Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo Golgi-Cox in dettagli estesi. Questo metodo affidabile di macchie di tessuto consente una valutazione di alta qualità della cytoarchitettura nell'ippocampo, e in tutto il cervello, con una minima risoluzione dei problemi.

Abstract

Le spline dendritiche sono le protuberanze degli alberi dendritici neuronali che contengono sinapsi eccitatoriali. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all'interno dell'ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoria. Ci sono diversi approcci alla colorazione Golgi, tutti utili per determinare le caratteristiche morfologiche degli archi dendritici e produrre uno sfondo chiaro. L'attuale metodo Golgi-Cox, (una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione Golgi commerciale), è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del farmaco chemioterapico 5-flurouracil (5-Fu) avrebbe influenzato la morfologia dendritica , Il numero di spine e la complessità dell'arborizzazione all'interno dell'ippocampo. Il 5-Fu ha significativamente modulato la complessità dendritica e ha ridotto la densità della colonna vertebrale in tutto l'ippocampo in un modo specifico della regione. I dati presentati mostrano che il metodo di colorazione Golgi efHa colorato esattamente i neuroni maturi nel CA1, nel CA3 e nel dentato gyrus (DG) dell'ippocampo. Questo protocollo riporta i dettagli di ogni passaggio in modo che altri ricercatori possano affidare affidabilmente il tessuto in tutto il cervello con risultati di alta qualità e minima risoluzione dei problemi.

Introduzione

I dendriti sono la parte più grande dei neuroni che ricevono e trattano l'input presinaptico ¹ . I loro processi dendritici hanno una geometria complessa, in cui i rami prossimi hanno un diametro maggiore rispetto ai rami distali. Come sviluppano i dendriti, formano diversi collegamenti con altri neuroni in un processo denominato arborizzazione dendritica. L'estensione e il modello di questa ramificazione determina la quantità di input sinaptici che un dendrite può elaborare adeguatamente ² .

L'arborizzazione dendritica è un processo necessario per la plasticità dipendente dall'attività e lo sviluppo appropriato dei circuiti neuronali. L'estensione, la retrazione, la ramificazione e la sinaptogenesis sono processi intricati che includono programmi genetici intrinseci e influenze da fattori estrinseci. Le variazioni morfologiche e ramificanti dei dendriti neuronali all'interno dell'ippocampo sono implicati nella formazione della cognizione e della memoriaF "> 3 ^{, 4.} Le alterazioni della complessità dendritica sono associate a alterazioni fisiopatologiche e comportamentali ^{5. Le} anomalie sono legate a diversi stati malattie, tra cui la sindrome del X fragile e la sindrome di Down ⁶ .

Le spine dendritiche sono gli scompartimenti subcellulari specializzati degli archi dendritici che ricevono entità eccitatorie all'interno del sistema nervoso centrale. Ci sono tre classi morfologiche di spine dendritiche, con il nome di ciascuna classe basata sulla loro dimensione e forma: 1) spine di funghi, che hanno densità postinaptica complesse con più recettori di glutammato rispetto alle altre spine ⁷ ; 2) spine stubby, che non hanno uno stelo; E 3) spine sottili, che sono costituite da uno stelo protratto e stretto e da una testa a globo ⁸ . Il volume della spina dendritica viene utilizzato in parte per definirli, con spine sottili generalmente più piccole (0.01 μm ³ ) Rispetto alle spine di funghi (0,8 μm ³ ) ^{9 , 10} . Le spine si stabilizzano con la maturazione. Ad esempio, le spine sottili ritirarsi dopo pochi giorni o svilupparsi in spine fungine. In alternativa, le spine del fungo sono relativamente stabili e possono sopravvivere per un lungo periodo di tempo. La forza delle connessioni neuronali si basa sul numero di spine e / o sul loro volume ^{11 , 12 , 13} .

