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요약

우리는 3 차원으로 성장 카코 -2 세포를 시험관 내 세포 배양 모델 및 마우스 창자의 생체 모델을 이용하여 장내 세로토닌 운반체 (SERT) 기능과 발현의 조절을 연구하는 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법은 다른 상피 수송의 연구에 적용 할 수있다.

초록

장 상피 세포는 이물질에 대한 장벽을 제공하면서 신체의 정상적인 생리 기능에 중요한 역할을 중요 전송 및 장벽 기능이 있습니다. 손상된 상피 전송 (이온 영양 또는 약물)는 많은 질환과 관련되어 있으며, 상피 무결성 및 장내 마이크로 바이 영향으로 같은 컨베이어의 정상적인 생리 학적 기능을 넘어 연장 결과를 가져올 수있다. 기능 및 수송 단백질의 조절을 이해하는 것은 개선 된 치료 적 개입의 발전을 위해 중요하다. 상피 수송의 연구에서 가장 큰 문제는 네이티브 장 상피 세포의 중요한 기능 되풀이되었습니다 적합한 모델 시스템을 개발하고있다. 예컨대 카코-2, T-84, 및 HT-29 세포 Cl.19A 여러 시험 관내 세포 배양 모델은 일반적으로 상피 전송 연구에 사용된다. 이 세포주는 전자를 모델링에 환원 접근 방식을 나타냅니다pithelium 및 상피 미생물 작용들의 검사를 포함한 다양한 역학적 연구에서 사용되어왔다. 그러나, 세포 단일 층 정확하게 세포 - 세포 상호 작용과 생체 내 미세 환경을 반영하지 않습니다. 3D에서 자란 세포는 약물 투과 연구 모델 유망한 것으로 도시 하였다. 우리는 3 차원의 카코 -2 세포는 상피 수송을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 카코 2 세포 연구는 세포 특정 효과를 배제하고 계정에 기본 대장의 복잡성을 다른 모델로하고 있습니다 것이 중요하다. 여러 방법들이 이전에 이러한 절연 상피 세포 또는 절연 세포막 소포에 everted SAC와 같은 흡수 수송의 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 모델에 대한 및 수송 기능의 측정을 고려하여 현장에서 문제를 가지고, 여기에서 3D 카코 -2 세포 성장과 같은 Ussing 챔버의 사용을 설명하기위한 프로토콜을 보여효과적인 접근법은 그대로 편광 장내 상피 같이 세로토닌 수송을 측정한다.

서문

장 상피 세포는 루멘에 유체의 분비 및 이온 다양한 수송 단백질 (채널, -ATPase를, 공동 운송 및 기) 영양소, 전해질의 흡수에 이르기까지 다양한 기능을 수행하고, 마약을 갖추고있다. 수송 단백질이 방식의 vectorial 이온 또는 분자의 이동을 허용하는 전기 화학적 구배를 생성한다. 이것은 편광 상피 세포의 정단 및 기저 세포막 반송 시스템의 비대칭 분포에 의해 달성된다. 또한, 인접하는 상피 세포 밧줄 단단한 접합부는 꼭대기 및 기저 멤브레인 도메인 사이 intramembrane 성분의 확산에 대한 장벽으로서이 과정에서 중요한 역할을한다. 네이티브 소장의 이러한 특징적인 기능을 흉내 낸 적합한 모델 시스템 (즉, 극성, 분화, 꽉 접합 무결성)은 능의 연구에 중요한상피 교통 시스템의 된 스위치들.

모델에 관해서는, 장 상피 전송 연구에 현재 사용되는 전형적인 세포주는 카코이 완전히 분화의 모델이다 소장 상피 세포를 흡수; 및 T-84 세포 또는 HT-29 서브 클론, 토굴에서 파생 된 큰 장 상피 세포 하나의 모델. 통상적으로, 이러한 세포 라인은 플라스틱 표면에 단일 층 또는 코팅 된 트랜스 웰 인서트에서 재배된다. 어느 정도 트랜스 웰 세포 배양 인서트 편광 세포 basolaterally 공급할 수 있도록하여 생체 내 환경을 닮은. 그러나, 종래의 2 차원 배양 시스템에 제한은 세포가 인공 편평하고 단단한 표면에 적응하도록 강요된다는 것이다. 따라서, 원시 상피 생리 복잡성 정확하게 차원 시스템에 반영되지 않는다. 이 제한은 예컨대 젤라틴 단백질 mixtur 같은 특정 미세 차원에서 세포를 성장하는 방법에 의해 극복되었다즉, 세포 외 매트릭스 성분 (2, 3)의 종류를 포함. 그럼에도 불구하고, 체외 배양 여러 세포 유형과 장내 영역 특정 구조를 갖는 장 상피의 복잡성을 시뮬레이션 할 수있다. 따라서, 세포 배양 모델을 이용하여 연구를 기본 대장에 추가 검증을 요구한다. 체외 3D 세포 배양 및 마우스 장 점막을 사용하여, 우리는 장 세로토닌 수송 (SLC6A4, SERT)의 조절을 연구하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명합니다.

