Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo Golgi-Cox com detalhes detalhados. Este método de mancha de tecido confiável permite uma avaliação de alta qualidade da citoarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro, com solução de problemas mínima.

Resumo

As espinhas dendríticas são as protuberâncias dos eixos dendríticos neuronais que contêm sinapses excitatórias. As variações morfológicas e ramificantes dos dendritos neuronais dentro do hipocampo estão implicadas na cognição e na formação da memória. Existem várias abordagens para a coloração de Golgi, todas as quais foram úteis para determinar as características morfológicas dos corredores dendríticos e produzir um fundo claro. O presente método de Golgi-Cox, (uma pequena variação do protocolo que é fornecido com um kit de coloração Golgi comercial) foi projetado para avaliar como uma dose relativamente baixa do medicamento quimioterápico 5-flurouracil (5-Fu) afetaria a morfologia dendrítica , O número de espinhas e a complexidade da arborização dentro do hipocampo. O 5-Fu modificou significativamente a complexidade dendrítica e diminuiu a densidade da coluna em todo o hipocampo de uma maneira específica da região. Os dados apresentados mostram que o método de coloração de Golgi efManchou os neurônios maduros no CA1, o CA3 e o giro dentado (DG) do hipocampo. Este protocolo relata os detalhes de cada passo para que outros pesquisadores possam manchar de forma confiável tecido em todo o cérebro com resultados de alta qualidade e solução de problemas mínima.

Introdução

Os dendritos são a maior parte dos neurônios que recebem e processam a entrada pré-sináptica ¹ . Seus processos dendríticos têm uma geometria complexa, onde os ramos proximais têm um diâmetro maior do que os ramos distal. À medida que os dendritos se desenvolvem, eles formam várias conexões com outros neurônios em um processo conhecido como arborização dendrítica. A extensão eo padrão dessa ramificação determinam a quantidade de entradas sinápticas que um dendrite pode processar adequadamente ² .

A arborização dendrítica é um processo necessário para a plasticidade dependente da atividade e o desenvolvimento adequado dos circuitos neuronais. Extensão, retração, ramificação e sinaptogênese são processos intrincados que incluem programas genéticos intrínsecos e influências de fatores extrínsecos. As variações morfológicas e ramificantes dos dendritos neuronais dentro do hipocampo estão implicadas na cognição e na formação da memória.As alterações na complexidade dendrítica estão associadas a alterações fisiopatológicas e comportamentais ^{5. As} anormalidades estão relacionadas a vários estados patológicos, incluindo síndrome de X frágil e síndrome de Down ⁶ .

As espinhas dendríticas são os compartimentos subcelulares especializados dos corredores dendríticos que recebem entrada excitatória no sistema nervoso central. Existem três classes morfológicas de espinhas dendríticas, com o nome de cada classe com base no tamanho e na forma: 1) espinhas de cogumelo, que apresentam densidades pós-sinápticas complexas com mais receptores de glutamato do que outras espinhas ⁷ ; 2) espinhos espinhosos, que não possuem tronco; E 3) espinhas finas, que consistem em uma haste prolongada e estreita e uma cabeça globular ⁸ . O volume da coluna dendrítica é usado em parte para defini-los, com espinhas finas geralmente menores (0,01 μm ³ ) Em comparação com as espinhas dos cogumelos (0,8 μm ³ ) ^{9 , 10} . As espinhas se estabilizam com a maturação. Por exemplo, as espinhas finas se retraem após alguns dias ou se desenvolvem em espinhos de cogumelo. Alternativamente, as espinhas dos cogumelos são relativamente estáveis ​​e podem sobreviver durante um período prolongado. A força das conexões neuronais é pensada para ser baseada no número de espinhas e / ou seu volume ^{11 , 12 , 13} .

