in modo vettoriale. Questo risultato è ottenuto dalle distribuzioni asimmetriche dei sistemi di trasporto nelle membrane apicale e basolaterale delle cellule epiteliali polarizzate. Inoltre, giunzioni strette, che Tether cellule epiteliali adiacenti, svolgono un ruolo importante in questo processo servendo come un ostacolo alla diffusione intramembrane di componenti tra i domini di membrana apicale e basolaterale. Sistemi modello appropriato che mimano queste caratteristiche dell'intestino nativo (cioè polarità, la differenziazione e l'integrità di giunzione a tenuta) sono fondamentali per lo studio della functionalità dei sistemi di trasporto epiteliali.

Per quanto riguarda i modelli, le linee cellulari tipiche utilizzate attualmente nella ricerca sui trasporti epiteliale intestinale sono Caco-2, un modello di completamente differenziata, assorbenti piccole cellule epiteliali intestinali; e le cellule T84 o HT-29 subclones, modelli di grandi cellule epiteliali intestinali cripta di derivazione ^1. Convenzionalmente, queste linee cellulari sono coltivate come monostrati in superfici in plastica o in inserti Transwell rivestiti. Trans pozzetti di coltura cellulare inserti in qualche misura assomigliano l'ambiente in vivo consentendo cellule polarizzate per alimentare basolaterally. Tuttavia, una limitazione in sistemi di coltura 2D convenzionali è che le cellule sono costretti ad adattarsi ad una superficie artificiale, piatta e rigida. Pertanto, la complessità fisiologica degli epiteli nativa non è accuratamente riflette in un sistema 2D. Questa limitazione è stato superato con metodi per crescere le cellule in 3D in un microambiente specifico, ad esempio Mixtur proteina gelatinosae, contenente una varietà di componenti della matrice extracellulare ^{2, 3.} Tuttavia, le colture in vitro non possono simulare la complessità dell'epitelio intestinale, che ha più tipi di cellule e un'architettura specifica regione nell'intestino. Così, gli studi che utilizzano modelli di colture cellulari richiedono ulteriori convalida a livello intestinale nativo. Utilizzando la coltura cellulare in vitro 3D e della mucosa intestinale del mouse, descriviamo qui semplici metodi per studiare la regolazione del trasportatore della serotonina intestinale (SLC6A4, SERT).

Il trasportatore SERT regola la disponibilità extracellulare di un ormone importante neurotrasmettitore, 5-idrossitriptamina (5-HT), mediante una rapida trasportandolo attraverso un Na ⁺ / Cl ^- processo -dipendente. SERT è un bersaglio noto di anti-depressivi e ha recentemente emerso come un nuovo bersaglio terapeutico di disturbi gastrointestinali, come diarrea e infiammazione intestinale.Metodi per indagare 5-HT uptake in cellule epiteliali intestinali sono stati precedentemente descritto. Ad esempio, Caco-2 cellule cresciute su supporti plastici o inserti permeabili hanno dimostrato di presentare fluoxetina sensibile ³ H-5-HT uptake in entrambi i domini apicali e basolaterale ^4. La misurazione della funzione SERT in isolato pennello Border membrana vescicole (BBMVs) preparato da donatori di organi umani intestino tenue è stata descritta anche da noi ^{5. 3} uptake H-5-HT in BBVMs umani è dimostrata fluoxetina sensibili e Na ⁺ / Cl ^- -dipendente, ed espone la cinetica di saturazione con K _m di 300 nM ^5. Utilizzando metodi simili, abbiamo anche precedentemente misurato funzione SERT come ³ H-5-HT assorbimento nel topo BBMVs intestinali ^6. Tuttavia, la preparazione di vescicole di membrana plasmatica puri richiede una grande quantità di mucosa tessuti. Altri metodi, come la radiogvisualizzazione raphic di ³ siti di assorbimento H-5-HT, hanno anche dimostrato in precedenza nella cavia e topo piccolo intestino ^7.

La camera di Ussing fornisce un sistema più fisiologico per misurare il trasporto di ioni, nutrienti e farmaci attraverso vari tessuti epiteliali. Il vantaggio principale della tecnica della camera Ussing è che permette la misurazione precisa dei parametri elettrici e di trasporto dei intatta, epitelio intestinale polarizzata. Inoltre, per ridurre al minimo l'influenza del sistema neuromuscolare intrinseca, strippaggio seromuscular della mucosa intestinale può essere eseguita per studiare la regolazione dei trasportatori nell'epitelio ^8.

