Evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo en ratones envejecidos utilizando el método de Golgi-Cox

Resumen

Aquí presentamos un protocolo de Golgi-Cox en detalle extenso. Este método fiable de tinción de tejidos permite una evaluación de alta calidad de la citoarquitectura en el hipocampo, ya lo largo de todo el cerebro, con un mínimo de resolución de problemas.

Resumen

Las espinas dendríticas son las protuberancias de los ejes neuronales dendríticos que contienen sinapsis excitatorias. Las variaciones morfológicas y ramificadas de las dendritas neuronales dentro del hipocampo están implicadas en la cognición y en la formación de la memoria. Existen varios enfoques para la tinción de Golgi, todos los cuales han sido útiles para determinar las características morfológicas de los mandrales dendríticos y producir un fondo claro. El presente método de Golgi-Cox (una ligera variación del protocolo que se proporciona con un kit de tinción de Golgi comercial), fue diseñado para evaluar cómo una dosis relativamente baja del fármaco quimioterapéutico 5-flurouracilo (5-Fu) afectaría a la morfología dendrítica , El número de espinas y la complejidad de la arborización dentro del hipocampo. El 5-Fu moduló significativamente la complejidad dendrítica y disminuyó la densidad de la columna a lo largo del hipocampo de una manera específica de la región. Los datos presentados muestran que el método de tinción de Golgi efFectivamente teñido las neuronas maduras en el CA1, el CA3, y el giro dentado (DG) del hipocampo. Este protocolo informa los detalles de cada paso para que otros investigadores puedan manchar el tejido con fiabilidad a través del cerebro con resultados de alta calidad y solución de problemas mínima.

Introducción

Las dendritas son la mayor parte de las neuronas que reciben y procesan la entrada presináptica ¹ . Sus procesos dendríticos tienen una geometría compleja, donde las ramas proximales tienen un diámetro mayor que las ramas distales. A medida que las dendritas se desarrollan, forman varias conexiones con otras neuronas en un proceso denominado arborización dendrítica. La extensión y el patrón de esta ramificación determina la cantidad de entradas sinápticas que una dendrita puede procesar adecuadamente ² .

La arborización dendrítica es un proceso necesario para la plasticidad dependiente de la actividad y el desarrollo adecuado de los circuitos neuronales. La extensión, la retracción, la ramificación y la sinaptogénesis son procesos intrincados que incluyen programas genéticos intrínsecos e influencias de factores extrínsecos. Las variaciones morfológicas y ramificadas de las dendritas neuronales dentro del hipocampo están implicadas en la cognición y en la formación de la memoriaF "> 3 ^{, 4.} Las alteraciones en la complejidad dendrítica están asociadas con cambios fisiopatológicos y de comportamiento ^{5. Las} anomalías están relacionadas con varios estados patológicos, incluyendo el Síndrome del Frágil X y el Síndrome de Down ⁶ .

Las espinas dendríticas son los compartimentos subcelulares especializados de los arboles dendríticos que reciben entrada excitatoria dentro del sistema nervioso central. Hay tres clases morfológicas de espinas dendríticas, con el nombre de cada clase en función de su tamaño y forma: 1) espinas de hongos, que tienen densidades postsinápticas complejas con más receptores de glutamato que otras espinas ⁷ ; 2) espinas dorsales, que carecen de un tallo; Y 3) espinas delgadas, que consisten en un tallo estrecho prolongado y una cabeza globular ⁸ . El volumen de la columna dendrítica se utiliza en parte para definirlos, con espinas delgadas, generalmente más pequeñas (0,01 μm ³ ) En comparación con las espinas de hongos (0,8 μ m ³ ) ^{9 , 10} . Las espinas se estabilizan con la maduración. Por ejemplo, las espinas delgadas se retraen después de unos días o se convierten en espinas de hongos. Alternativamente, las espinas de hongo son relativamente estables y pueden sobrevivir durante un período prolongado. Se cree que la fuerza de las conexiones neuronales se basa en el número de espinas y / o en su volumen ^{11 , 12 , 13} .