O método clássico de coloração de Golgi e suas variações mais modernas têm sido úteis para examinar a morfologia e a densidade da coluna dendrítica. Um aspecto único da coloração de Golgi é que ele mancha aleatoriamente cerca de 5% dos neurônios totais, o que permite o rastreamento de neurônios individuais ^{14 , 15} . Embora o mecanismo exato em que a metanfeta de GolgiNão há ainda desconhecidos os neurônios individuais, o princípio do método é baseado na cristalização do cromato de prata (Ag ₂ CrO ₄ ) ^{16 , 17} . Existem três tipos principais do método de Golgi: o Golgi rápido, o Golgi-Cox e o Golgi-Kopsch ^{18 , 19} . Todos os três métodos começam com uma fase inicial de incubação em sais de cromo durante vários dias a meses, mas existem certas diferenças fundamentais entre eles. O Golgi rápido usa o tetróxido de ósmio no primeiro passo, enquanto o Golgi-Kopsch inclui paraformaldeído. A coloração tanto no Golgi quanto no Golgi-Kopsch é seguida por uma incubação em uma solução de nitrato de prata a 1% a 2% durante cerca de 7 dias. O método de Golgi-Cox usa cloreto de mercúrio e dicromato de potássio em vez de nitrato de prata e tem um tempo de impregnação de 2-4 semanas. Os tecidos são então seccionados e colocados rapidamente em amônia diluídaSolução, seguida por um fixador fotográfico para remover os sais. Dos três tipos, pensa-se que o método de Golgi-Cox é o melhor na coloração dos corredores dendríticos sem muita interferência de fundo, em parte, porque os artefatos de cristal não ocorrem na superfície do tecido (ao contrário do método rápido de Golgi) ^{17 , 20 , 21} .

O presente método é uma pequena variação do protocolo fornecido com um kit comercial de coloração de Golgi e foi projetado para avaliar como uma dose relativamente baixa de 5-Fu afetaria as características morfológicas dendríticas e a densidade da coluna vertebral. Qualquer informação adquirida pode fornecer informações adicionais sobre como o tratamento quimioterapêutico afeta os circuitos neuronais.

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Protocolo

As experiências foram realizadas de acordo com os padrões éticos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais na UAMS.

1. Paradigma de animais e 5-Fu Injection

1. Compre ratinhos de tipo selvagem C57Bl6 / J de 6 meses de idade e abrigue-os sob um ciclo constante de 12 h luz / escuridão até atingir o 1 ano de idade.
2. Diluir o 5-Fu em solução salina estéril a 0,9%. Use 60 mg / kg como a dose necessária por mouse.
3. Dê as injeções intraperitoneais do 5-Fu (uma vez por semana durante três semanas).
   1. Dê as injeções intraperitoneais ao mesmo tempo em cada dia. Por exemplo, entre 0900-1200 h.
4. Eutanizar os animais e extrair os cérebros 30 dias após a injeção final.

2. Procedimento de Eutanásia e Extração de Cérebro

1. Conduza o roedor e agarre a base da cauda. Por outro lado, coloque o polegar ou o primeiro dedo no thE base do pescoço do roedor. Pressione rapidamente o pescoço do roedor e empurre para a frente enquanto a outra mão segurando a cauda puxa para trás.
2. Segure o roedor com uma mão e a grande tesoura cirúrgica com a outra. Coloque o pescoço do roedor entre as duas lâminas e rapidamente decapite a cabeça.
3. Pegue a cabeça do mouse cortada e use a tesoura fina para cortar a pele acima do crânio, até os olhos. Em seguida, coloque as pontas das tesouras em cada soquete do olho e feche a tesoura com pouca força.
4. Use a tesoura de mola para cortar o crânio para a esquerda e para a direita do cerebelo.
5. Use fórceps para levantar a parte do crânio em torno do cerebelo diretamente para cima e para fora.
6. Use a tesoura de mola para cortar a linha midsagittal do crânio.
7. Use a pinça para levantar a parte restante do crânio do cérebro.
8. Use uma espátula e uma sonda para colher o cérebro no recipiente desejado. Usando um aço inoxidávelLâmina de corte, corte cada cérebro ao longo do plano midsagital. Execute o seguinte método de Golgi-Cox nos hemisférios direitos.