Il classico metodo di colorazione Golgi e le sue variazioni più moderne sono state utili per esaminare la morfologia e la densità della spina dendritica. Un aspetto unico della colorazione Golgi è che macchia casualmente circa il 5% dei neuroni totali, che permette la traccia dei singoli neuroni ^{14 , 15} . Anche se l'esatto meccanismo in cui il metodo GolgiOd di macchie di singoli neuroni è ancora sconosciuto, il principio del metodo è basato sulla cristallizzazione del cromato d'argento (Ag ₂ CrO ₄ ) ^{16 , 17} . Ci sono tre tipi principali del metodo Golgi: il Golgi rapido, il Golgi-Cox e il Golgi-Kopsch ^{18 , 19} . Tutti e tre i metodi iniziano con una fase iniziale di incubazione nei sali di cromo per diversi giorni a mesi, ma esistono alcune differenze fondamentali tra loro. Il rapido Golgi usa il tetroxido di osmium nel primo passaggio, mentre il Golgi-Kopsch include la paraformaldeide. La colorazione sia nel rapido Golgi che nel Golgi-Kopsch è seguita da un'incubazione in soluzione nitrato d'argento 1-2% per circa 7 giorni. Il metodo Golgi-Cox utilizza il cloruro di mercurio e il bicromato di potassio anziché il nitrato d'argento e ha un tempo di impregnazione di 2-4 settimane. I tessuti vengono quindi sezionati e posizionati rapidamente in una ammoniaca diluitaSoluzione, seguita da un fissatore fotografico per rimuovere sali. Tra i tre tipi, il metodo Golgi-Cox è considerato il più adatto alla colorazione degli archi dendritici senza molte interferenze di fondo, in parte perché gli artefatti cristallini non si verificano sulla superficie del tessuto (a differenza del metodo rapido Golgi) ^{17 , 20 , 21} .

Il metodo presente è una leggera variazione del protocollo fornito con un kit di colorazione commerciale Golgi ed è stato progettato per valutare come una dose relativamente bassa del 5-Fu influenzerebbe le caratteristiche morfologiche dendritiche e la densità della colonna vertebrale. Tutti i dati acquisiti potrebbero fornire ulteriori informazioni sul modo in cui il trattamento chemioterapico influenza la circuiteria neuronale.

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Protocollo

Gli esperimenti sono stati condotti secondo gli standard etici approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali a UAMS.

1. Animali e 5 paradigmi di iniezione

1. Acquistare i maschi di tipo maschio C57Bl6 / J di 6 mesi e di alloggiarli sotto un ciclo di luce / buio costante da 12 h fino a quando non raggiungono 1 anno di età.
2. Diluire la 5-Fu in soluzione salina sterile del 0.9%. Utilizzare 60 mg / kg come dose necessaria per mouse.
3. Dare le iniezioni intraperitoneali del 5-Fu (una volta alla settimana per tre settimane).
   1. Date le iniezioni intraperitoneali attorno allo stesso tempo ogni giorno. Ad esempio, tra 0900-1200 h.
4. Eutanizzare gli animali e estrarre il cervello 30 giorni dopo l'iniezione finale.

2. Procedura di eutanasia e estrazione del cervello

1. Restringere il roditore e afferrare la base della coda. Con l'altra mano, posizionare il pollice o il primo dito a thBase del collo del roditore. Rapidamente mettere pressione sul collo del roditore e spingere in avanti mentre l'altra mano che tiene la coda tira indietro.
2. Tenere il roditore con una mano e le grandi forbici chirurgiche con l'altra. Posizionare il collo del roditore tra le due lame e decapitare rapidamente la testa.
3. Prendi la testa del mouse tagliata e usa le forbici belle per tagliare la pelliccia sopra il cranio, fino agli occhi. Quindi posizionare le punte delle forbici in ciascuna presa d'occhio e chiudere le forbici con una leggera forza.
4. Usare forbici a molla per tagliare il cranio a sinistra ea destra del cervelletto.
5. Usare la pinza per sollevare la parte del cranio che circonda il cervelletto direttamente e in su.
6. Utilizzate le forbici a molla per tagliare lungo la linea midsagittale del cranio.
7. Utilizzare la pinza per sollevare la parte rimanente del cranio dal cervello.
8. Utilizzare una spatola e una sonda per scavare il cervello nel contenitore desiderato. Utilizzando un inoxLa lama di teel, taglia ogni cervello lungo il piano midsagittale. Eseguire il seguente metodo Golgi-Cox sugli emisferi destro.