의존적 과정 - SERT 수송이 급격히 나 + / CL을 통해 운반하여, 중요한 호르몬 및 신경 전달 물질 5- 하이드 록시 (5-HT)의 세포 외 가용성을 조절한다. SERT는 항우울제의 알려진 대상 최근 설사와 장의 염증과 같은 위장관 질환의 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다.방법은 장내 상피 세포에서 5-HT의 흡수가 이전에 기술 된 조사합니다. 예를 들어, 플라스틱 또는 투과성 지지체 인서트 성장 카코 -2 세포는 정단 및 기저 영역에서 모두 4 플루옥세틴 성 3 H-5-HT 흡수를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 인간 장기 기증자 소장으로부터 제조 된 절연 브러시 테두리 막 소포 (BBMVs)에 SERT 함수의 측정은 또한 우리 (5)에 의해 설명되었다. 인간 BBVMs 3 H-5-HT 흡수는 플루옥세틴 성 및 나트륨 + / CL 것으로 나타났다 - 의존성과는 300 K에서 5 nM의 m 포화 동력학을 나타내었다. 유사한 방법을 활용, 우리는 이전에 마우스 장 BBMVs 6 세 H-5-HT 흡수로 SERT 기능을 측정 하였다. 그러나, 순수한 세포막 소포의 제조 조직 점막 많은 양을 필요로한다. 예 radiog 같은 다른 방법3 H-5-HT 흡수 사이트의 raphic 시각화는 또한 기니 돼지와 쥐 소장 (7) 이전에 표시되었습니다.

Ussing 챔버 여러 상피 조직에 걸쳐 이온, 영양분, 약물의 이동을 측정하는 이상의 생체 시스템을 제공한다. Ussing 챔버 기술의 주요 장점은 그대로 편광 장 상피의 전기 및 전송 파라미터의 정확한 측정을 가능하게한다는 것이다. 또한, 내장 신경 근육 시스템의 영향을 최소화하기 위해, 장 점막의 seromuscular 박리는 상피 8 수송의 조절을 조사하기 위해 수행 될 수있다.

우리는 젤라틴 단백질에 3D로 성장 카코이 세포는 별개의 혀끝과 기저 마커를 발현하는 중공 루멘을 형성하는 것을 보여줍니다. 이 세포들은 2D 카코이 세포에 비해 SERT의 높은 표현을 보여줍니다. 방법 3D 세포를 성장하고 퍼가기하기rform의 면역 염색 또는 RNA 및 단백질 추출 기술되어있다. 또한, 우리는 Ussing 챔버 기술을 이용하여, 소장 점막 TGF-β1하는다면 발현 성 시토 킨에 의해 SERT 및 규제 기능을 연구하는 방법을 설명한다.

프로토콜

젤라틴 단백질 혼합물에 성장 3D 카코 2 세포 배양 : 카코 2의 3D 문화 시스템에 소장 전송기 1. 연구

  1. 해동 성장 인자는 8 시간 동안 얼음에 젤라틴 단백질 혼합물을 감소 (또는 O / N) 4 ℃에서. 일단 1 mL를하거나 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 사용하거나 보관 500 μL 씩을, 해동.
  2. 문화의 날, 얼음에 문화 (RNA 및 단백질 추출을위한) 판 또는 (면역 염색 용) 챔버 슬라이드를 사전 냉각. 여덟 잘 챔버 유리 슬라이드 (또는 6 웰 플레이트의 웰 당 120 μL)의 각 웰에 젤라틴 단백질 혼합물의 30 μL를 추가하고 균일하게 확산. 과정에서 기포가 발생하지 않도록주의하십시오.
  3. (15) 37 ℃에서 세포 배양 용 인큐베이터 안에서 슬라이드 / 플레이트 플레이스 - 30 분, 젤라틴 단백질 혼합물을 응고 할 수있다.
  4. 젤라틴 단백질 혼합물이 응고하는 동안, 카코 -2 세포의 합류 플라스크를 Trypsinize.
  5. 수를 계산세포의 5 분 탁상 원심 분리기 500 XG에서 그들을 스핀. 필요한 3D 카코이 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시.
  6. (플레이트 잘 당 20,000) 잘 4,000 세포에서 유리 챔버 슬라이드를 시드. 세포를 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 성장 가습 할 수있다. 4 D - 매체 매 3을 변경합니다.

