Методы исследования эпителиальной транспортной функции белков и выражение в Native кишка и Сасо-2 клеток, выращенных в 3D

Резюме

Описаны простые методы для изучения регуляции кишечной функции переносчика серотонина (SERT) и выражения с использованием экстракорпорального клеточной культуры модели в ЦАС-2 клеток , выращенных в 3D и ех естественных условиях модель кишечника мыши. Эти методы применимы к изучению других эпителиальных транспортеров.

Аннотация

Эпителий кишечника имеет важные транспортные и барьерные функции, которые играют ключевую роль в нормальных физиологических функций организма, обеспечивая барьер для посторонних частиц. Недостатками эпителиальной транспорт (ионов, питательных веществ, или наркотики) было связано со многими заболеваниями и может иметь последствия, которые выходят за рамки нормальных физиологических функций транспортеров, например путем оказания влияния на целостность эпителия и кишечника микробиомом. Понимание функции и регулирование транспортных белков имеет решающее значение для развития улучшенных терапевтических вмешательств. Самой большой проблемой в изучении эпителиального транспорта разрабатывает подходящую модель системы, которая резюмирует важные особенности нативных клеток эпителия кишечника. Существует несколько моделей в пробирке для культивирования клеток, такие как Сасо-2, Т-84 и НТ-29-Cl.19A клетки , как правило , используются в эпителиальной транспортных исследований. Эти клеточные линии представляют собой редукционистскую подход к моделированию еpithelium и использовались во многих механистических исследований, в том числе их изучения эпителиально-микробной взаимодействия. Однако клеточные монослои не точно отражают межклеточных взаимодействий и в естественных условиях микросреды. Клетки, выращенные в 3D показали перспективность модели для исследования проницаемости для лекарственных средств. Показано, что клетки Сасо-2 в 3D могут быть использованы для изучения эпителиальные транспортеров. Кроме того, важно, что исследования в клетках Сасо-2 дополнены другими моделями, чтобы исключить специфические клеточные эффекты и принимать во внимание сложность нативной кишечника. Существует несколько методов были ранее использованы для оценки функциональности транспортеров, таких как вывернутой мешочка и поглощение в изолированных эпителиальных клетках или в изолированных плазматических мембранных везикул. Принимая во внимание проблемы в области по отношению к моделям и измерения транспортной функции, мы демонстрируем здесь протокол для роста клеток Сасо-2 в 3D и описывают использование камеры Ussing какэффективный подход для измерения серотонина транспорта, например, в неповрежденных поляризованных кишечных эпителиев.

Введение

Эпителий кишечника оснащен различными транспортными белками (каналы, АТФаз, со-транспортеров и теплообменников), которые выполняют множество функций, начиная от поглощения питательных веществ, электролитов и лекарственных средств к секреции жидкости и ионов в просвете. Транспортные белки генерируют электрохимические градиенты, которые позволяют перемещение ионов или молекул в векторную образом. Это достигается за счет асимметричных распределений транспортных систем в верхушечных и базолатеральных мембран поляризованных эпителиальных клеток. Кроме того, плотные соединения, которые TETHER соседние эпителиальные клетки, играют важную роль в этом процессе, выступая в качестве барьера для внутримембранных диффузии компонентов между апикальной и базолатеральной мембране доменов. Соответствующие модельные системы , имитирующие эти характерные черты родного кишечника (т.е. полярность, дифференцировку и целостность плотные контакты) имеют решающее значение для изучения Functioнальность эпителиальных транспортных систем.