3. Mancha de Golgi e Preparação de Tecidos

1. Mergulhe os meia-cérebros recém-colhidos em 5 mL de solução à base de cloreto de mercúrio (solução A do kit) em um tubo cônico de 10 mL. A solução de cloreto de mercúrio é sensível à luz; Cubra o tubo com papel alumínio. Armazene a amostra no escuro à temperatura ambiente.
   NOTA: A solução A é fornecida no kit que está listado na tabela de materiais. Cuidado! A solução A (também chamada de solução de cloreto de mercúrio) contém reagentes tóxicos, como dicromato de potássio, cloreto de mercúrio e cromato de potássio. Use luvas de proteção e trabalhe com uma aspiradora.
2. Após 1 dia, decanta lentamente a solução em um recipiente temporário (como um barco de pesagem grande) e descarte-o em um recipiente de resíduos de risco biológico. Mergulhe os cérebros (ainda nos tubos cônicos originais de 10 mL) com 5 mL deA solução de cloreto de mercúrio e devolver a amostra ao escuro a temperatura ambiente por mais 13 dias.
3. Adicione 30 g de tampão pós-impregnação a 90 mL de água destilada ou desionizada (dH2O). Preencha cada poço de uma placa de 6 poços com 6,5 mL do tampão pós-impregnação, um poço por cérebro
   NOTA: O buffer pós-impregnação é fornecido no kit que está listado na tabela de materiais.
   1. Após 14 dias (no total) na solução de cloreto de mercúrio, enxágue o tecido com dH ₂ O e, em seguida, transfira-os para placas de 6 poços com tampão pós-impregnação. Cubra os pratos com papel alumínio e guarde-os à temperatura ambiente no escuro.
4. Pipetar o buffer de pós-impregnação após 1 dia de imersão e renovar com tampão pós-impregnação fresco; Armazene por 1 dia no escuro à temperatura ambiente. Se necessário, armazene isto a 4 ° C por até 1 mês ²² .

4. Seção

1. Rotule as placas de 12 poços em suas tampas com números em ordem crescente da esquerda para a direita e para cima para baixo.
2. Prepare duas ou três placas de 12 poços por cérebro, se estacionar todo o cérebro.
   1. Rotule a parte superior de cada tampa da placa de 12 poços com o número de identificação do cérebro seccionado.
   2. Pipetar 2 mL de 1x PBS em cada poço de cada placa.
3. Configure o palco e ative o vibratome; Certifique-se de que haja 1x PBS no recipiente para cobrir o tecido.
   1. Corte dois pedaços de película de parafina de plástico e dobre-os duas vezes. Coloque-os sobre os orifícios para os botões do suporte do espécime para evitar que 1x PBS vaze no contador.
   2. Coloque a fita no bloco de tecido do suporte do espécime e coloque em seguida cola adesiva de cianoacrilato (ver tabela de materiais).
4. Retire o cérebro da placa de 6 poços e coloque-o sobre um prato de plástico ou de vidro. Use o aço inoxidávelLâmina de aço de dois gumes para cortar cerca de metade do cerebelo.
   1. Corte o cerebelo caudalmente. Certifique-se de que a porção do cerebelo restante é uniforme.
5. Coloque imediatamente a superfície plana do cerebelo restante na cola.
   NOTA: A parte dorsal do tecido (o córtex cerebral) deve estar voltada para a esquerda ou para a direita em relação à lâmina. A extremidade rostral que anteriormente continha a lâmpada olfativa em anexo deve virar para cima.
   1. Espere pelo menos alguns minutos para se certificar de que a cola seca completamente.
6. Enquanto a cola que segura o cérebro no lugar é a secagem, despeje 1x PBS no banho do espécime. Após a cola estar seca, coloque o suporte do espécime com o tecido no banho da amostra.
   1. Se a amostra de tecido não estiver totalmente coberta, despeje mais 1x PBS no banho da amostra.
7. Anexe a lâmina ao suporte da lâmina do vibratome e lentamente lColoque a lâmina no banho do espécime até ficar completamente submersa em 1x PBS. Continue abaixando a lâmina até ficar ligeiramente abaixo da parte superior do tecido.
8. Ajuste a velocidade do vibratoma para 7, a amplitude para 6 e o ​​ângulo de corte para 12 ° (ver tabela de materiais para o modelo vibratome). Comece a vibração e corte as seções ^de 200 μm ²³ .
   1. Use um grande pincel para mover as seções de tecido do banho da amostra em cada poço designado das placas de 12 poços.
9. Continue a cortar o tecido até atingir o número desejado de seções de tecido.

