Méthodes pour l'étude épithéliale Transport Fonction Protein et expression dans Natif Intestin et Caco-2 cellules cultivées en 3D

Résumé

Nous décrivons des méthodes simples pour étudier la régulation du transporteur de la sérotonine intestinale fonction (SERT) et d' expression en utilisant un modèle in vitro de cellules de culture de cellules Caco-2 cultivées en 3D et un modèle ex vivo de l' intestin de souris. Ces méthodes sont applicables à l'étude d'autres transporteurs épithéliaux.

Résumé

L'épithélium intestinal a des fonctions de transport et de barrières importantes qui jouent un rôle clé dans les fonctions physiologiques normales de l'organisme tout en assurant une barrière à particules étrangères. transports épithéliale avec facultés affaiblies (ions, nutriments, ou des médicaments) a été associé à de nombreuses maladies et peut avoir des conséquences qui vont au-delà des fonctions physiologiques normales des transporteurs, comme en influençant l'intégrité épithéliale et le microbiome intestinal. Comprendre la fonction et la régulation des protéines de transport est essentiel pour le développement d'interventions thérapeutiques améliorées. Le plus grand défi dans l'étude du transport épithélial développe un système modèle approprié qui récapitule les caractéristiques importantes des cellules épithéliales intestinales indigènes. Plusieurs modèles de culture in vitro de cellules, telles que les cellules Caco-2, T-84 et des cellules HT-29-Cl.19A sont généralement utilisés dans la recherche sur le transport epithelial. Ces lignées cellulaires représentent une approche réductionniste à la modélisation de l'epithelium et ont été utilisés dans de nombreuses études mécanistiques, y compris l'examen des interactions épithélium-microbienne. Cependant, les monocouches de cellules ne reflètent pas précisément les interactions cellule-cellule et le micro - environnement in vivo. Les cellules cultivées en 3D ont montré que modèles prometteurs pour les études médicaments de perméabilité. Nous montrons que les cellules Caco-2 en 3D peuvent être utilisées pour étudier les transporteurs épithéliaux. Il est également important que les études de cellules Caco-2 sont complétées par d'autres modèles pour exclure des effets spécifiques de cellules et de prendre en compte la complexité de l'intestin natif. Plusieurs méthodes ont déjà été utilisés pour évaluer la fonctionnalité des transporteurs, tels que le sac évasé et l'absorption dans les cellules épithéliales isolées ou isolées dans des vésicules de membrane plasmique. Prenant en considération les défis dans le domaine par rapport aux modèles et à la mesure de la fonction de transport, nous démontrons ici un protocole de croître cellules Caco-2 en 3D et décrire l'utilisation d'une chambre de Ussing commeapproche efficace pour mesurer le transport de la sérotonine, comme dans les épithéliums intestinales polarisées intactes.

Introduction

L'épithélium intestinal est équipé de diverses protéines de transport (canaux, les ATPases, les co-transporteurs et les échangeurs) qui réalisent de nombreuses fonctions allant de l'absorption des nutriments, des electrolytes, des médicaments et à la sécrétion de fluide et des ions dans la lumière. protéines de transport génèrent des gradients électrochimiques qui permettent le mouvement des ions ou des molécules d'une manière vectorielle. Ceci est réalisé par les distributions asymétriques des systèmes de transport dans les membranes apicales et basolatérales des cellules epitheliales polarisées. En outre, les jonctions serrées, qui longe les cellules épithéliales adjacentes, jouent un rôle important dans ce processus en servant de barrière à la diffusion intramembranaire des composants entre les domaines de la membrane apicale et basolatérale. Des systèmes appropriés de modèles imitant ces traits caractéristiques de l'intestin natif (c. -à -polarité, la différenciation et l' intégrité des jonctions serrées) sont essentielles pour l'étude de la functionalité des systèmes de transport épithéliales.