Что касается моделей, типичные клеточные линии, используемые в настоящее время в кишечном эпителиальный транспортного исследования являются Сасо-2, модель полностью дифференцированной клетки, адсорбирующей способностью небольшие эпителиальные клетки кишечника; и Т84 клетки или НТ-29 субклоны, модели крипт полученных крупных эпителиальных клеток кишечника ^1. Обычно, эти клеточные линии выращивают в виде монослоев в пластиковых поверхностей или в покрытых Transwell вставками. Транс-луночный культуральный вставки в некоторой степени похожи на окружающую среду в естественных условиях, позволяя поляризованные клетки кормить базолатерально. Тем не менее, ограничение в обычных системах 2D культуры является то, что клетки вынуждены адаптироваться к искусственной, плоской и жесткой поверхности. Таким образом, физиологическая сложность родного эпителии не может быть точно отражены в 2D системе. Это ограничение преодолевается с помощью методов для роста клеток в 3D в определенной микросреде, например желатиновой белка Mixturд, содержащая множество компонентов внеклеточного матрикса , ^{2, 3.} Тем не менее, в пробирке культуры не может имитировать сложность кишечного эпителия, который имеет несколько типов клеток и региональной специфики архитектуры в кишечнике. Таким образом, исследования с использованием модели клеточной культуры требуют дальнейшей проверки в родном кишечнике. Использование в пробирке 3D культуры клеток и слизистую оболочку кишечника мыши, мы описываем здесь простые методы для изучения регуляции кишечной переносчика серотонина (SERT, SLC6A4).

СЕРТ Транспортер регулирует внеклеточный наличие важного гормона и нейромедиатора 5-гидрокситриптамина (5-НТ), путем быстрого его транспортировки через Na ⁺ / Cl ^- -зависимую процесс. СЕРТ является известным объектом анти-депрессантов и недавно стала новой терапевтической мишенью желудочно-кишечных расстройств, таких как диарея и воспаление кишечника.Методы для исследования поглощения 5-НТ в эпителиальных клетках кишечника были описаны ранее. Например, клетки Сасо-2 , выращенных на пластиковых опорах или проницаемых вставках было показано, обладает флуоксетин-чувствительную ³ поглощение Н-5-HT на обоих апикальной и базолатеральной доменов ^4. Измерение функции SERT в изоляции Пограничные мембраны везикулы (BBMVs) , полученные из донорских органов человека тонкого кишечника также был описан нами ^{5. 3} поглощение Н-5-НТ в человеческих BBVMs было показано, что флуоксетин , чувствительных и Na ⁺ / Cl ^- -зависимая, и она выставлена скорость насыщения с K _м 300 нм ^5. Используя подобные методы, мы также ранее измеряли функцию SERT как ³ поглощения H-5-HT в мышиных кишечных BBMVs ^6. Тем не менее, получение чистых плазматических мембран везикул требует большого количества слизистой ткани. Другие методы, такие как radiographic визуализация ³ H-5-HT сайты захвата, также было показано ранее на морских свинках и крысах тонкого кишечника ^7.

Камера Ussing обеспечивает более физиологическую систему оценки переноса ионов, питательных веществ и наркотиков через различных эпителиальных тканей. Основным преимуществом метода камеры Ussing является то, что она дает возможность точного измерения электрических и транспортных параметров неповрежденной, поляризованного кишечного эпителия. Кроме того, чтобы свести к минимуму влияние внутренней нервно - мышечной системы, seromuscular стриппинг слизистой кишечника может быть выполнена , чтобы исследовать регулирование транспортеров в эпителии ^8.

Показано, что Сасо-2 клетки, выращенные в 3D на желатиновой белка образуют полое просвет экспрессии различных верхушечных и базолатеральных маркеры. Эти клетки демонстрируют более высокую экспрессию SERT, чем 2D-клеток Сасо-2. Методы расти 3D клетки и реrform иммунное или РНК и белка экстракции описаны. Кроме того, мы опишем методы для изучения функции SERT и регулирование с помощью TGF- 1, плейотропных цитокина, при слизистой оболочки тонкой кишки за счет использования техники камеры Ussing.

протокол

1. Изучение Кишечные транспортников в 3D системе культуры СаСО-2: Growing 3D Сасо-2 клеточной культуры на желатиновой смеси белков

1. Оттепели фактор роста снижается желеобразную смесь белка на льду в течение 8 ч (или O / N) при температуре 4 ° С. После оттаивания составит 1 мл или 500 мкл аликвоты для использования или хранить при -20 ° С для последующего использования.
2. В день культуры, предварительно охлаждать культуральные планшеты (для РНК и белка экстракции) или камерных слайдов (для иммунное окрашивание) на льду. Добавить 30 мкл желатиновой белковой смеси в каждую лунку восьми хорошо камерные-стекло (или 120 мкл на лунку 6-луночного планшета) и равномерно. Будьте осторожны, чтобы не генерировать пузырьки воздуха во время процесса.
3. Поместите слайды / пластин внутри культивирования клеток инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 15 - 30 мин и позволяют студенистый протеиновую смесь, чтобы затвердеть.
4. В то время как желеобразные белок смесь застывающих, Trypsinize сливающийся колбу клеток Сасо-2.
5. Подсчитайте числоклеток и спина их при 500g в настольной центрифуге в течение 5 мин. Повторное приостановить осадок клеток в 3D Сасо-2 средних по мере необходимости.
6. Семя стеклянную камеру слайды на 4000 клеток на лунку (для пластин, 20000 на лунку). Дайте клеткам расти в атмосфере 5% СО ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С. Изменение средних каждые 3 - 4 D.