5. Pós-coloração

1. Para cada uma das seguintes etapas de coloração e enxaguamentos, use 2 mL da solução indicada por poço. Use um enchimento de pipeta motorizado (veja tabela de materiais) para transferir as soluções para os poços. Use uma pipeta de transferência (veja tabela de materiais) para transferir soluções para fora dos poços e para dentro dos resíduos adequadoscontainers.
2. Enxaguar as secções em uma lavagem de 30 min de PBS-T 0,01 M (adicionar 3,0 mL de detergente (ver tabela de materiais) a 1.000 mL de PBS 0,01 M).
3. Diluir a solução de hidróxido de amônio (precaução) 3: 5 em volume com dH ₂ O imediatamente antes da utilização. Manchar as secções na solução diluída de hidróxido de amónio durante 19-21 min.
   1. Proteja a solução de hidróxido de amônio sensível à luz com papel alumínio.
      NOTA: O hidróxido de amônio na solução tem uma concentração de ~ 10% e é classificado como "perigoso". A solução de hidróxido de amônio pode produzir queimaduras se entrar em contato com a pele. Pode causar irritação das vias respiratórias se inalado. Use luvas de proteção e trabalhe com uma aspiradora.
4. Manchar as secções no tampão pós-coloração (adicionar 90 g de reagente D em 500 mL de dH2O) durante 19-21 min. O buffer de pós-coloração é sensível à luz; Proteja-o com papel alumínio ²² .
5. Enxaguar as secções em três, 5-10 min lavagens de 0,01 M de PBS-T.

6. Montagem, limpeza e cobertura

1. Monte as seções em 1% de lâminas revestidas de gelatina com o grande pincel. Deixe secar durante 20 a 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, coloque-os em um frasco de Coplin durante a noite.
2. Remova as lâminas com as mãos enluvadas da jarra Coplin e coloque-as em uma prateleira de plástico (ver tabela de materiais). Coloque a prateleira de plástico no prato de coloração (ver tabela de materiais) contendo 100% de etanol. Desidratá-los com três lavagens de 5 min.
3. Lave as lâminas duas vezes por 5 min cada em 99% de xileno. Coloque os slides em uma prateleira de vidro e abaixe a cremalheira em um prato de coloração de vidro contendo xileno com uma alça metálica (ver tabela de materiais).
   NOTA: Cuidado, o xileno é prejudicial se inalado e causa irritação se ele tocar a pele. É altamente inflamável em estados de líquido e vapor. Use luvas de proteção e trabalhe com uma aspiradora.
4. Remova as lâminas do xilEne uma por vez e cobrir rapidamente o tecido com ~ 0,25 mL de mídia de montagem (ver Tabela de materiais). Em seguida, pegue as capas deslizantes e coloque-as sobre a mídia.
   1. Empurre as bolhas de ar presas debaixo das tampas deslizantes para a borda com um objeto contundente, como o fim de um pincel.
5. Coloque os slides em uma área longe da luz solar e deixe secar por 2-3 dias.
6. Proceda à aquisição de imagens usando um microscópio e analise com o software apropriado.

7. Adquira pilha de imagens

1. Abra o programa de imagem (consulte a Tabela de materiais ). Coloque o slide no palco do microscópio. No menu no topo do programa, clique em "Aquisição" e, em seguida, clique em "Imagem ao vivo".
2. Coloque o microscópio em 10X. Identifique o neurônio de preferência e depois traga o cursor, que aparece como um X vermelho, no centro do soma. Clique com o botão esquerdo para definir o ponto de referência.
3. Coloque o microscópio em 40X. Clique em "Mover" no menu na parte superior do programa e depois clique em "Para Ponto de Referência".
4. Comece a criar a pilha de imagens, deslocando manualmente com o objetivo fino acima do tecido até ficar um pouco fora de foco.
   1. Clique em "Set Top" no canto inferior direito do programa sob o título "Aquisição de imagens".
   2. Desloque-se ligeiramente sob o tecido até ficar ligeiramente fora de foco e depois clique em "Definir fundo" em "Aquisição de imagens". Em seguida, clique em "Adquirir pilha de imagens".
5. Após a aquisição da pilha de imagens, digite o nome desejado para o arquivo de imagem na janela que aparece. Salve como "arquivo MBF Ascii".
   1. Quando solicitado, selecione o tipo de arquivo como "arquivo de pilha JPEG 2000 MBF" e clique em "Salvar".