En ce qui concerne les modèles, les lignes typiques de cellules utilisées actuellement dans la recherche de transport épithéliales intestinales sont Caco-2, un modèle de complètement différenciées, absorbantes petites cellules épithéliales intestinales; et les cellules T84 ou HT-29 sous - clones, les modèles de grandes cellules épithéliales intestinales cryptiques dérivés ^1. Classiquement, ces lignées cellulaires sont cultivées sous forme de monocouches dans des surfaces en plastique ou dans des inserts Transwell revêtus. Trans et des inserts de culture cellulaire dans une certaine mesure proche de l'environnement in vivo en permettant aux cellules polarisées pour alimenter basolatéral. Toutefois, une limitation dans les systèmes de culture 2D classiques est que les cellules sont obligées de s'adapter à une surface artificielle, plate et rigide. Ainsi, la complexité physiologique de l'épithélium natif ne se reflète pas avec précision dans un système 2D. Cette limitation a été résolu par des procédés pour cultiver des cellules en 3D dans un micro-environnement spécifique, comme gélatineux mixtur protéiquee, contenant une variété de composants de matrice extracellulaire ^{2, 3.} Néanmoins, les cultures in vitro ne peuvent pas simuler la complexité de l'épithélium intestinal, qui comporte plusieurs types de cellules et de l' architecture spécifique à la région dans l'intestin. Ainsi, les études utilisant des modèles de culture cellulaire nécessitent une validation supplémentaire dans l'intestin d'origine. Utilisation de la culture in vitro de cellules 3D et intestinale de la souris muqueuse, nous décrivons ici les méthodes simples pour étudier la régulation du transporteur de la sérotonine intestinale (de SLC6A4, SERT).

Le transporteur SERT régule la disponibilité extracellulaire d'une hormone importante et neurotransmetteur 5-hydroxytryptamine (5-HT), en transportant rapidement à travers un Na ⁺ / Cl ^- Procédé -dépendante. SERT est une cible connue d'anti-dépresseurs et a récemment émergé comme une nouvelle cible thérapeutique des troubles gastro-intestinaux, tels que la diarrhée et une inflammation intestinale.Méthodes pour étudier l'absorption de 5-HT dans les cellules épithéliales de l'intestin ont été décrites précédemment. Par exemple, les cellules Caco-2 cultivées sur des supports en plastique ou des inserts perméables se sont révélés présenter une fluoxétine sensible ³ H-5-HT absorption dans les deux domaines apicaux et basolatéraux ^4. La mesure de la fonction SERT en isolé Brush Border vésicules membranaires (BBMV) préparé à partir de donneurs d'organes humains l' intestin grêle a également été décrite par nous ^{5. 3} H-5-HT dans l' absorption BBVMs humains a été démontré que la fluoxetine sensible et Na ⁺ / Cl ^- dépendante, et elle présentait une cinétique de saturation avec un K _m de ⁵ 300 nm. Utilisant des méthodes similaires, nous avons également mesuré précédemment fonction SERT en ³ H-5-HT absorption dans la souris BBMV intestinale ^6. Cependant, la préparation de vésicules de membrane plasmique pur nécessite une grande quantité de la muqueuse tissulaire. D'autres procédés, tels que le radiogvisualisation raphic de ³ sites d'absorption H-5-HT, ont également été montré précédemment dans Guinée porc et de rat petits intestins ^7.

La chambre Ussing fournit un système plus physiologique pour mesurer le transport des ions, des nutriments et des médicaments dans divers tissus épithéliaux. Le principal avantage de la technique de la chambre de Ussing est qu'il permet la mesure précise des paramètres électriques et de transport des intacte, l'épithélium intestinal polarisé. En outre, pour réduire au minimum l'influence du système neuromusculaire intrinsèque, décapage séromusculaire de la muqueuse intestinale peut être effectuée pour étudier la régulation des transporteurs dans l'épithélium ^8.

Nous démontrons que cellules Caco-2 cultivées en 3D sur la protéine gélatineuse forment une lumière creuse exprimant des marqueurs apical et basolatéral distincts. Ces cellules présentent une expression plus élevée de SERT que 2D cellules Caco-2. Méthodes pour cultiver des cellules 3D et peimmunocoloration rform ou de l'ARN et de protéines d'extraction sont décrits. En outre, nous décrivons les méthodes pour étudier le fonctionnement du SERT et la régulation par le TGF-β1, une cytokine pléiotropique, dans une petite muqueuse intestinale en utilisant une technique de la chambre de Ussing.