Abbiamo dimostrato che cellule Caco-2 cresciute in 3D sulla proteina gelatinosa formano un lume cave che esprimono i marcatori apicale e basolaterale distinte. Queste cellule mostrano più alta espressione di SERT di 2D cellule Caco-2. I metodi per crescere le cellule in 3D e per perform immunostaining o RNA e proteine ​​di estrazione sono descritti. Inoltre, si descrivono i metodi per studiare la funzione del SERT e regolazione con il TGF-β1, una citochina pleiotropica, in piccola mucosa intestinale, utilizzando una tecnica di camera di Ussing.

Protocollo

1. Studio di intestinale Trasportatori in un sistema di coltura 3D di Caco-2: 3D crescente Caco-2 colture cellulari su una miscela proteica Gelatinoso

1. fattore di crescita Scongelare ridotto miscela proteica gelatinosa in ghiaccio per 8 h (o O / N) a 4 ° C. Una volta scongelato, fare 1 ml o 500 aliquote microlitri per l'uso o conservare a -20 ° C per un uso successivo.
2. Il giorno della cultura, preraffreddare le piastre di coltura (per RNA e proteine ​​di estrazione) o diapositive Pompilius (per immunostaining) su ghiaccio. Aggiungere 30 ml di miscela proteica gelatinosa in ciascun pozzetto di una sagoma di vetro a camera a otto bene (o 120 ml per pozzetto di un 6-pozzetti) e distribuiti in modo uniforme. Fare attenzione a non generare bolle d'aria durante il processo.
3. Porre i vetrini / piastre all'interno di un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C per 15 - 30 min e lasciare che la miscela proteica gelatinosa solidificare.
4. Mentre la miscela proteica gelatinoso solidificazione, trypsinize un pallone confluenti di cellule Caco-2.
5. Contare il numerodi cellule e girare a 500 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in 3D Caco-2 Medium, se necessario.
6. Seed le diapositive da camera di vetro a 4.000 cellule per pozzetto (per piatti, 20.000 per pozzetto). Lasciare le cellule di crescere in un 5% CO ₂ incubatore umidificato a 37 ° C. Cambiare media ogni 3 - 4 d.

2. immunofluorescenza colorazione per epiteliale Trasportatori in 3D cellule Caco-2: 1 ° giorno

1. Aspirare il mezzo e fissare le cellule con 400 ml di 2% paraformaldeide (PFA) (in PBS con il pH regolato a 8,5 con NaOH) per 30 minuti a RT.
   NOTA: soluzione PFA non deve essere conservata per più di 1 settimana a 4 ° C, e la soluzione preparata può essere utilizzato. ATTENZIONE: PFA è altamente tossico e un potenziale cancerogeno. Maneggiare sempre con cautela in una cappa chimica e l'utilizzo di dispositivi di protezione individuale.
2. Lavare i pozzetti due volte con PBS 1x e conservare i campioni a 4 ° C in PBS (400 microlitri /bene). Una volta fissato, conservarli a 4 ° C per un massimo di una settimana.
3. Riscaldare le diapositive da camera a RT (questo si indurisce il letto miscela proteica gelatinosa e rendere più facile per aspirare durante le fasi di lavaggio).
4. Permeabilize le cellule con 0,5% Triton in PBS per non più di 15 min.
5. Preparare tampone PBS-glicina (130 mM NaCl, 7 mm Na ₂ HPO _4, 3,5 mm NaH ₂ PO _4, e 100 mm Glycine). Lavare 3x con PBS 1x-glicina per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente.
6. Preparare tampone di immunofluorescenza (IF): 130 mm NaCl, 7 mm Na ₂ HPO _4, 3,5 mm NaH ₂ PO _4, 100 mM glicina, 7,7 mM NaN _3, 0,1% di BSA, 0,2% TritonX-100, e 0,05% di Tween-20 .
7. Lavare 3x in se il buffer per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente. Blocco a 5% Normal Goat Serum (NGS) nel tampone IF. Incubare con l'anticorpo primario diluito in IF + 1% di siero di capra, 200 microlitri / bene, per 1 - 2 ore a temperatura ambiente. Lavare con tampone IF 3x per 10 minuti ciascuno.
8. Incubare con l'anti secondariacorpo (1: 200) diluito in IF + 1% NGS, 200 microlitri / pozzetto, per 1 ora a RT.
9. Lavare con tampone IF tre volte per 10 minuti ciascuno. Mantenere le diapositive nel buio da questo passo. Sollevare le camere plastica dai vetrini ponendo il vetrino camera in un supporto bianco e scorrevole un sollevatore bianco attraverso il supporto fino suoi contatti bordo del bordo dei pozzetti. Tirare delicatamente le camere (il titolare e sollevatore dovrebbe venire con le diapositive di cultura).
10. Montare con anti medio-lenta dissolvenza e lasciare asciugare per 10 minuti a temperatura ambiente.
11. Una volta asciugato completamente, sigillare i vetrini con smalto e loro immagine con microscopia confocale. Conservare i vetrini a 4 ° C per due settimane oa -20 ° C per diversi mesi.