3. Golgi colorazione e preparazione dei tessuti

1. Immergere i semi-cervelli appena raccolti in 5 ml di soluzione a base di cloruro di mercurio (soluzione A dal kit) in un tubo conico da 10 ml. La soluzione di cloruro di mercurio è sensibile alla luce; Coprire il tubo con la pellicola. Conservare il campione al buio a temperatura ambiente.
   NOTA: La soluzione A è fornita nel kit elencato nella tabella dei materiali. Attenzione! La soluzione A (chiamata anche soluzione di cloruro di mercurio) contiene reagenti tossici quali il bicromato di potassio, il cloruro di mercurio e il cromato di potassio. Indossare guanti protettivi e lavorare in un cappuccio.
2. Dopo 1 giorno, decanta lentamente la soluzione in un contenitore temporaneo (ad esempio una grande imbarcazione pesata) e smaltire in un contenitore di rifiuti a rischio biologico. Immergere i cervelli (ancora nei tubi conici originali da 10 mL) con 5 ml diLa soluzione di cloruro di mercurio e restituisce il campione al buio a temperatura ambiente per altri 13 giorni.
3. Aggiungere 30 g di tampone post-impregnazione a 90 mL di acqua distillata o deionizzata (dH ₂ O). Riempire ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 6,5 ml del tampone post-impregnazione, un pozzetto per cervello
   NOTA: Il buffer di post impregnazione è fornito nel kit elencato nella tabella dei materiali.
   1. Dopo 14 giorni (in totale) nella soluzione di cloruro di mercurio, sciacquare il tessuto con dH ₂ O, quindi trasferirli in piatti a 6 pozzetti con tampone post-impregnazione. Coprire le lastre con la pellicola e conservarle a temperatura ambiente al buio.
4. Pipettare il tampone post-impregnazione dopo 1 giorno di immersione e rinnovare con il tampone di impregnazione fresco; Memorizzare per 1 giorno al buio a temperatura ambiente. Se necessario, conservare questo a 4 ° C per un massimo di 1 mese ²² .

4. Sezione

1. Etichettare i piatti a 12 pozzetti sui loro coperchi con i numeri in ordine crescente da sinistra a destra e verso l'alto.
2. Preparare due o tre piatti da 12 pozzetti per cervello se si taglia l'intero cervello.
   1. Etichettare la parte superiore di ogni coperchio della piastra a 12 pozzetti con il numero di identificazione del cervello tagliato.
   2. Pipettare 2 ml di 1x PBS in ogni pozzetto di ogni piastra.
3. Impostare il palco e accendere il vibratome; Assicurarsi che nel contenitore sia sufficiente 1x PBS per coprire il tessuto.
   1. Tagliare due pezzi di paraffina in plastica e piegarli per due volte. Posizionarli sopra i fori per le manopole del supporto del campione per impedire che 1x PBS cada sul contatore.
   2. Mettere il nastro giù sul blocco di tessuto del supporto del campione e quindi mettere su di esso la colla adesiva di cianoacrilato (vedere tabella dei materiali).
4. Rimuovere il cervello dalla piastra a 6 pozzetti e metterlo su un piatto di plastica o vetro. Usare l'inossidabileLama in acciaio a doppio taglio per tagliare circa la metà del cervelletto.
   1. Tagliare il cervelletto caudalmente. Assicurarsi che la porzione del cervelletto rimanente sia pari.
5. Immediatamente collocare la superficie piana del cervelletto rimanente sulla colla.
   NOTA: La parte dorsale del tessuto (la corteccia cerebrale) deve essere rivolta a sinistra oa destra rispetto alla lama. L'estremità rostrale che precedentemente conteneva la lampadina olfattiva attaccata doveva essere rivolta verso l'alto.
   1. Attendere almeno alcuni minuti per assicurarsi che la colla asciughi completamente.
6. Mentre la colla che tiene il cervello in posizione sta essendo asciugata, versare 1x PBS nel bagno di campione. Dopo che la colla è asciutta, posizionare il supporto del campione con il tessuto nel bagno del campione.
   1. Se il campione di tessuto non è completamente coperto, versare più 1x PBS nella vasca del campione.
7. Fissare la lama sul supporto della lama del vibratome e lentamente lTirare la lama nella vasca del campione finché non sia completamente sommersa in 1x PBS. Continuare a abbassare la lama fino a leggermente sotto la parte superiore del tessuto.
8. Impostare la velocità del vibratore a 7, l'ampiezza a 6 e l'angolo di taglio a 12 ° (vedere tabella dei materiali per il modello vibratome). Avviare la vibrazione e tagliare le sezioni da 200 μm ²³ .
   1. Utilizzare un grande pennello per spostare le sezioni del tessuto dalla vasca del campione in ciascun pozzo designato delle piastre a 12 pozzetti.
9. Continuare a tagliare il tessuto fino a raggiungere il numero desiderato di sezioni del tessuto.

