Golgi-Cox法を用いた老齢マウスにおける海馬の樹状突起の複雑さの評価

要約

ここでは、Golgi-Coxプロトコルを詳細に紹介します。この信頼性の高い組織染色法は、最小のトラブルシューティングで、海馬の脳構造の全面的な評価を可能にします。

要約

樹状突起棘は、興奮性シナプスを含むニューロンの樹状突起軸からの隆起である。海馬内のニューロン樹状突起の形態学的および分枝的な変化は、認知および記憶形成に関係している。ゴルジ染色にはいくつかのアプローチがあり、これらのすべてが樹状突起の形態学的特徴を決定し、明確なバックグラウンドを生成するのに有用であった。現在のゴルジ - コックス法（市販のゴルジ染色キットで提供されるプロトコルのわずかな変形）は、化学療法薬5-フルオロウラシル（5-Fu）の比較的低用量が樹状形態にどのように影響するかを評価するために設計された、脊髄の数、および海馬内での血管収縮の複雑さが含まれる。 5-Fuは、樹状突起の複雑さを有意に調節し、領域特異的様式で海馬全体の背骨密度を減少させた。示されたデータは、ゴルジ体染色法ef海馬のCA1、CA3、および歯状回（Dentate gyrus、Dentate gyrus）における成熟ニューロンを強く染色した。このプロトコルは、各ステップの詳細を報告し、他の研究者が高品質の結果と最小のトラブルシューティングで脳全体の組織を確実に染色できるようにします。

概要

デンドライトは、シナプス入力¹を受け取り、処理するニューロンの中で最大の部分です。それらの樹状突起は複雑な幾何学的形状を有し、近位枝は遠位枝よりも大きな直径を有する。樹状突起が発達すると、それらは樹状突起形成と呼ばれる過程で他のニューロンといくつかのつながりを形成する。この分枝の程度とパターンは、樹状突起が適切に処理できるシナプス入力の量を決定する² 。

樹状突起形成は、活性依存性可塑性およびニューロン回路の適切な発達のために必要なプロセスである。伸長、収縮、分枝およびシナプス形成は、固有の遺伝的プログラムおよび外因性因子からの影響を含む複雑なプロセスである。海馬内のニューロン樹状突起の形態学的および分枝的な変化は、認知および記憶形成に関与している樹状突起の複雑さの変化は、病態生理学的および行動的変化に関連する^5.異常は、脆弱X症候群およびダウン症候群⁶を含むいくつかの疾患状態に関連する。

樹状突起突起は、中枢神経系内に興奮性の入力を受ける樹状突起の特殊な細胞内区画である。樹状突起の3つの形態学的クラスがあり、その大きさと形状に基づいてそれぞれのクラスの名前があります：1）キノコの背骨は複雑なシナプス後の密度を持ち、他の突起よりもグルタミン酸受容体が多い⁷ 。 2）茎が欠けているぼんやりした棘。 3）細長い棘は、伸長した細い幹と球状頭部からなる⁸ 。樹状突起棘の容積は、それらを規定するために部分的に使用され、薄い棘は一般的により小さい（0.01μm3 ）、マッシュルームスパイン（0.8μm3）と比較して^9,10 。背骨は成熟とともに安定する。例えば、細い棘は数日後に収縮するか、キノコの棘に成長する。あるいは、マッシュルームの棘は比較的安定であり、長期間生存することができる。ニューロンの結合の強さは、棘の数および/またはその体積に基づいていると考えられる^11,12,13 。