2. Иммунофлуоресценции Окрашивание для эпителиального транспортников в 3D Сасо-2 клеток: 1 день

1. Аспирируйте среды и фиксации клеток с 400 мкл 2% параформальдегида (PFA) (в PBS с рН доводили до 8,5 с помощью NaOH) в течение 30 мин при комнатной температуре.
   Примечание: ПФА раствор не следует хранить в течение более 1 недели при температуре 4 ° С, и свежеприготовленный раствор может быть использован. ВНИМАНИЕ: PFA является высокотоксичным и потенциальным канцерогеном. Всегда обращаться с этим с осторожностью в химической капюшоном и с использованием средств индивидуальной защиты.
2. Промыть лунки дважды с 1x PBS и хранить слайды при температуре 4 ° С в PBS (400 мкл /Что ж). После того, как фиксированной, хранить их при температуре 4 ° С в течение одной недели.
3. Подогреть камере слайды до комнатной температуры (это затвердеть гелеобразную слой смеси белков и сделать его легко аспирата во время промывки).
4. Клетки проницаемыми с 0,5% тритона в PBS в течение не более 15 мин.
5. Приготовьте PBS-буфера глицина (130 мМ NaCl, 7 мМ Na ₂ HPO _4, 3,5 мМ NaH ₂ PO ₄ и 100 мМ глицина). Промыть 3 раза с 1X PBS-глицина в течение 10 мин каждый при комнатной температуре.
6. Подготовьте иммунофлюоресценции буфер (IF): 130 мМ NaCl, 7 мМ Na ₂ HPO _4, 3,5 мМ NaH ₂ PO _4, 100 мМ глицина, 7,7 мМ NaN _3, 0,1% БСА, 0,2% Тритон Х -100, и 0,05% твин-20 ,
7. Вымойте 3x в IF буфере в течение 10 минут каждый при комнатной температуре. Блок в 5% нормальной козьей сыворотки (NGS) в IF буфере. Инкубируйте с первичным антителом, разведенным в IF + 1% козьей сыворотки, 200 мкл / лунку, в течение 1 - 2 ч при комнатной температуре. Мытье с IF буфера 3x в течение 10 минут каждый.
8. Выдержите со вторичным антикорпус (1: 200), разведенного в IF + 1% NGS, 200 мкл / лунку, в течение 1 ч при комнатной температуре.
9. Мытье с IF буфером три раза в течение 10 минут каждый. Хранить слайды в темноте от этого шага дальше. Поднимите пластмассовые камеры из стеклянных пластинках путем не помещая камеру слайд в черном держателе и скольжения белый толкатель через держатель до его края контактов краю лунки. Осторожно потяните вверх камеры (держатель и атлет должен прийти с горок культуры).
10. Монтировать с медленным анти-выцветанию среде и дайте ему высохнуть в течение 10 мин при комнатной температуре.
11. После полного высыхания, печать слайдов с лаком для ногтей и изображения их с конфокальной микроскопии. Хранить слайды при 4 ° С в течение двух недель или при -20 ° С в течение нескольких месяцев.