Protocole

1. Etude de Intestinal Transpalette dans un système de culture 3D de Caco-2: Growing 3D Caco-2 Culture cellulaire sur une protéine mélange gélatineux

1. le facteur de croissance réduit décongeler mélange de protéines gélatineux sur de la glace pendant 8 h (ou O / N) à 4 ° C. Une fois décongelé, faire 1 ml ou 500 aliquotes uL pour utilisation ou conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
2. Le jour de la culture, prérefroidir les plaques de culture (pour l'ARN et de protéines d'extraction) ou diapositives chambré (pour immunocoloration) sur la glace. Ajouter 30 pi de mélange de protéines gélatineuse à chaque puits d'une lame de huit puits chambré-verre (ou 120 pi par puits d'une plaque à 6 puits) et répartir uniformément. Prenez soin de ne pas générer des bulles d'air pendant le processus.
3. Placez les diapositives / plaques à l'intérieur d'un incubateur de culture de cellules à 37 ° C pendant 15 - 30 min et laisser le mélange de protéines gélatineuse se solidifier.
4. Tandis que le mélange de protéines est gélatineux solidification, trypsiniser un ballon confluente de cellules Caco-2.
5. Comptez le nombrede cellules et de spin eux à 500 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min. Remettre en suspension le culot de cellules en 3D Caco-2 Support selon les besoins.
6. Ensemencer les diapositives de la chambre de verre à 4000 cellules par puits (pour les plaques, 20 000 par puits). Permettre aux cellules de se développer dans un incubateur humidifié à 5% de CO ₂ à 37 ° C. Changer le milieu tous les 3 - 4 d.

2. immunofluorescence pour épithéliale Transpalette en 3D cellules Caco-2: Jour 1

1. Aspirer le milieu et fixer les cellules avec 400 ul de 2% de paraformaldehyde (PFA) (dans du PBS avec le pH ajusté à 8,5 avec du NaOH) pendant 30 min à température ambiante.
   NOTE: solution PFA ne doit pas être stocké pendant plus de 1 semaine à 4 ° C, et une solution fraîchement préparée peut être utilisée. ATTENTION: PFA est hautement toxique et cancérigène potentiel. Toujours manipuler avec précaution dans une hotte chimique et en utilisant un équipement de protection individuelle.
2. Rincer les puits deux fois avec 1 x PBS et stocker les diapositives à 4 ° C dans du PBS (400 ul /bien). Une fois fixé, les stocker à 4 ° C pendant une semaine.
3. Réchauffez les diapositives de chambre à RT (cela va durcir le lit de mélange de protéines gélatineuse et de le rendre facile à aspirée pendant les étapes de lavage).
4. Perméabiliser les cellules avec 0,5% de Triton dans du PBS pendant plus de 15 min.
5. Préparer un tampon PBS-glycine (NaCl 130, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3,5 mM NaH ₂ PO _4, et mM Glycine 100). Rincer 3x avec PBS 1x-glycine pendant 10 minutes chacun à RT.
6. Préparer un tampon d'immunofluorescence (IF): NaCl 130, 7 mM de Na ₂ HPO _4, 3,5 mM de NaH ₂ PO ₄ mM , Glycine 100, 7,7 mM de _NaN3, 0,1% de BSA, 0,2% de Triton X-100 et 0,05% de Tween-20 .
7. Laver 3x dans IF tampon pendant 10 minutes chacun à RT. Bloquer dans 5% normal sérum de chèvre (NGS) dans un tampon. Laisser incuber avec l'anticorps primaire dilué dans IF + 1% de sérum de chèvre, 200 ul / puits, pendant 1 - 2 h à température ambiante. Laver avec une solution tampon IF 3x pendant 10 minutes chacun.
8. Laisser incuber avec un anticorps anti secondairecorps (1: 200) dilué dans IF + 1% NGS, 200 pl / puits, pendant 1 h à température ambiante.
9. Laver avec un tampon IF trois fois pendant 10 minutes chacun. Gardez les diapositives dans l'obscurité de cette étape sur. Soulever les chambres de plastique des lames de verre en plaçant la lame de la chambre dans un support noir et blanc glissant avec un dispositif de levage à travers le support jusqu'à ce que ses contacts de bord, le bord des puits. Tirez doucement sur les chambres (le support et lifter devraient venir avec les diapositives de la culture).
10. Monter avec le milieu anti-fade lente et laisser sécher pendant 10 min à température ambiante.
11. Une fois complètement séché, sceller les lames avec le vernis à ongles et de l'image eux avec la microscopie confocale. Stocker les lames à 4 ° C pendant deux semaines, ou à -20 ° C pendant plusieurs mois.