El método clásico de tinción de Golgi y sus variaciones más modernas han sido útiles para examinar la morfología y densidad de la columna dendrítica. Un aspecto único de la tinción de Golgi es que mancha aleatoriamente alrededor del 5% de las neuronas totales, lo que permite el rastreo de las neuronas individuales [ ^{14 , 15]} . Aunque el mecanismo exacto en el que el método de GolgiOd manchas neuronas individuales es todavía desconocido, el principio del método se basa en la cristalización de cromato de plata (Ag ₂ CrO ₄ ) [ ^{16 , 17]} . Hay tres tipos principales del método de Golgi: el Golgi rápido, el Golgi-Cox, y el Golgi-Kopsch ^{18 , 19} . Los tres métodos comienzan con una fase de incubación inicial en sales de cromo durante varios días a meses, pero hay ciertas diferencias clave entre ellos. El Golgi rápido utiliza tetróxido de osmio en el primer paso, mientras que Golgi-Kopsch incluye paraformaldehído. La tinción tanto en el Golgi rápido como en Golgi-Kopsch es seguida por una incubación en una solución de nitrato de plata al 1-2% durante aproximadamente 7 días. El método de Golgi-Cox utiliza cloruro de mercurio y dicromato de potasio en lugar de nitrato de plata y tiene un tiempo de impregnación de 2-4 semanas. Los tejidos se seccionan y se colocan rápidamente en un amoníaco diluido, Seguido por un fijador fotográfico para eliminar las sales. De los tres tipos, se piensa que el método de Golgi-Cox es el mejor en la tinción de los mandrales dendríticos sin mucha interferencia de fondo, en parte, porque los artefactos de cristal no se producen en la superficie del tejido (a diferencia del método de Golgi rápido) ^{17 , 20 , 21} .

El presente método es una ligera variación del protocolo proporcionado con un kit comercial de tinción con Golgi, y fue diseñado para evaluar cómo una dosis relativamente baja del 5-Fu afectaría las características morfológicas dendríticas y la densidad de la columna vertebral. Cualquier información adquirida podría proporcionar más información sobre cómo el tratamiento quimioterapéutico afecta a los circuitos neuronales.

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Protocolo

Los experimentos se realizaron de acuerdo con los estándares éticos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en la UAMS.

1. Animales y paradigma de inyección de 5-Fu

1. Adquiera ratones salvajes de 6 meses de edad de tipo C57Bl6 / J y los aloja bajo un ciclo de luz / oscuridad constante de 12 h hasta que alcancen 1 año de edad.
2. Diluir el 5-Fu en solución salina estéril al 0,9%. Utilizar 60 mg / kg como la dosis requerida por ratón.
3. Administre las inyecciones intraperitoneales del 5-Fu (una vez por semana durante tres semanas).
   1. Administre las inyecciones intraperitoneales alrededor de la misma hora cada día. Por ejemplo, entre las 0900-1200 h.
4. Euthanize los animales y extraer los cerebros 30 días después de la inyección final.

2. Procedimiento de eutanasia y extracción cerebral

1. Retenga el roedor y agarrar la base de la cola. Con la otra mano, coloque el pulgar o el dedoLa base del cuello del roedor. Ponga rápidamente presión en el cuello del roedor y empuje hacia adelante mientras que la otra mano que sostiene la cola tira hacia atrás.
2. Sostenga al roedor con una mano y las grandes tijeras quirúrgicas con la otra. Coloque el cuello del roedor entre las dos cuchillas y rápidamente decapitar la cabeza.
3. Tome la cabeza cortada del ratón, y utilice la tijera fina para recortar la piel sobre el cráneo, hasta los ojos. A continuación, coloque las puntas de las tijeras en cada receptáculo para los ojos y cierre las tijeras con una ligera fuerza.
4. Use tijeras de primavera para cortar el cráneo a la izquierda y la derecha del cerebelo.
5. Use fórceps para levantar la parte del cráneo que rodea el cerebelo directamente hacia arriba y hacia abajo.
6. Utilice las tijeras de resorte para cortar a lo largo de la línea midsagittal del cráneo.
7. Use la pinza para levantar la parte restante del cráneo del cerebro.
8. Utilice una espátula y una sonda para extraer el cerebro en el recipiente deseado. Usando un acero inoxidableCortar cada cerebro a lo largo del plano midsagittal. Lleve a cabo el siguiente método Golgi-Cox en los hemisferios derechos.