3. РНК и белка Извлечение из 3D Сасо-2 клеток

1. Обработать клетки, культивируемые на желатиновой белковой смеси в течение 12 - 14 г с тестируемым агентом, таким как TGF-& beta; 1 (10 нг / мл, 1 ч).
2. После лечения мыть клетки с 1х PBS. Сохранить клетки на льду в течение 30 мин для разжижения желеобразную смесь белка.
3. Промыть лунки с охлажденной PBS и собирают клетки в отдельных центрифужные пробирки. Сбор клеток с использованием низкоскоростного центрифугирования при 500g и 4 ° С в течение 10 мин. Извлечение РНК с использованием стандартных процедур и использовать в режиме реального времени RT-PCR.
4. Для экстракции белков, лизиса клеток с помощью 1x буфера для лизиса клеток, дополненной ингибитор протеазы коктейль 1x. После добавления буфера для лизиса клеток к осадку, лизиса клеток с помощью ультразвуковой обработки и удаления остатков клеток путем центрифугирования при 7500 х г и 4 ° С в течение 10 мин.

4. Измерение 5-HT Uptake у мышей подвздошной кишки, использующей Ussing палаты: Кишечные Подготовка и Seromuscular раздевание

1. После эвтаназии, рассекают мышей и удалить тонкую кишку (после того, как желудок и до слепой кишки). Разделить тонкую кишку на три части. Откажитесь средней трети, используйте проксимальной третив тощей, а также использовать в качестве дистальной трети подвздошной. Избегайте потянув кишечник от его брыжейки крепления для предотвращения повреждения эпителия. Держите срез ткани холодом, покрывая его ледяным Кребса-Рингера бикарбоната (KBR) буфера.
2. Откройте кишечник в продольном направлении с помощью ножниц. Выдержите свеже вырезанные кишечника секции в ледяном, газовыделения KBR, содержащий 1 мкМ индометацин в течение 10 мин до seromuscular зачистки.
3. Закрепление раздел кишечника (~ 1 см в длину) в слизистой оболочке стороной вниз на пластину, содержащую 7% агарозы или отвержденного силиконового эластомера (толщиной 0,5 см).
4. Зачистите seromuscular слои под рассечение стереомикроскопа с нижней подсветкой. Вырезать seromuscular слой, используя перо лезвие скальпеля. Использование тонких щипцов, чтобы получить края слоя, расположенные вдоль продольной оси кишки.
   Примечание: Во время зачистки процедуры, нижняя подсветка стереомикроскопа помогает определять и избегать участков с патчем Пейераэс.
5. После завершения seromuscular обнажать, тщательно смонтировать слизистую оболочку на штифтов Ussing половинной камеры. В течение всего процесса, заботиться, чтобы держать оголенный слизистой ткани по краям, чтобы не порвать ее.

5. Уравновешивание и тканей Лечение

1. Приготовьте раствор Кребса: 115 мМ NaCl, 25 мМ NaHCO _3, 2,4 мМ K ₂ HPO _4, 1,2 мМ CaCl _2, 1,2 мМ MgCl ₂ и 0,4 мМ KH ₂ PO ₄ при рН 7,4, в газовых камерах с 95% O _2/5% СО ₂ при 37 ° С. Добавьте 10 мМ глюкозы в серозной ванну, чтобы служить в качестве субстрата энергии и 10 мМ маннитола на слизистую оболочку ванны для поддержания осмотического баланса.
   Примечание: раствор Кребса дополняется L-аскорбиновую кислоту (100 мкМ) и паргилина (100 мкМ, ингибиторы моноаминоксидазы), чтобы предотвратить внутриклеточной деградации 5-HT.
2. Вставьте ползунок в камеру, чтобы выставить как верхушечный (люминальную) сиде и базолатеральный (серозный) сторона ткани в раствор Кребса.
3. После уравновешивания период 10 мин, предварительно обработать ткани подвздошной кишки с флуоксетином (10 мкМ) в течение 30 мин на апикальной стороне для J _мс ( через слизистую оболочку к серозной потока).
4. Рассматривать ткани с TGF- 1 (10 нг / мл) в течение 1 ч на базолатеральной стороне , а затем инкубировать ее с ³ [H] -5-НТ (20 нМ) в течение 30 мин на апикальной стороне.