3. ARN et d'extraction des protéines 3D cellules Caco-2

1. Traiter les cellules cultivées sur le mélange de protéines gélatineux pour les 12 - 14 jours avec un agent d'essai, tels que TGF β1 (10 ng / ml, 1 h).
2. Après le traitement, laver les cellules avec 1x PBS. Maintenir les cellules sur la glace pendant 30 minutes pour liquéfier le mélange protéique gélatineuse.
3. Laver les puits avec réfrigérés PBS et recueillir les cellules dans des tubes de centrifugation individuels. Recueillir les cellules par centrifugation à basse vitesse à 500 g et 4 ° C pendant 10 min. Extraire l'ARN en utilisant des procédures standard et utiliser en temps réel RT-PCR.
4. Pour l'extraction des protéines, la lyse des cellules en utilisant 1 x tampon de lyse cellulaire additionné d'un inhibiteur de protéase de cocktail 1x. Après addition d'un tampon de lyse cellulaire au culot, lyser les cellules par sonication et éliminer les débris cellulaires par centrifugation à 7500 x g et 4 ° C pendant 10 min.

4. Mesure de la 5-HT Uptake dans Souris iléon Utilisant une Chambre Ussing: Intestinal Préparation et séromusculaire Stripping

1. Après l'euthanasie, disséquer les souris et enlever les petits intestins (après l'estomac et avant le caecum). Diviser le petit intestin en trois parties. Jeter le tiers médian, utilisez le tiers proximalcomme jéjunum, et utiliser le tiers distal comme iléon. Évitez de tirer l'intestin de son attachement mésentérique pour éviter d'endommager l'épithélium. Gardez la coupe de tissu froid en le couvrant avec du bicarbonate de Krebs-Ringer glacée (KBR) tampon.
2. Ouvrez l'intestin en utilisant longitudinalement ciseaux. Incuber sections intestinales fraîchement excisées dans de la glace-froid, le gazage KBR contenant 1 uM indométacine pendant 10 min avant la séromusculaire stripping.
3. Goupiller la section intestinale (~ 1 cm de longueur) de la muqueuse vers le bas sur une plaque contenant 7% d'agarose ou d'un élastomère de silicone durcie (0,5 cm d'épaisseur).
4. Dépouiller les couches séromusculaire sous un stéréomicroscope de dissection avec éclairage de fond. Couper la couche séromusculaire utilisant une lame plume de scalpel. Utiliser une pince fine pour obtenir le bord de la couche le long de l'axe longitudinal de l'intestin.
   REMARQUE: Au cours de la procédure de décapage, l'éclairage bas de la stéréomicroscope permet d'identifier et d'éviter les zones avec les plaques de Peyeres.
5. Après l'achèvement de l'entraînement à séromusculaire, monter la muqueuse avec précaution sur les broches d'un demi-chambre de Ussing. Pendant tout le processus, prendre soin de tenir le tissu muqueux dépouillé par les bords pour éviter de le déchirer.

5. équilibration et le traitement des tissus

1. Préparer une solution de Kreb: NaCl 115, 25 mM _NaHCO3, 2,4 mM de K ₂ HPO _4, 1,2 mM de _CaCl2, 1,2 mM de _MgCl2 et 0,4 mM de KH ₂ PO ₄ à pH 7,4, gazés avec 95% O _2/5% CO ₂ à 37 ° C. Ajouter 10 mM de glucose dans le bain de séreuse pour servir de substrat énergétique et de mannitol à 10 mM au bain de la muqueuse pour maintenir l'équilibre osmotique.
   REMARQUE: La solution de Kreb est complétée par de l'acide L-ascorbique (100 pM) et de la pargyline (100 uM, un inhibiteur de la monoamine oxydase) afin d'empêcher la dégradation intracellulaire de 5-HT.
2. Insérez le curseur dans la chambre pour exposer à la fois la apicale (luminale) siet de la (séreuse) côté basolatéral du tissu à la solution de Kreb.
3. Après une période d'équilibration de 10 minutes, le tissu iléal prétraiter avec fluoxetine (10 uM) pendant 30 min sur le côté apical J _ms (flux muqueux à séreux).
4. Traiter le tissu avec le TGF-β1 (10 ng / mL) pendant 1 h sur le côté basolatéral puis incuber avec ³ [H] -5-HT (20 nM) pendant 30 min sur le côté apical.