3. RNA e proteine ​​Estrazione da 3D cellule Caco-2

1. Trattare le cellule coltivate in miscela proteica gelatinose per 12 - 14 d con un agente di test, come β1 TGF- (10 ng / ml, 1 h).
2. Dopo il trattamento, lavare le cellule con 1x PBS. Mantenere le cellule in ghiaccio per 30 min per liquefare il miscuglio proteinico gelatinosa.
3. Lavare i pozzetti con refrigerata PBS e raccogliere le cellule in provette da centrifuga singoli. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a bassa velocità a 500 xg e 4 ° C per 10 min. Estrarre l'RNA utilizzando le procedure standard e utilizzare in tempo reale RT-PCR.
4. Per l'estrazione di proteine, la lisi delle cellule con 1x tampone di lisi cellulare integrato con inibitore della proteasi cocktail 1x. Dopo l'aggiunta di tampone di lisi cellulare al pellet, lisare le cellule mediante sonicazione e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 7.500 xg e 4 ° C per 10 min.

4. Misura della 5-HT assorbimento nel topo Ileum Utilizzando una Camera Ussing: intestinale Preparazione e Seromuscular Spogliarello

1. Dopo l'eutanasia, sezionare i topi e rimuovere il piccolo intestino (dopo lo stomaco e prima del cieco). Dividere il piccolo intestino in tre parti. Eliminare il terzo mezzo, utilizzare il terzo prossimalecome digiuno, e utilizzare il terzo distale come ileo. Evitare di tirare l'intestino dal suo attaccamento mesenterica per evitare di danneggiare l'epitelio. Tenere il freddo sezione di tessuto coprendolo con ghiacciata Krebs-Ringer bicarbonato (KBR) tampone.
2. Aprire l'intestino longitudinalmente con le forbici. Incubare sezioni intestinali asportati recentemente nelle ghiacciata, gassing KBR contenente 1 mM indometacina per 10 minuti prima che il seromuscular stripping.
3. Pin la sezione intestinale (~ 1 cm di lunghezza) della mucosa rivolto verso il basso ad un piatto contenente 7% di agarosio o elastomero silicone vulcanizzato (spessore 0,5 cm).
4. Striscia gli strati seromuscular allo stereomicroscopio dissezione con illuminazione di fondo. Tagliare lo strato seromuscular utilizzando una lama di bisturi piuma. Utilizzare una pinza sottile per ottenere il bordo dello strato lungo l'asse longitudinale dell'intestino.
   NOTA: Durante la procedura di stripping, l'illuminazione di fondo dello stereomicroscopio aiuta a identificare ed evitare le zone con la patch di Peyeres.
5. Dopo il completamento del strippaggio seromuscular, montare la mucosa attenzione sui perni di una semicamera Ussing. Durante tutto il processo, fare attenzione a tenere il tessuto mucoso spogliato dai bordi per evitare di strapparla.

5. Equilibration e trattamento del tessuto

1. Preparare la soluzione di Krebs: 115 mm NaCl, 25 mM NaHCO _3, 2,4 mm K ₂ HPO _4, 1,2 mm CaCl _2, 1,2 mm MgCl ₂ e 0,4 mm KH ₂ PO ₄ a pH 7,4, gasati con il 95% O _2/5% CO ₂ a 37 ° C. Aggiungere 10 mM di glucosio al bagno sierosa per servire come substrato energetico e 10 mM di mannitolo al bagno mucosa per mantenere l'equilibrio osmotico.
   NOTA: soluzione di Krebs è completato con l'acido L-ascorbico (100 mM) e pargilina (100 pM, inibitore di monoammina ossidasi) per impedire la degradazione intracellulare 5-HT.
2. Inserire il cursore nella camera per esporre sia il (luminale) si apicalede e il (sierosa) lato basolaterale del tessuto di soluzione di Krebs.
3. Dopo un periodo di equilibrazione di 10 min, pretrattare il tessuto ileale con fluoxetina (10 pM) per 30 min sul lato apicale per J _ms (flusso mucosa-to-sierosa).
4. Trattare il tessuto con TGF-β1 (10 ng / ml) per 1 h sul lato basolaterale e poi incubare con ³ [H] -5-HT (20 nM) per 30 min sul lato apicale.