3D 카코이 세포의 상피 전송기 2. 면역 형광 염색법 : 1 일

  1. 배지를 흡인하고 RT에서 30 분 동안 (NaOH로 8.5로 조정하여 pH PBS)에서 2 % 파라 포름 알데히드 400 μL (PFA)으로 세포를 고정한다.
    주 : PFA 용액을 39 ° C에서 이상 1 주간 저장해서는 안되며 갓 만든 용액을 사용할 수있다. 주의 : PFA는 매우 독성 및 잠재적 인 발암 물질이다. 항상 화학 후드주의 및 개인 보호 장비를 사용하여 그것을 처리 할 수 ​​있습니다.
  2. (1X PBS로 두 번 우물을 씻어 PBS에 4 ° C에서 슬라이드를 저장하는 400 μL /잘). 일단 고정, 최대 일주일 동안 4 ° C에 저장합니다.
  3. RT로 챔버 슬라이드 (이는 젤라틴 단백질 혼합물 층을 경화하고, 세척 단계 동안에 흡하기 쉽게 만들) 가온.
  4. 더 이상 15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤으로 세포를 Permeabilize 하시려면.
  5. PBS-글리신 완충액 (130 mM의 염화나트륨, 7 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 100 mM의 글리신)을 준비합니다. RT에서 10 분마다 1X PBS-글리신과 함께 배를 씻어.
  6. 면역 완충액 (IF)를 제조 하였다 : 130 mM의 염화나트륨을 7 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 100mM의 글리신, 7.7 mM의 NaN이 3, 0.1 % BSA, 0.2 % 트리톤-100, 0.05 % 트윈 -20 .
  7. IF의 워시 배 실온에서 10 분마다 버퍼. 5 %의 블록 IF 버퍼에 정상 염소 혈청 (NGS). IF + 1 % 염소 혈청 희석 차 항체, 200 μL에 품어 / 웰, 1 - 실온에서 2 시간. 10 분마다 IF 버퍼 3 배 씻으시오.
  8. 이차 항에 품어본체 (1 : 200)을 실온에서 1 시간 동안, IF + 1 % NGS 200 μL / 웰의 희석.
  9. 10 분마다 IF 버퍼로 3 회 씻는다. 이 단계에서 어둠 속에서 슬라이드를 유지합니다. 가장자리 연락처 우물의 가장자리까지 홀더를 통해 흰색 리프터 검은 색 홀더에 챔버 슬라이드를 배치하고 슬라이딩하여 유리 슬라이드에서 플라스틱 챔버를 들어 올립니다. 조심스럽게 챔버 (홀더 및 리프터는 문화 슬라이드와 함께합니다)를 잡아 당깁니다.
  10. 느린 안티 - 페이드 매체를 탑재하고 실온에서 10 분간 건조 할 수 있습니다.
  11. 완전히 건조되면, 매니큐어 및 공 초점 현미경과 이미지를 함께 슬라이드를 밀봉. 2 주 또는 몇 달 동안 -20 ° C에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.

3D 카코 -2 세포 3. RNA와 단백질 추출

  1. 이러한 TGF-β1의 같은 시험 제제와 함께 14 일 (10 NG / ㎖, 1H) - (12) 젤라틴 단백질 혼합물에서 배양 세포를 처리한다.
  2. 치료 후 1 셀을 씻어X PBS. 30 분은 젤라틴 단백질 혼합물을 액화하는 얼음에 세포를 유지합니다.
  3. 냉장 PBS로 우물을 세척하고 각각의 원심 분리기 튜브에 세포를 수집합니다. 500 × g으로 10 분간 4 ℃에서 저속 원심 분리하여 세포를 수집한다. 표준 절차를 사용하여 RNA를 추출하고 실시간 RT-PCR을 사용합니다.
  4. 단백질 추출을 위해, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (1X)로 보충 된 세포 용해 완충액을 사용하여 세포를 용균. 펠렛을 세포 용해 완충액을 첨가 한 후, 초음파 처리로 세포를 용균 및 7,500 × g으로 10 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거한다.