古典的なゴルジ染色方法およびそのより現代的なバリエーションはすべて、樹状突起の形態および密度を調べるために有用であった。ゴルジ染色の1つの独特な局面は、全ニューロンの約5％を無作為に染色することであり、個々のニューロンの追跡を可能にする^14,15 。ゴルジ体の正確なメカニズム個々のニューロン染色は未知であるが、この方法の原理はクロム酸銀（Ag ₂ CrO ₄ ） ^16,17の結晶化に基づく。ゴルジ法の主な3つのタイプがあります：急速ゴルジ、ゴルジ - コックス、ゴルジ - コプシュ¹⁸ 。 3つの方法はすべてクロム塩の初期インキュベーション段階から数日から数ヶ月間に始まりますが、それらの間にはいくつかの重要な違いがあります。急速ゴルジ体は第一段階で四酸化オスミウムを使用し、ゴルジ - コプシュはパラホルムアルデヒドを含む。迅速ゴルジおよびゴルジ - コプシュの両方の染色の後に、約7日間、1〜2％硝酸銀溶液中でのインキュベーションを行う。 Golgi-Cox法は、硝酸銀の代わりに塩化第二水銀および重クロム酸カリウムを使用し、2〜4週間の含浸時間を有する。次いで、組織を切片化し、希釈したアンモニアその後、塩を除去するための写真定着液を使用した。 3つのタイプのうち、ゴルジ - コックス（Golgi-Cox）法は、部分的には干渉を伴わずに樹状突起を染色するのに最も良いと考えられているが、その理由は、結晶アーチファクトが組織の表面上に起こらないからである^17,20,21 。

本方法は、市販のゴルジ染色キットを備えたプロトコルのわずかな変形であり、5-Fuの比較的低い用量が樹状の形態学的特徴および背骨密度にどのように影響するかを評価するために設計された。取得されたデータは、化学療法による治療がニューロン回路にどのように影響するかについてのさらなる洞察を提供することができる。

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プロトコル

実験は、UAMSの機関動物管理および使用委員会によって承認された倫理基準に従って行われた。

1.動物および5-Fu注射パラダイム

1. 6ヵ月齢のオスのC57Bl6 / J野生型マウスを購入し、それらが1歳に達するまで一定の12時間の明/暗サイクル下にそれらを収容する。
2. 5％Fuを0.9％滅菌生理食塩水で希釈する。マウス1匹あたり必要な用量として60 mg / kgを使用する。
3. 5-Fuの腹腔内注射を行う（週に3回、3週間）。
   1. 毎日同じ時間に腹腔内注射を行う。例えば、0900-1200時間の間。
4. 動物を安楽死させ、最終注射の30日後に脳を抽出する。

2.安楽死処置および脳抽出

1. 齧歯類を拘束し、尾の基部をつかむ。一方、親指または第1の指をthげっ歯類の首の根元。齧歯類の首にすばやく圧力を加え、尾をつかんでいるもう一方の手が後ろに引っ張っている間、前に押します。
2. 一方の手でげっ歯類を、他方の手で大きな手術用はさみを持ちます。齧歯類の首を2枚の刃の間に置き、頭をすばやく断頭します。
3. 切断されたマウスの頭部を取って、細かいはさみを使って、目の上まで頭骨の上の毛皮を整える。次に、はさみの先端を各アイソケットに置き、わずかな力でハサミを閉じます。
4. 春のはさみを使用して、頭蓋骨を小脳の左右に切断します。
5. 小脳の周りの頭蓋骨の部分を直接持ち上げて持ち上げるために鉗子を使用してください。
6. 春のハサミを使用して、頭蓋骨の中心窩に沿って切断します。
7. 鉗子を使用して頭蓋骨の残りの部分を脳から持ち上げます。
8. スパチュラとプローブを使用して、脳を目的の容器にすくい取ってください。ステンレスを使用してティエルブレードは、各脳を正中面に沿って切断します。右半球について以下のゴルジ - コックス法を実行する。