6. Quantification de muqueux à séreuse Flux (J _ms) et ³ [H] -5-HT Accumulation dans le tissu

1. Collecter des aliquotes de 0,75 ml à partir du réservoir séreuse ( un total de 5 ml) pour mesurer la radioactivité dans un compteur à scintillation liquide et pour calculer la muqueuse à la séreuse (J _ms) Taux de flux; fluoxétine sensible flux représente SERT-médiée ³ [H] -5-HT absorption.
2. Pour éviter les différences de pression hydrostatique à travers la muqueuse pendant une période de flux, prélever des échantillons du côté séreux et reles placer avec des volumes identiques de milieu de bain.
   NOTE: Le calcul de flux pour corriger la dilution de l'échantillon final (4,25 ml / 5 ml = 0,85).
3. Pour la quantification de ³ [H] -5-HT accumulée dans le tissu, démonter la muqueuse du curseur, laver une fois avec un tampon KRB glacée, et le placer dans des tubes de culture en verre.
4. Incuber la muqueuse dans 0,5 ml de KOH à 10% pendant une nuit à 37 ° C. Mesurer la radioactivité dans 150 ul de parties aliquotes des lysats (en triple exemplaire) à l'aide d'un compteur à scintillation liquide.
5. Utilisez aliquotes (3-5 pi) des lysats pour mesurer la concentration de protéines en utilisant la méthode de Bradford.
   REMARQUE: 10 ml de milieu d'incubation contenant la sérotonine radioactif est utilisé comme étalon. 5-HT dans le tissu retenu est exprimée en pmol / mg de protéine / min.

Résultats

Immunocoloration en 3D Caco-2 kystes est représenté sur la figure 1. Une image représentative d'un plan XY montrant lumen bien délimitées dans le kyste 3D colorés avec phalloidin actine est représenté sur la figure 1A. Le côté tourné vers la lumière représente le côté apical. Les cellules épithéliales en culture dans un résultat de l'environnement 3D dans un phénotype épithélial robuste. Différents Caco-2 kystes le jour 12, ...

Discussion

Complètement différenciées monocouches Caco-2 cellules ont été largement utilisés en tant que monocouches epitheliales polarisées pour étudier le transport intestinal ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Cependant, pour imiter l'organisation physiologique des cellules épithéliales de l'intestin, il y a eu un intérêt c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X PBS	ATCC	ATCC® HTB­37™	Cells
10X PBS	Carl Zeiss		Microsope for confocal Imaging
3[H]-5-HT	LabtekII	152453	Culturing cells for microscopy
5-HT	Gibco	70013-032	Not a hazardous substance
95%O2- 5%Co2 cylinder	KPL	71-00-27	Not a hazardous substance
Agar (for Agar plates)	Fischer	BP151-100	Acute toxicity, Ora
Agar (for electrode)	Sigma	G7126-1KG	Not a hazardous substance
Alexa FluorPhalloidin	Sigma	C3867-1VL	Not a hazardous substance
BSA	Sigma	P6148-500G	Harmful if swallowed or if inhaled
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	Not a hazardous substance
CaCo2 Cells	Sigma	A8806-5G	Not a hazardous substance
Cell lysis Buffer	Fischer	BP337-100	Not a hazardous substance
Chabered slides	Sigma	S5886-1KG	Not a hazardous substance
Collagen Type-1Solution	Sigma	S8045-500G
Electrodes	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco by Life Technologies	25200-056
Fetal bovine serum	Corning	356234	Used as Extracellular matrix
Fluoxetine	Qiagen	74104
Gentamicin	ATCC	30-2003	Cell culture Media
Glycin	Cell Signaling, Danvers, MA
Hepes	Roche	11836145001
Indomethacin	Gibco by Life Technologies	15070-063
K2HPO4	Gibco by Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco by Life Technologies	15630-080
L-ascorbic acid	Gibco by Life Technologies	10082147
Liquid scintillation counter	Gibco by Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Physiologic Instruments, San Diego, CA	EM-CSYS-8
Mannitol	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2304
Matrigel	Physiologic Instruments, San Diego, CA	VCC MC8
MgCl2	Physiologic Instruments, San Diego, CA	DM MC6
Multichannel Voltage/current Clamp	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2300
NaCl	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	S5886
Normal Goat Serum (10%)	Fisher Scientific, Hampton, NH	S233
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	C3881
Protein assay reagent	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	10420
Proteinase Inhibitor Cocktail	MEDOX, Chicago, IL	style G- 12300
RNA easy Mini kit	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	M4125
Single Channel Electrode Input Module	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A92902
Sliders for snapwell Chambers	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	H9523
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	F132
Sodium-Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	T7039
TGF-β1	Perkin-Elmer,Waltham, MA	NFT1167250UC
TritonX-100	Packard Instruments, Downers Grove, IL	B1600
Trypsin EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories, Hercules, CA	5000006
Ussing Chamber (chamber only)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	I7378
Ussing Chamber Systems	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A1296