Ussing 챔버 활용 마우스 회장의 5-HT 통풍 관 4. 측정 : 창자 준비 및 Seromuscular 스트립 댄스

  1. 안락사 후, 쥐를 해부하고 (위 후 맹장 전) 작은 창자를 제거합니다. 세 부분으로 소장을 나눈다. 중간 제를 폐기 근위 제를 사용공장으로, 그리고 회장 등 원위 세 번째를 사용합니다. 상피의 손상을 방지하기 위해 장간막 첨부 파일에서 장을 당겨하지 마십시오. 얼음처럼 차가운 크렙스 - 링거 중탄산 (KBR) 버퍼를 덮어 조직 섹션 감기를 유지합니다.
  2. 세로로 가위를 사용하여 장을 엽니 다. KBR은 seromuscular를 제거하기 전에 10 분 동안 1 μM의 인도 메타 신 (indomethacin)를 포함하는 가스를 발산, 얼음처럼 차가운에서 갓 절제 장 섹션을 품어.
  3. 7 % 아가 로스 또는 경화 된 실리콘 엘라스토머 (0.5 cm 두께)를 포함하는 플레이트에 아래 장내 부 (길이 1 ~ cm) 점막 측에 핀.
  4. 바닥 조명 해부 실체 현미경 하에서 seromuscular 층을 제거. 깃털 메스 블레이드를 사용하여 seromuscular 층을 잘라. 소장의 길이 방향 축을 따라 층의 에지를 얻는 미세 집게를 사용한다.
    참고 : 제거 절차 동안, 실체 현미경의 바닥 조명 파이어 판으로 영역을 파악하고 방지하는 데 도움이에스.
  5. seromuscular 탈기 종료 후, 반 Ussing 챔버의 핀을 잘 점막 마운트. 전체 과정 동안, 찢어지지 않도록 가장자리에 의해 제거 점막 조직을 유지하도록주의하십시오.

5. 평형 및 조직 치료

  1. Kreb의 용액 조제 : 115 mM의 염화나트륨, 25 mM의 NaHCO3을을 2.4 mM의 K 2 HPO 4, 1.2 mM의 CaCl2를 1.2 밀리미터의 MgCl 2, 95 % O 2 / 5 %로 가스실 pH가 7.4에서 0.4mm의 KH 2 PO 4, 37 ° C에서 CO 2. 삼투압 균형을 유지하기 위해 점막 화장실에 에너지 기판과 10 mM의 만니톨로 사용하기 위해 장막 욕조에 10 mM의 포도당을 추가합니다.
    참고 Kreb의 용액을 세포 내 5-HT의 열화를 방지하기 위해 L 아스코르브 산 (100 μM) 및 질라 (100 μM, 모노 아민 옥시 다제 억제제)로 보충된다.
  2. 꼭대기 (내강)시 모두 노출 챔버로 슬라이더를 삽입드와 Kreb의 솔루션에 대한 조직의 기저 (장막) 측.
  3. 10 분의 평형 기간 후, J 밀리 초 (점막 - 투 - 장막 플럭스)의 정점 측에 30 분 동안 플루옥세틴 (10 μM)과 회장 조직을 전처리.
  4. 기저 측에서 1 시간 동안 TGF-β1 (10 NG / mL)로 조직을 치료하고 근단 측에서 30 분 동안 3의 H] -5-HT (20 ㎚)와 함께 배양한다.