Golgi染色および組織の調製

1. 新しく採取した半分の脳を、10mLコニカルチューブ内の5mLの塩化水銀ベースの溶液（キットの溶液A）に浸します。塩化第二水銀溶液は感光性である。ホイルでチューブを覆う。サンプルを室温で暗所に保管してください。
   注：キットには、材料表に記載されているソリューションAが提供されています。あぶない！溶液A（塩化水銀溶液とも呼ばれる）には、重クロム酸カリウム、塩化水銀、クロム酸カリウムなどの有毒な試薬が含まれています。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。
2. 1日後、溶液をゆっくりと一時的な容器（大型の計量ボートなど）に落として、バイオハザードの廃棄容器に処分する。脳（元の10 mLコニカルチューブに依然として）を5 mLの塩化水銀溶液を添加し、サンプルを暗室に室温でさらに13日間戻す。
3. 90gの蒸留水または脱イオン水（dH ₂ O）に30gの含浸後緩衝液を加える。 6ウェルプレートの各ウェルに、6.5mLの含浸後緩衝液（1頭あたり1ウェル）を充填する
   注記：ポスト含浸緩衝液は、材料表に記載されているキットに含まれています。
   1. 塩化水銀溶液中で（合計で）14日後、組織をdH ₂ Oですすぎ、その後、含浸緩衝液を入れた6ウェルプレートに移す。箔でプレートを覆い、暗所で室温で保管します。
4. 浸漬1日後に含浸後緩衝液をピペットで取り出し、新鮮な含浸後含浸緩衝液で更新する;室温で暗所に1日間保存する。必要に応じて、4℃で1ヶ月まで保存してください^。22 。

4.セクショニング

1. 蓋の12ウェルプレートに左から右、上から下へ昇順に番号を付けます。
2. 脳全体を切断する場合は、1つの脳につき2つまたは3つの12ウェルプレートを準備する。
   1. 各12ウェルプレートの蓋の上部に、切断された脳の識別番号をラベルする。
   2. 各プレートの各ウェルに1×PBS 2mLをピペットで入れる。
3. ステージを設定し、ビブラトームをオンにします。組織を覆う十分な1x PBSが容器に入っていることを確認してください。
   1. プラスチックパラフィンフィルムを2枚切り、2回折り重ねます。 1x PBSがカウンターに漏れるのを防ぐために、検体ホルダーノブの穴の上にそれらを置きます。
   2. 試験片ホルダーのティッシュブロックにテープを貼り、シアノアクリレート粘着剤（材料表参照）を貼ります。
4. 6ウェルプレートから脳を取り出し、それをプラスチックまたはガラス皿に置きます。ステンレスを使用小脳の約半分を切断するためにスチールの両刃ブレード。
   1. 小脳を尾を切る。残っている小脳の部分が均一であることを確認してください。
5. 直ちに残りの小脳の平らな表面を接着剤の上に置きます。
   注：組織の背部（大脳皮質）は、ブレードに対して左右に向いている必要があります。以前に嗅球が付着していた吻側は、上向きになるはずです。
   1. 接着剤が完全に乾燥していることを確認するために、少なくとも数分間待ちます。
6. 脳を所定の位置に保持している接着剤が乾燥している間に、1×PBSを検体浴に注ぎます。接着剤が乾燥した後、組織が入った標本ホルダーを標本浴に置きます。
   1. 組織サンプルが完全に覆われていない場合は、1倍のPBSを検体浴に注ぎます。
7. ビブラトームのブレードホルダーにブレードを取り付け、ゆっくりとl1×PBSに完全に浸すまで、ブレードを試料バスに入れます。それが組織の上部のわずかに下になるまでブレードを下げ続けます。
8. ビブラトームの速度を7、振幅を6、切断角度を12°に設定します（ビブラトームモデルの材料表を参照）。振動を開始し、200μmの部分を切断する²³ 。
   1. 大きなペイントブラシを使用して、組織切片を検体浴から12ウェルプレートの指定されたウェルのそれぞれに移動させます。
9. 所望の数の組織切片に達するまで、組織を切断し続ける。