3. Coloración de Golgi y preparación de tejidos

1. Sumerja los cerebros recién cosechados en 5 ml de solución a base de cloruro mercúrico (solución A del kit) en un tubo cónico de 10 ml. La solución de cloruro mercúrico es sensible a la luz; Cubra el tubo con papel de aluminio. Almacenar la muestra en la oscuridad a temperatura ambiente.
   NOTA: La solución A se proporciona en el kit que aparece en la tabla de materiales. ¡Precaución! La Solución A (también llamada solución de cloruro mercúrico) contiene reactivos tóxicos tales como dicromato de potasio, cloruro mercúrico y cromato de potasio. Use guantes protectores y trabaje en una campana extractora.
2. Después de 1 día, decantar lentamente la solución en un contenedor temporal (como un barco de pesada grande), y desecharlo en un contenedor de residuos de riesgo biológico. Sumerja los cerebros (todavía en los tubos cónicos originales de 10 ml) con 5 ml deLa solución de cloruro de mercurio, y devolver la muestra a la oscuridad a temperatura ambiente durante 13 días más.
3. Añadir 30 g de tampón de post-impregnación a 90 ml de agua destilada o desionizada (dH2O). Llenar cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 6,5 ml del tampón de post-impregnación, un pocillo por cerebro
   NOTA: El tampón de post-impregnación se proporciona en el kit que aparece en la tabla de materiales.
   1. Después de 14 días (en total) en la solución de cloruro mercúrico, enjuague el tejido con dH $ _₂ $ O, luego transfiérelos en placas de 6 pocillos con tampón de post-impregnación. Cubra las placas con papel de aluminio y guárdelas a temperatura ambiente en la oscuridad.
4. Pipetear el tampón de post-impregnación después de 1 día de inmersión y renovar con tampón de post-impregnación fresco; Almacenar durante 1 día en la oscuridad a temperatura ambiente. Si es necesario, guárdelo a 4 ° C hasta un mes ²² .

4. Seccionando

1. Etiquetar las placas de 12 pocillos en sus tapas con números en orden ascendente de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo.
2. Prepare dos o tres placas de 12 pocillos por cerebro si secciona todo el cerebro.
   1. Etiquetar la parte superior de cada tapa de la placa de 12 pocillos con el número de identificación del cerebro seccionado.
   2. Pipetee 2 mL de 1x PBS en cada pocillo de cada placa.
3. Configurar el escenario y encender el vibratome; Asegúrese de que hay suficiente 1x PBS en el recipiente para cubrir el tejido.
   1. Cortar dos piezas de película de parafina de plástico y doblarlos dos veces. Colóquelas sobre los orificios de las perillas de los porta-muestras para evitar que salga 1x PBS sobre el mostrador.
   2. Coloque la cinta adhesiva sobre el bloque de tejido del soporte del espécimen y luego ponga pegamento adhesivo de cianoacrilato (ver tabla de materiales) sobre el mismo.
4. Retire el cerebro de la placa de 6 pocillos y colóquelo en un plato de plástico o de vidrio. Utilice elDe acero de doble filo para cortar alrededor de la mitad del cerebelo.
   1. Corte el cerebelo caudalmente. Asegúrese de que la porción del cerebelo que queda es par.
5. Coloque inmediatamente la superficie plana del cerebelo restante sobre el pegamento.
   NOTA: La parte dorsal del tejido (la corteza cerebral) debe estar mirando hacia la izquierda o hacia la derecha con respecto a la hoja. El extremo rostral que contenía previamente el bulbo olfatorio adherido debe estar orientado hacia arriba.
   1. Espere al menos unos minutos para asegurarse de que el pegamento se seca completamente.
6. Mientras que el pegamento que está sosteniendo el cerebro en el lugar está secando, vierte 1x PBS en el baño de la muestra. Después de que el pegamento esté seco, coloque el porta-muestras con el tejido en el baño de muestras.
   1. Si la muestra de tejido no está totalmente cubierta, vierta más 1x PBS en el baño de muestra.
7. Fije la cuchilla al soporte de la cuchilla del vibratome y lentamenteColoque la cuchilla en el baño de muestras hasta que quede completamente sumergida en 1x PBS. Continúe bajando la hoja hasta que esté ligeramente por debajo de la parte superior del tejido.
8. Ajuste la velocidad del vibratome a 7, la amplitud a 6, y el ángulo de corte a 12 ° (ver tabla de materiales para el modelo vibratome). Iniciar la vibración y cortar secciones ^de 200 μm ²³ .
   1. Utilice un pincel grande para mover las secciones de tejido del baño de muestras en cada pocillo designado de las placas de 12 pocillos.
9. Continúe cortando el tejido hasta que se alcance el número deseado de secciones de tejido.