장막 플럭스 (J 밀리 초) 및 3의 H] 티슈에 -5-HT의 축적에 점막의 6 정량화

  1. 액체 섬광 계수기의 방사능을 측정하고 점막 - 투 - 장막 (J 밀리 초) 유동 비율을 계산하기 위해 (총 5 ㎖의)에 장막 저수지에서 0.75 mL를 분취 액을 수집; 플루옥세틴에 민감한 플럭스는 3 [H] -5-HT 흡수를 SERT이 매개 나타냅니다.
  2. 장막 측과 재에서 샘플을 채취, 플럭스 기간 동안 점막에서 수압 차이를 방지하려면목욕 매체의 동일한 볼륨에 배치합니다.
    참고 : 플럭스 계산은 최종 샘플 (4.25 ㎖ / 5 ㎖ = 0.85)의 희석 수정합니다.
  3. 3의 H] 조직에 축적 -5-HT의 정량화를 들어, 슬라이더에서 점막을 분리 얼음처럼 차가운 KRB 버퍼로 한번 씻어, 유리 문화 튜브에 넣습니다.
  4. 밤새 37 ° C에서 10 % KOH 0.5 ㎖의 점막 부화. 액체 섬광 계수기를 사용하여 (삼중)에 용 해물을 150 μL 씩의 방사능을 측정한다.
  5. 브래드 포드 (Bradford) 방법을 이용하여 단백질 농도를 측정 해물의 - (5 μL 3) 분취 량을 사용한다.
    주 : 방사성 세로토닌을 함유하는 배양 배지 10 mL를 표준으로 사용된다. 5-HT는 pmol의 / mg protein / min으로 산출되는 조직에서 유지.

결과

3D 카코 2 낭종의 면역 염색은 그림 1과 같다. 팔로이 딘의 굴지 염색 차원 낭종에 잘 경계가 루멘을 나타내는 XY 평면의 대표적인 이미지는도 1a에 도시되어있다. 루멘에 직면 측면은 혀끝의 측면이다. 강력한 상피 표현형의 3D 환경의 결과에서 배양 상피 세포. 액틴과 SERT 공동 염색 하루 12에 다른 카코 2 낭종은 그림 1B에 표시됩니다. XY...

토론

장내 트랜스 10, 11, 12, 13, 14, 15 공부 상피 단층 편광으로 완전히 분화 카코 -2 세포 단층을 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 장 상피 세포의 생체 조직을 모방하는 3 차원의 카코 -2 문화의 발달에 상당한 관심이 있었다. 장 상피 세포에 대한 3 차원 ...

공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10X PBSATCCATCC® HTB­37™Cells
10X PBSCarl ZeissMicrosope for confocal Imaging
3[H]-5-HT LabtekII152453Culturing cells for microscopy
5-HT Gibco70013-032Not a hazardous substance
95%O2- 5%Co2 cylinderKPL71-00-27Not a hazardous substance
Agar (for Agar plates)FischerBP151-100Acute toxicity, Ora
Agar (for electrode)SigmaG7126-1KGNot a hazardous substance
Alexa FluorPhalloidinSigmaC3867-1VLNot a hazardous substance
BSASigmaP6148-500GHarmful if swallowed or if inhaled
CaCl2LifeTechnologiesA12380Not a hazardous substance
CaCo2 CellsSigmaA8806-5GNot a hazardous substance
Cell lysis Buffer FischerBP337-100Not a hazardous substance
Chabered slidesSigmaS5886-1KGNot a hazardous substance
Collagen Type-1SolutionSigmaS8045-500G
ElectrodesSigmaS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
 Fetal bovine serumCorning356234Used as Extracellular matrix
FluoxetineQiagen74104
 GentamicinATCC30-2003Cell culture Media
GlycinCell Signaling, Danvers, MA
Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco by Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco by Life Technologies15710-064
KOHGibco by Life Technologies15630-080
L-ascorbic acid Gibco by Life Technologies10082147
Liquid scintillation counter Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, CA EM-CSYS-8
MannitolPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2304
MatrigelPhysiologic Instruments, San Diego, CA VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, San Diego, CA DM MC6
Multichannel Voltage/current ClampPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2300
NaClPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2023-100
NaClFisher Scientific, Hampton, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, St Louis, MOS5886
Normal Goat Serum (10%)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, St Louis, MOP288
Pen-StrpSigma-Aldrich, St Louis, MOC3881
Protein assay reagentSigma-Aldrich, St Louis, MO10420
Proteinase Inhibitor CocktailMEDOX, Chicago, IL style G- 12300
RNA easy Mini kitSigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
Single Channel Electrode Input Module Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
Sliders for snapwell ChambersSigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
Sodium Phosphate (Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
Sodium-Hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β1Perkin-Elmer,Waltham, MANFT1167250UC
TritonX-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsin EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
Ussing Chamber (chamber only)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Ussing Chamber SystemsSigma-Aldrich, St Louis, MOA1296

참고문헌

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