8. Rastreamento neuronal

1. Na ferramentaSob o menu, clique na caixa intitulada "Nome do contorno". Selecione "Soma" no menu suspenso.
2. Trace manualmente o soma. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione "Finalizar o corpo da célula" quando o rastreamento estiver completo.
3. Selecione "AutoNeuron" para exibir outra guia intitulada "AutoNeuron Workflow".
4. Em "Tipo de configuração", selecione "Novo". Defina os parâmetros e, em seguida, clique em "Próximo passo" para exibir a subposição "Soma Detection".
   1. Para definir os parâmetros, selecione "Brightfield". Em seguida, em "Diâmetro máximo do processo", clique em "Iniciar medição". Usando o cursor, vá para a base do dendrite e ajuste manualmente o diâmetro.
5. Clique em "Sim" na janela que pede ao usuário que rastreie toda a imagem. Trace manualmente o soma. Desmarque e clique em "Próximo passo" para exibir a subposição "Colocação de sementeira".
6. Clique em "Validar semente"S "e, em seguida, clique em" Próximo passo "para exibir a subposição" Neuron Reconstruction ".
7. Em "Neuron", clique em "Interactive". Execute o rastreamento interativo seguindo a direção do programa dos dendritos e clique com o botão direito do mouse para completar a área destacada rastreada pelo programa. Depois de rastrear todos os dendritos, clique em "Próximo passo".
8. Depois que uma nova janela aparecer, salve a nova configuração com o título desejado. Clique em "Salvar".

9. Análise

1. Abra o programa de análise (veja a tabela de materiais).
2. Clique em "Arquivo" no menu superior e depois clique em "Abrir arquivo de dados". Selecione o arquivo de interesse.
3. Sob a subposição de análise, selecione "Análise Sholl".
4. Na janela "Análise Sholl", ajuste o raio de partida para 10 μm. Em "Análise", clique nas caixas "Dendritas" e "Ordens de Ramificação".
5. Direito clIck na janela recém-inaugurada e clique em "Exportar Excel". Clique em "Salvar".
6. Sob a análise, clique em "Análise de Estrutura Ramificada". Selecione "Todas as análises possíveis".
7. Clique com o botão direito na janela recém-inaugurada e clique em "Excel Export" ²⁴ .

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Resultados

Os efeitos do tratamento com 5-Fu sobre a arborização dendrítica e a complexidade no hipocampo das seções cerebrais manchadas de Golgi foram quantificados e rastreados usando um software de imagem comercialmente disponível. Após o rastreamento, a arborização dendrítica, a densidade da coluna vertebral e a morfologia da coluna vertebral foram analisadas através da análise de Sholl e do índice de complexidade dendrítica (DCI). A análise de Sholl é um método analítico quan...

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Discussão

Comparado com técnicas mais modernas, o método de Golgi-Cox tem várias vantagens que o tornam o método preferido para examinar a morfologia da coluna: 1) A coloração pode ser usada para essencialmente qualquer tecido, 2) Uma configuração básica de microscópio de luz é tudo o que é necessário para Adquirir imagens baseadas em Golgi, 3) A imagem de Golgi-Cox é mais rápida do que a imagem confocal, e 4) As secções coradas de Golgi são viáveis ​​por vários meses a anos mais do que as amostras que sã...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
superGolgi Kit	Bioenno Lifesciences	30100	Contains hazardous materials.
PBS 10x powder concentrate	Fisher	BP665-1
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
Permount	Fisher	SP 15-100
Slide cover	Fisher	12-546-14
7 mL Transfer pipette	Globe Scientific	135030
10 mL Falcon tubes	BD Biosciences	352099
Foil	Fisher	01-213-105
12-well plate	BD Biosciences	353043
200 proof Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Xylene	Acros Organics	1330-20-7	Hazardous.
Permabond 200	Permabond LLC	GF2492
25 mL serological pipette	Sigma	SIAL1489
Parafilm	Midsci	HS234526C
Vibratome	World Precision Instruments	NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice	The Jackson Laboratory	000664
Axio Imager 2	ZEISS	Multiple components, see website for details.
AxioCam MRc Camera	ZEISS	426508-9902-000
Staining Dish , Green	Tissue-Tek	62541-12
Staining Dish Set	Electron Microscopy Sciences	70312-20
Motorized Pipet Filler	Fisher	03-692-168
Neurolucida	mbf Bioscience
Neurolucida Explorer	mbf Bioscience
Prism	GraphPad