5. Post-tinción

1. Para cada uno de los siguientes pasos de tinción y enjuagues, use 2 mL de la solución indicada por pocillo. Utilice un relleno motorizado de la pipeta (vea la tabla de materiales) para transferir las soluciones en los pozos. Utilice una pipeta de transferencia (vea la tabla de materiales) para transferir las soluciones de los pozos a los residuos adecuadosContenedores
2. Enjuague las secciones en un lavado de 30 min de PBS-T 0,01 M (agregue 3,0 ml de detergente (ver tabla de materiales) a 1.000 ml de PBS 0,01 M).
3. Diluir la solución de hidróxido de amonio (Precaución) 3: 5 en volumen con dH ₂ O inmediatamente antes de su uso. Mancha las secciones en la solución diluida de hidróxido de amonio durante 19-21 min.
   1. Proteger la solución de hidróxido de amonio sensible a la luz con papel de aluminio.
      NOTA: El hidróxido de amonio dentro de la solución tiene una concentración de ~ 10% y se clasifica como "peligroso". La solución de hidróxido de amonio puede producir quemaduras si entra en contacto con la piel. Puede causar irritación del tracto respiratorio si se inhala. Use guantes protectores y trabaje en una campana extractora.
4. Mancha las secciones en el tampón post-tinción (añadir 90 g de reactivo D en 500 ml dH ₂ O) durante 19-21 min. El tampón posterior a la tinción es sensible a la luz; Protegerlo con papel ^de aluminio ²² .
5. Enjuague las secciones en tres, 5-10 min lavados de 0,01 M PBS-T.

6. Montaje, limpieza y cubierta

1. Montar las secciones sobre 1% de gelatina recubierto diapositivas con el pincel grande. Deje que se sequen durante 20-30 minutos a temperatura ambiente, y luego colóquelos en un frasco de Coplin durante la noche.
2. Retire los portaobjetos con las manos enguantadas del frasco de Coplin y colóquelos en un estante de plástico (ver tabla de materiales). Coloque la rejilla de plástico en el plato de tinción (ver tabla de materiales) que contiene 100% de etanol. Deshidratarlos con tres lavados de 5 min.
3. Lavar los portaobjetos dos veces durante 5 min cada uno en 99% de xileno. Coloque los portaobjetos en una rejilla de vidrio y baje la rejilla en un plato de tinción de vidrio que contiene xileno con una manija de metal (ver tabla de materiales).
   NOTA: Precaución, el xileno es dañino si se inhala y causa irritación si toca la piel. Es altamente inflamable en estados de líquidos y vapores. Use guantes protectores y trabaje en una campana extractora.
4. Retire las diapositivas del xilEne uno a la vez y rápidamente cubrir el tejido con ~ 0,25 ml de medio de montaje (ver Tabla de Materiales). A continuación, tome las cubiertas de las diapositivas y colóquelas sobre los medios de comunicación.
   1. Empuje las burbujas de aire atrapadas debajo de las cubiertas de la diapositiva hasta el borde con un objeto contundente, como el extremo de un pincel.
5. Coloque las diapositivas en un área alejada de la luz solar y deje que se sequen durante 2-3 días.
6. Proceder a la adquisición de imágenes utilizando un microscopio y analizar con el software adecuado.

7. Adquiere la pila de imágenes

1. Abra el programa de generación de imágenes (consulte Tabla de materiales ). Coloque la diapositiva en el escenario del microscopio. En el menú en la parte superior del programa, haga clic en "Adquisición" y luego haga clic en "Imagen en vivo".
2. Coloque el microscopio en 10X. Identificar la neurona de preferencia y luego llevar el cursor, que aparece como una X roja, en el centro del soma. Haga clic izquierdo para establecer el punto de referencia.
3. Coloque el microscopio en 40X. Haga clic en "Mover" en el menú en la parte superior del programa y luego haga clic en "Para punto de referencia."
4. Comience a crear la pila de imágenes desplazándose manualmente con el fino objetivo por encima del tejido hasta que esté ligeramente fuera de foco.
   1. Haga clic en "Set Top" en la esquina inferior derecha del programa bajo el encabezado "Image Acquisition".
   2. Desplácese ligeramente por debajo del tejido hasta que esté ligeramente desenfocado y luego haga clic en "Establecer fondo" en "Adquisición de imagen". A continuación, haga clic en "Adquirir pila de imágenes".
5. Después de adquirir la pila de imágenes, escriba el nombre deseado para el archivo de imagen en la ventana que aparece. Guarde como "archivo MBF Ascii".
   1. Cuando se le solicite, seleccione el tipo de archivo como "MBF JPEG2000 archivo de pila" y, a continuación, haga clic en "Guardar".