6. Количественное слизистый до серозной потока (J _мс) и ³ [H] -5-HT аккумуляция в тканях

1. Собирают 0,75 мл аликвоты из серозной резервуара (всего 5 мл) для измерения радиоактивности в жидком сцинтилл ционном счетчике и рассчитать слизистую оболочку к-серозный (J _мс) потока ставок; флуоксетин-чувствительный поток представляет SERT-опосредованной ³ поглощения [H] -5-HT.
2. Чтобы избежать гидростатических перепадов давления через слизистую оболочку в течение периода потока, берут пробы из серозной стороны и вновьразместить их с одинаковыми объемами ванной среды.
   Примечание: Расчет потока корректирует для разбавления конечного образца (4,25 мл / 5 мл = 0,85).
3. Для количественной оценки ³ [H] -5-HT накапливается в тканях, спешиться слизистую оболочку от слайдера, промойте его один раз с ледяным буфером KRB, и поместить его в стеклянные пробирки культуры.
4. Выдержите в слизистую оболочку в 0,5 мл 10% -ного раствора КОН в течение ночи при 37 ° С. Измеряют радиоактивность в 150 мкл аликвоты лизатов (в трех повторах), используя жидкостной сцинтилляционный счетчик.
5. С помощью аликвот (3 - 5 мкл) лизатов для измерения концентрации белка с использованием метода Брэдфорда.
   Примечание: 10 мл инкубационной среды, содержащей радиоактивный серотонин используется в качестве стандарта. 5-НТ сохраняется в ткани выражается в пмоль / мг белка / мин.

Результаты

Иммунологическое в 3D Сасо-2 кист показана на рисунке 1. Представитель образ XY-плоскости , показывающий хорошо разграниченные просвет в 3D кистой , окрашенном фаллоидином актина изображен на рисунке 1А. Сторона, обращенная в просвет обозначает апикальн?...

Обсуждение

Полностью дифференцированные монослоев Сасо-2 клеточные широко использовались в качестве поляризованный эпителиальные монослоев для изучения кишечную транспортировки ^{10, 11, 12, 13, 14,}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X PBS	ATCC	ATCC® HTB­37™	Cells
10X PBS	Carl Zeiss		Microsope for confocal Imaging
3[H]-5-HT	LabtekII	152453	Culturing cells for microscopy
5-HT	Gibco	70013-032	Not a hazardous substance
95%O2- 5%Co2 cylinder	KPL	71-00-27	Not a hazardous substance
Agar (for Agar plates)	Fischer	BP151-100	Acute toxicity, Ora
Agar (for electrode)	Sigma	G7126-1KG	Not a hazardous substance
Alexa FluorPhalloidin	Sigma	C3867-1VL	Not a hazardous substance
BSA	Sigma	P6148-500G	Harmful if swallowed or if inhaled
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	Not a hazardous substance
CaCo2 Cells	Sigma	A8806-5G	Not a hazardous substance
Cell lysis Buffer	Fischer	BP337-100	Not a hazardous substance
Chabered slides	Sigma	S5886-1KG	Not a hazardous substance
Collagen Type-1Solution	Sigma	S8045-500G
Electrodes	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco by Life Technologies	25200-056
Fetal bovine serum	Corning	356234	Used as Extracellular matrix
Fluoxetine	Qiagen	74104
Gentamicin	ATCC	30-2003	Cell culture Media
Glycin	Cell Signaling, Danvers, MA
Hepes	Roche	11836145001
Indomethacin	Gibco by Life Technologies	15070-063
K2HPO4	Gibco by Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco by Life Technologies	15630-080
L-ascorbic acid	Gibco by Life Technologies	10082147
Liquid scintillation counter	Gibco by Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Physiologic Instruments, San Diego, CA	EM-CSYS-8
Mannitol	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2304
Matrigel	Physiologic Instruments, San Diego, CA	VCC MC8
MgCl2	Physiologic Instruments, San Diego, CA	DM MC6
Multichannel Voltage/current Clamp	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2300
NaCl	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	S5886
Normal Goat Serum (10%)	Fisher Scientific, Hampton, NH	S233
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	C3881
Protein assay reagent	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	10420
Proteinase Inhibitor Cocktail	MEDOX, Chicago, IL	style G- 12300
RNA easy Mini kit	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	M4125
Single Channel Electrode Input Module	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A92902
Sliders for snapwell Chambers	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	H9523
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	F132
Sodium-Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	T7039
TGF-β1	Perkin-Elmer,Waltham, MA	NFT1167250UC
TritonX-100	Packard Instruments, Downers Grove, IL	B1600
Trypsin EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories, Hercules, CA	5000006
Ussing Chamber (chamber only)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	I7378
Ussing Chamber Systems	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A1296