5. Post-colorazione

1. Per ciascuna delle seguenti fasi di verniciatura e risciacqui, utilizzare 2 ml della soluzione indicata per pozzetto. Utilizzare un riempitivo a pipetta motorizzato (vedere tabella dei materiali) per trasferire le soluzioni nei pozzetti. Utilizzare una pipetta di trasferimento (vedere tabella dei materiali) per trasferire soluzioni dai pozzetti e nei rifiuti appropriaticontenitori.
2. Sciacquare le sezioni in un lavaggio di 30 minuti di 0.01 M PBS-T (aggiungere 3,0 ml di detergente (vedere tabella dei materiali) a 1000 ml di PBS da 0,01 M).
3. Diluire la soluzione di idrossido di ammonio (Caution) 3: 5 in volume con dH ₂ O immediatamente prima dell'uso. Macchiare le sezioni nella soluzione diluita di idrossido di ammonio per 19-21 min.
   1. Proteggere la soluzione idrossido di ammonio sensibile alla luce con la pellicola.
      NOTA: L'idrossido di ammonio all'interno della soluzione ha una concentrazione di ~ 10% ed è classificato come "pericoloso". La soluzione di idrossido di ammonio può produrre ustioni se contatto con la pelle. Può causare irritazione delle vie respiratorie se inalato. Indossare guanti protettivi e lavorare in un cappuccio.
4. Macchiare le sezioni nel tampone post-colorazione (aggiungere 90 g di reagente D in 500 mL dH ₂ O) per 19-21 min. Il tampone post-colorazione è sensibile alla luce; Proteggerlo con la lamina ²² .
5. Sciacquare le sezioni in tre, Lavaggi da 5-10 min di 0.01 M PBS-T.

6. Montaggio, pulizia e copertura

1. Montare le sezioni su slitte rivestite con gelatina al 1% con il grande pennello. Lasciare asciugare per 20-30 minuti a temperatura ambiente e poi metterli in un vaso di Coplin durante la notte.
2. Rimuovere le diapositive con le mani guantate dal vaso Coplin e posizionarle in un rack di plastica (vedere tabella dei materiali). Posizionare il rack di plastica nel piatto di colorazione (vedere tabella dei materiali) contenente 100% etanolo. Deidirli con tre lavaggi da 5 minuti.
3. Lavare le diapositive due volte per 5 min ciascuna nel 99% di xilene. Posizionare le diapositive in un rack di vetro e abbassare il rack in un piatto di vernice di vetro contenente xilene con una maniglia in metallo (vedere tabella dei materiali).
   NOTA: Attenzione, Xylene è dannoso se inalato e provoca irritazione se tocca la pelle. È altamente infiammabile negli stati liquidi e vapori. Indossare guanti protettivi e lavorare in un cappuccio.
4. Rimuovere le diapositive dal xilUno alla volta e coprire rapidamente il tessuto con ~ 0,25 ml di supporti di montaggio (vedi tabella dei materiali). Quindi, prendete le copertine e posate sui supporti.
   1. Spingere le bolle d'aria intrappolate sotto le coperture dello scivolo sul bordo con un oggetto sfocato, come la fine di un pennello.
5. Posizionare le diapositive in un'area lontana dalla luce del sole e lasciarle asciugare per 2-3 giorni.
6. Procedere all'acquisizione di immagini usando un microscopio e analizzando con il software appropriato.

7. Acquisire Image Stack

1. Aprire il programma di imaging (vedere Tabella materiali ). Posizionare la diapositiva sullo stadio del microscopio. Nel menu nella parte superiore del programma, fai clic su "Acquisizione" e fai clic su "Immagine in diretta".
2. Impostare il microscopio a 10 volte. Individuare il neurone di preferenza e portare il cursore, che appare come un X rosso, sul centro del soma. Fare clic con il tasto sinistro per impostare il punto di riferimento.
3. Impostare il microscopio a 40X. Fai clic su "Sposta" dal menu nella parte superiore del programma e fai clic su "A punto di riferimento".
4. Inizia la creazione dello stack di immagini scorrendo manualmente con il fine obiettivo sopra il tessuto finché non è leggermente fuori fuoco.
   1. Fai clic su "Set Top" nell'angolo in basso a destra del programma sotto la voce "Acquisizione immagine".
   2. Scorrere leggermente sotto il tessuto finché non è leggermente fuori fuoco e quindi fare clic su "Set Bottom" in "Acquisizione immagine". Avanti, fai clic su "Acquisisci Stack di immagini".
5. Dopo aver acquisito lo stack di immagini, digitare il nome desiderato per il file immagine nella finestra visualizzata. Salva come "file MBF Ascii".
   1. Quando richiesto, selezionare il tipo di file come "file stack MBF JPEG2000" e quindi fare clic su "Salva".