8. Seguimiento neuronal

1. En la toolbaR debajo del menú, haga clic en el cuadro titulado "Contour Name". Seleccione "Soma" en el menú desplegable.
2. Traza manualmente el soma. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione "Finalizar el cuerpo de la célula" cuando finalice el rastreo.
3. Seleccione "AutoNeuron" para abrir otra pestaña titulada "AutoNeuron Workflow".
4. En "Tipo de configuración", seleccione "Nuevo". Configure los parámetros y haga clic en "Next Step" para abrir el subtítulo "Soma Detection".
   1. Para configurar los parámetros, seleccione "Brightfield". A continuación, en "Max Process Diameter", haga clic en "Start Measuring". Usando el cursor, vaya a la base de la dendrita y ajuste manualmente el diámetro.
5. Haga clic en "Sí" en la ventana que solicita al usuario que trace la imagen completa. Traza manualmente el soma. Descomprima y luego haga clic en "Siguiente paso" para abrir el subtítulo "Colocación de semillas".
6. Haga clic en "Validar semillasS "y luego haga clic en" Next Step "para abrir el subtítulo" Neuron Reconstruction ".
7. En "Neuron", haga clic en "Interactive". Realice el rastreo interactivo siguiendo la dirección del programa de las dendritas y haciendo clic con el botón derecho del ratón para completar el área resaltada trazada por el programa. Después de localizar todas las dendritas, haga clic en "Siguiente paso".
8. Cuando aparezca una nueva ventana, guarde la nueva configuración con el título deseado. Clic en Guardar."

9. Análisis

1. Abra el programa de análisis (ver tabla de materiales).
2. Haga clic en "Archivo" en el menú superior y luego haga clic en "Abrir archivo de datos". Seleccione el archivo de interés.
3. Bajo el subtítulo de análisis, seleccione "Sholl Analysis".
4. En la ventana "Análisis Sholl", establezca el radio de inicio a 10 μm. En "Análisis", haga clic en las casillas "Dendritas" y "Sucursales".
5. Derecho clIck las ventanas recién abiertas y haga clic en "Excel Export". Clic en Guardar."
6. Bajo el análisis, haga clic en "Análisis de estructura ramificada". Seleccione "Todos los análisis posibles".
7. Haga clic con el botón derecho en la ventana recién abierta y haga clic en "Exportar Excel" ²⁴ .

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Resultados

Los efectos del tratamiento con 5-Fu sobre la arborización dendrítica y la complejidad en el hipocampo de las secciones cerebrales teñidas con Golgi se cuantificaron y se trazaron utilizando un software de imágenes disponible comercialmente. Tras el rastreo, se analizaron la arborización dendrítica, la densidad de la columna vertebral y la morfología de la columna con el análisis de Sholl y el índice de complejidad dendrítica (ICD). Sholl análisis es un método analítico cuan...

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Discusión

En comparación con técnicas más modernas, el método de Golgi-Cox tiene varias ventajas que lo convierten en el método preferido para examinar la morfología de la columna vertebral: 1) La tinción se puede utilizar para esencialmente cualquier tejido, 2) Una configuración básica de microscopio de luz es todo lo que se necesita para Adquirir imágenes de Golgi, 3) la imagen de Golgi-Cox es más rápida que la imagen confocal y 4) las secciones teñidas de Golgi son viables durante varios meses a años más que las...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
superGolgi Kit	Bioenno Lifesciences	30100	Contains hazardous materials.
PBS 10x powder concentrate	Fisher	BP665-1
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
Permount	Fisher	SP 15-100
Slide cover	Fisher	12-546-14
7 mL Transfer pipette	Globe Scientific	135030
10 mL Falcon tubes	BD Biosciences	352099
Foil	Fisher	01-213-105
12-well plate	BD Biosciences	353043
200 proof Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Xylene	Acros Organics	1330-20-7	Hazardous.
Permabond 200	Permabond LLC	GF2492
25 mL serological pipette	Sigma	SIAL1489
Parafilm	Midsci	HS234526C
Vibratome	World Precision Instruments	NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice	The Jackson Laboratory	000664
Axio Imager 2	ZEISS	Multiple components, see website for details.
AxioCam MRc Camera	ZEISS	426508-9902-000
Staining Dish , Green	Tissue-Tek	62541-12
Staining Dish Set	Electron Microscopy Sciences	70312-20
Motorized Pipet Filler	Fisher	03-692-168
Neurolucida	mbf Bioscience
Neurolucida Explorer	mbf Bioscience
Prism	GraphPad