5.後染色

1. 以下の染色工程およびリンスのそれぞれについて、1ウェルにつき示された溶液2 mLを使用する。溶液をウェルに移すには電動ピペットフィラー（材料表を参照）を使用してください。溶液を適切な廃棄物に移すために移送ピペット（材料表を参照）を使用するコンテナ。
2. 切片を0.01M PBS-Tの1回30分洗浄で洗浄する（3.0mLの界面活性剤（材料の表参照）を0.01MのPBS1000mLに加える）。
3. 使用直前にdH ₂ Oで3：5の容量の水酸化アンモニウム溶液（注意）を希釈する。希釈した水酸化アンモニウム溶液中の切片を19〜21分間染色する。
   1. 光感受性水酸化アンモニウム溶液をホイルで保護する。
      注：溶液中の水酸化アンモニウムの濃度は約10％であり、それは「有害」と分類される。水酸化アンモニウム溶液は、皮膚に接触すると火傷を起こすことがあります。吸入すると呼吸器の刺激を引き起こすことがある。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。
4. ポスト染色バッファー（500mLのdH ₂ O中に90gの試薬Dを加える）中の切片を19〜21分間染色する。ポスト染色バッファーは感光性です。フォイル^22で保護してください。
5. 3つのセクションをすすいでください0.01M PBS-Tを5〜10分間洗浄した。

6.取り付け、クリーニング、およびカバー

1. 大きなペイントブラシで1％ゼラチンコートスライドのセクションをマウントします。それらを室温で20〜30分間乾燥させ、その後Coplinジャーに一晩置いてください。
2. コプリンジャーから手袋をしたスライドをスライドから取り出し、プラスチックラックに置きます（材料の表を参照）。 100％エタノールを含有する染色皿（材料表参照）にプラスチックラックを置きます。 5分間3回洗浄して脱水する。
3. スライドを99％キシレンで5分間ずつ2回洗浄する。スライドをガラスラックに置き、金属ハンドル付きのキシレンを含むガラス染色皿にラックを下ろします（材料の表を参照）。
   注：キシレンは吸入すると有害であり、皮膚に触れると刺激を引き起こすことがあります。それは液体および蒸気状態で非常に可燃性である。保護手袋を着用し、ヒュームフードで作業してください。
4. キシルからスライドを除去する一度に1つずつ取り出し、組織を約0.25 mLのマウントメディアですばやくカバーします（材料表を参照）。次に、スライドカバーを取り、メディアの上に置きます。
   1. スライドカバーの下に閉じ込められた気泡を、ペイントブラシの端などの鈍いオブジェクトで端まで押します。
5. 太陽光から離れた場所にスライドを置き、2〜3日間乾燥させる。
6. 顕微鏡を使用して画像を取得し、適切なソフトウェアで分析することに進みます。

7.イメージスタックを取得する

1. イメージングプログラムを開きます（ 材料表を参照）。スライドを顕微鏡のステージに置きます。プログラムの上部にあるメニューで、[取得]をクリックし、[ライブ画像]をクリックします。
2. 顕微鏡を10倍に設定します。好みのニューロンを特定してから、赤いXのように見えるカーソルをソーマの中心に持って行きます。左クリックして基準点を設定します。
3. 顕微鏡を40倍に設定します。プログラムの上部にあるメニューから「移動」をクリックし、「参照先に」をクリックします。
4. 組織の上の細かい対物レンズを手動でスクロールして、わずかに焦点が外れるまで、画像スタックの作成を開始します。
   1. プログラムの右下にある[画像の取得]という見出しの下にある[Set Top]をクリックします。
   2. 組織の下をわずかにスクロールして、焦点がわずかに外れるようにしてから、「Image Acquisition」の下の「Set Bottom」をクリックします。次に、「画像スタックの取得」をクリックします。
5. イメージスタックを取得した後、表示されるウィンドウにイメージファイルの名前を入力します。 「MBF Asciiファイル」として保存します。
   1. メッセージが表示されたら、ファイル形式を「MBF JPEG2000スタックファイル」として選択し、「保存」をクリックします。