8. Tracciamento neuronale

1. Nella toolbaR sotto il menu, fai clic sulla casella con il titolo "Contour Name". Seleziona "Soma" dal menu a discesa.
2. Traccia manualmente il soma. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare "Finish Cell Body" quando il tracciamento è completo.
3. Selezionare "AutoNeuron" per visualizzare un'altra scheda intitolata "WorkNeuron Workflow".
4. In "Tipo di configurazione", selezionare "Nuovo". Impostare i parametri e fare clic su "Next Step" per visualizzare la sottovoce "Soma Detection".
   1. Per impostare i parametri, selezionare "Brightfield". Quindi, sotto "Max Process Diameter", fai clic su "Start Measuring". Usando il cursore, andare alla base del dendrite e impostare manualmente il diametro.
5. Fare clic su "Sì" nella finestra che richiede all'utente di tracciare l'intera immagine. Traccia manualmente il soma. Disattiva e fai clic su "Passo successivo" per visualizzare la sottovoce "Posizionamento semi".
6. Fare clic su "Validate Seed"S "e quindi fare clic su" Next Step "per visualizzare la sottotitola" Neuron Reconstruction ".
7. In "Neuron", fai clic su "Interattivo". Eseguire tracciamenti interattivi seguendo la direzione del programma dei dendriti e fare clic con il pulsante destro del mouse per completare l'area evidenziata tracciata dal programma. Dopo aver tracciato tutti i dendriti, fai clic su "Next Step".
8. Dopo aver visualizzato una nuova finestra, salvare la nuova configurazione con un titolo desiderato. Fai clic su "Salva".

9. Analisi

1. Aprire il programma di analisi (vedere la tabella dei materiali).
2. Fai clic su "File" dal menu superiore e fai clic su "Apri file di dati". Seleziona il file di interesse.
3. Sotto la sottovoce analisi, selezionare "Analisi Sholl".
4. Nella finestra "Analisi Sholl", impostare il raggio di inizio a 10 μm. In "Analisi", fai clic sulle caselle "Dendrites" e "Ordini dei rami".
5. Diritto clScattare le finestre aperte e fare clic su "Excel Export". Fai clic su "Salva".
6. Nell'ambito dell'analisi, fare clic su "Analisi struttura strutturata". Selezionare "Tutte le analisi possibili".
7. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra di recente apertura e fare clic su "Esportazione di Excel" ²⁴ .

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Risultati

Gli effetti del trattamento 5-Fu sull'arborizzazione e la complessità dendritica nell'ippocampo delle sezioni cerebrali macchiate da Golgi sono state quantificate e tracciate utilizzando un software di imaging disponibile in commercio. Dopo la tracciatura, l'arborizzazione dendritica, la densità della colonna vertebrale e la morfologia della spina sono state analizzate usando l'analisi di Sholl e l'indice di complessità dendritica (DCI). L'analisi di Sholl è u...

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Discussione

Rispetto alle tecniche più moderne, il metodo Golgi-Cox presenta diversi vantaggi che lo rendono il metodo preferito per esaminare la morfologia della colonna vertebrale: 1) la colorazione può essere utilizzata per qualsiasi tessuto, 2) una messa a punto di microscopi di base è tutto ciò che serve a Acquisire immagini basate su Golgi, 3) l'imaging Golgi-Cox è più veloce di un'immagine confocale e 4) le sezioni macchiate di Golgi sono vitali per diversi mesi a anni più a lungo dei campioni che sono etichet...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
superGolgi Kit	Bioenno Lifesciences	30100	Contains hazardous materials.
PBS 10x powder concentrate	Fisher	BP665-1
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
Permount	Fisher	SP 15-100
Slide cover	Fisher	12-546-14
7 mL Transfer pipette	Globe Scientific	135030
10 mL Falcon tubes	BD Biosciences	352099
Foil	Fisher	01-213-105
12-well plate	BD Biosciences	353043
200 proof Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Xylene	Acros Organics	1330-20-7	Hazardous.
Permabond 200	Permabond LLC	GF2492
25 mL serological pipette	Sigma	SIAL1489
Parafilm	Midsci	HS234526C
Vibratome	World Precision Instruments	NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice	The Jackson Laboratory	000664
Axio Imager 2	ZEISS	Multiple components, see website for details.
AxioCam MRc Camera	ZEISS	426508-9902-000
Staining Dish , Green	Tissue-Tek	62541-12
Staining Dish Set	Electron Microscopy Sciences	70312-20
Motorized Pipet Filler	Fisher	03-692-168
Neurolucida	mbf Bioscience
Neurolucida Explorer	mbf Bioscience
Prism	GraphPad