6. Quantificazione delle mucose per sierosa Flux (J _ms) e ³ [H] -5-HT accumulo nel tessuto

1. Raccogliere 0,75 aliquote mL dal serbatoio sierosa (totale di 5 ml) per misurare la radioattività in un contatore a scintillazione liquida e per il calcolo della mucosa-to-sierosa (J _ms) tassi di flusso; fluoxetina sensibile flusso rappresenta SERT-mediata ³ [H] -5-HT assorbimento.
2. Per evitare differenze di pressione idrostatica attraverso la mucosa durante un periodo di flusso, prelevare campioni dal lato sierosa e rimetterli con volumi identici di media bagno.
   NOTA: Il calcolo del flusso corregge per la diluizione del campione finale (4.25 mL / 5 ml = 0.85).
3. Per la quantificazione dei ³ [H] -5-HT accumulato nel tessuto, smontare la mucosa dal cursore, lavare una volta con tampone KRB ghiacciata, e metterlo in tubi di coltura in vetro.
4. Incubare la mucosa in 0,5 mL di 10% KOH notte a 37 ° C. Misurare la radioattività in 150 microlitri aliquote dei lisati (in triplice copia) utilizzando un contatore a scintillazione liquida.
5. Utilizzare aliquote (3 - 5 microlitri) dei lisati per misurare la concentrazione di proteine ​​utilizzando il metodo Bradford.
   NOTA: 10 mL di mezzo di incubazione contenente serotonina radioattiva è utilizzato come standard. 5-HT trattenuto nel tessuto è espressa come pmol / mg proteine ​​/ min.

Risultati

Immunocolorazione in 3D Caco-2 cisti è mostrato in Figura 1. Una immagine rappresentativa di un piano XY mostrando lume ben delimitate-in cisti 3D macchiato di falloidina actina è mostrata in figura 1A. Il lato rivolto verso il lume denota il lato apicale. Le cellule epiteliali in coltura in un risultato ambiente 3D in un robusto fenotipo epiteliale. Diversi Caco-2 cisti il giorno 12, quando actina e SERT sono stati co-macchiato, sono mostrati in

Discussione

Monostrati di cellule Caco-2 completamente differenziati sono stati ampiamente utilizzati come polarizzato monostrati epiteliali per studiare il trasporto intestinale ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Tuttavia, per imitare l'organizzazione fisiologica delle cellule epiteliali intestinali, c'è stato un considerevole interesse ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X PBS	ATCC	ATCC® HTB­37™	Cells
10X PBS	Carl Zeiss		Microsope for confocal Imaging
3[H]-5-HT	LabtekII	152453	Culturing cells for microscopy
5-HT	Gibco	70013-032	Not a hazardous substance
95%O2- 5%Co2 cylinder	KPL	71-00-27	Not a hazardous substance
Agar (for Agar plates)	Fischer	BP151-100	Acute toxicity, Ora
Agar (for electrode)	Sigma	G7126-1KG	Not a hazardous substance
Alexa FluorPhalloidin	Sigma	C3867-1VL	Not a hazardous substance
BSA	Sigma	P6148-500G	Harmful if swallowed or if inhaled
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	Not a hazardous substance
CaCo2 Cells	Sigma	A8806-5G	Not a hazardous substance
Cell lysis Buffer	Fischer	BP337-100	Not a hazardous substance
Chabered slides	Sigma	S5886-1KG	Not a hazardous substance
Collagen Type-1Solution	Sigma	S8045-500G
Electrodes	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco by Life Technologies	25200-056
Fetal bovine serum	Corning	356234	Used as Extracellular matrix
Fluoxetine	Qiagen	74104
Gentamicin	ATCC	30-2003	Cell culture Media
Glycin	Cell Signaling, Danvers, MA
Hepes	Roche	11836145001
Indomethacin	Gibco by Life Technologies	15070-063
K2HPO4	Gibco by Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco by Life Technologies	15630-080
L-ascorbic acid	Gibco by Life Technologies	10082147
Liquid scintillation counter	Gibco by Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Physiologic Instruments, San Diego, CA	EM-CSYS-8
Mannitol	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2304
Matrigel	Physiologic Instruments, San Diego, CA	VCC MC8
MgCl2	Physiologic Instruments, San Diego, CA	DM MC6
Multichannel Voltage/current Clamp	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2300
NaCl	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	S5886
Normal Goat Serum (10%)	Fisher Scientific, Hampton, NH	S233
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	C3881
Protein assay reagent	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	10420
Proteinase Inhibitor Cocktail	MEDOX, Chicago, IL	style G- 12300
RNA easy Mini kit	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	M4125
Single Channel Electrode Input Module	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A92902
Sliders for snapwell Chambers	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	H9523
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	F132
Sodium-Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	T7039
TGF-β1	Perkin-Elmer,Waltham, MA	NFT1167250UC
TritonX-100	Packard Instruments, Downers Grove, IL	B1600
Trypsin EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories, Hercules, CA	5000006
Ussing Chamber (chamber only)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	I7378
Ussing Chamber Systems	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A1296