8.ニューロンのトレース

1. ツールバでrメニューの下にある「Contour Name」という名前のボックスをクリックします。ドロップダウンメニューから「Soma」を選択します。
2. 手動で体細胞を追跡します。トレースが完了したら、右クリックして[セルボディの終了]を選択します。
3. 「AutoNeuron」を選択すると、「AutoNeuron Workflow」という別のタブが表示されます。
4. [設定タイプ]で[新規]を選択します。パラメータを設定し、 "次のステップ"をクリックして "Soma Detection"小見出しを表示します。
   1. パラメータを設定するには、「Brightfield」を選択します。次に、 "Max Process Diameter"で "Start Measuring"をクリックします。カーソルを使用して、デンドライトの底に移動し、手動で直径を設定します。
5. ユーザーに画像全体をトレースするよう要求するウィンドウで[はい]をクリックします。手動で体細胞を追跡します。 「次のステップ」をクリックして、「シードプレースメント」小見出しを表示させます。
6. [Validate Seed]をクリックします。"次のステップ"をクリックして "Neuron Reconstruction"小見出しを表示させます。
7. "Neuron"で、 "Interactive"をクリックします。樹状突起のプログラムからの指示に従い、プログラムでトレースされた強調表示された領域を完成させるために右クリックして、インタラクティブなトレースを実行します。すべての樹状突起をトレースした後、「次のステップ」をクリックします。
8. 新しいウィンドウが表示されたら、希望のタイトルで新しい構成を保存します。 [保存]をクリックします。

9.分析

1. 分析プログラムを開きます（材料の表を参照）。
2. トップメニューから「ファイル」をクリックし、「データファイルを開く」をクリックします。対象のファイルを選択します。
3. 分析小見出しの下で、「Sholl Analysis」を選択します。
4. 「Sholl Analysis」ウィンドウで、開始半径を10μmに設定します。 [分析]の下にある[Dendrites]と[Branch Orders]のボックスをクリックします。
5. 右のcl新しく開いたウィンドウをクリックし、「Excelエクスポート」をクリックします。 [保存]をクリックします。
6. 分析の下で、「分枝構造分析」をクリックします。 「すべての可能な分析」を選択します。
7. 新しく開いたウィンドウを右クリックし、「Excelエクスポート」をクリックします。

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結果

市販のイメージングソフトウェアを使用して、ゴルジ染色された脳切片の樹状突起形成および海馬の複雑さに対する5-Fu処置の効果を定量し、追跡した。追跡後、Sholl分析および樹状複雑性指数（DCI）を用いて、樹状突起形成、背骨密度、および脊椎形態を分析した。ショール分析は、樹状突起の形態を決定するために使用できる定量的分析方法である²⁵

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ディスカッション

より現代的な技術と比較して、Golgi-Cox法は、スパイン形態を検査するための好ましい方法であるいくつかの利点を有する：1）本質的に任意の組織に染色を用いることができ、2）基本的な光学顕微鏡のセットアップは、 3）Golgi-Coxイメージングは​​、共焦点イメージングよりも速く、4）ゴルジ染色された切片は、蛍光標識されたサンプルより数ヶ月から数年長い間生存可能である。これら?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
superGolgi Kit	Bioenno Lifesciences	30100	Contains hazardous materials.
PBS 10x powder concentrate	Fisher	BP665-1
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
Permount	Fisher	SP 15-100
Slide cover	Fisher	12-546-14
7 mL Transfer pipette	Globe Scientific	135030
10 mL Falcon tubes	BD Biosciences	352099
Foil	Fisher	01-213-105
12-well plate	BD Biosciences	353043
200 proof Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Xylene	Acros Organics	1330-20-7	Hazardous.
Permabond 200	Permabond LLC	GF2492
25 mL serological pipette	Sigma	SIAL1489
Parafilm	Midsci	HS234526C
Vibratome	World Precision Instruments	NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice	The Jackson Laboratory	000664
Axio Imager 2	ZEISS	Multiple components, see website for details.
AxioCam MRc Camera	ZEISS	426508-9902-000
Staining Dish , Green	Tissue-Tek	62541-12
Staining Dish Set	Electron Microscopy Sciences	70312-20
Motorized Pipet Filler	Fisher	03-692-168
Neurolucida	mbf Bioscience
Neurolucida Explorer	mbf Bioscience
Prism	GraphPad