Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Özet

Burada ayrıntılı bir Golgi-Cox protokolünü sunuyoruz. Bu güvenilir doku lekesi metodu, minimal sorun giderme ile hipokampustaki ve tüm beyindeki sitolojik mimarinin yüksek kaliteli bir değerlendirmesini sağlar.

Özet

Dendritik dikenler, eksitatör sinapslar içeren nöronal dendritik millerin çıkıntılarıdır. Hipokampus içerisindeki nöronal dendritlerin morfolojik ve dallanmış varyasyonları biliş ve hafıza oluşumuyla ilişkilendirilir. Golgi boyama için çeşitli yaklaşımlar vardır, bunların hepsi dendritik alandların morfolojik özelliklerini belirlemek ve belirgin bir arka plan oluşturmak için kullanışlıdır. Mevcut Golgi-Cox yöntemi (ticari bir Golgi boyama kiti ile sağlanan protokolün ufak bir varyasyonu), kemoterapötik ilaç olan 5-flurouracil'in (5-Fu) nispeten düşük dozunun dendritik morfolojiyi nasıl etkilediğini değerlendirmek üzere tasarlanmıştır , Omurganın sayısı ve hipokampüs içindeki işlenmesi karmaşıklığı. 5-Fu, dendritik karmaşıklığı önemli derecede modüle etti ve bölgeye özel bir şekilde, hipokampustaki omurga yoğunluğunu azalttı. Sunulan veriler, Golgi boyama yönteminin efOlgun nöronları, CA1, CA3 ve hipokampus diş açısı (DG) lekelemiştir. Bu protokol, diğer araştırmacıların beyne dokuları yüksek kaliteli sonuçlar ve minimum sorun giderme ile güvenilir şekilde boyayabilmesi için her adımın ayrıntılarını bildirir.

Giriş

Dendritler, presinaptik girdi ^1'i alan ve işleyen nöronların en büyük kısmıdır. Dendritik süreçleri, proksimal dalların distal dallardan daha büyük bir çapa sahip olduğu karmaşık bir geometriye sahiptir. Dendritler geliştikçe, dendritik arborizasyon olarak adlandırılan bir süreçte diğer nöronlarla birkaç bağlantı oluştururlar. Bu dallanma miktarı ve paterni, bir dendrite'nin ^2'yi yeterince işleyebildiği sinaptik girdilerin miktarını belirler.

Dendritik koordinasyon, aktiviteye bağlı plastisite ve nöronal devrelerin düzgün gelişimi için gerekli bir süreçtir. Uzatma, geri çekme, dallanma ve sinaptojenez intrensek genetik programlar ve ekstrensek faktörlerden etkilenen karmaşık süreçlerdir. Hipokampus içerisindeki nöronal dendritlerin morfolojik ve dallanmış varyasyonları biliş ve hafıza oluşumuyla ilişkilendirilirF "> 3 ^{, 4.} Dendritik karmaşıklıktaki değişiklikler patofizyolojik ve davranışsal değişikliklerle ilişkilidir ^5. Anormallikler Kırılgan X Sendromu ve Down Sendromu ⁶ dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir.

Dendritik omurgalar, merkezi sinir sistemi içinde heyecan verici girdiler alan dendritik arbelerin uzmanlaşmış subselüler bölmeleridir. Dendritik dikenlerin üç morfolojik sınıfı vardır, her sınıfa boyutları ve şekilleri temel alınarak adı verilmiştir: 1) diğer dikenlere göre daha fazla glutamat reseptörü ile kompleks postsinaptik yoğunluklara sahip olan mantar dikenleri; 2) kökten yoksun sağlam dikenler; Ve 3) uzunlamasına dar bir gövdeden ve küresel bir baştan oluşan ince dikenler. Dendritik omurga hacmi, onları kısmen tanımlamak için kullanılır; genellikle küçük ince dikenler (0.01 μm3 ) Mantar omurgalarına kıyasla (0.8 μm ³ ) ^{9 , 10} . Omurgalar olgunlaşma ile dengelenir. Örneğin, ince dikenler birkaç gün sonra geri çekilir veya mantar omurgalarına dönüşür. Alternatif olarak, mantar dikenleri nispeten kararlıdır ve uzun süre hayatta kalabilir. Nöronal bağlantıların kuvvetinin dikenlerin sayısına ve / veya hacmine ^{11 , 12 , 13} dayalı olduğu düşünülmektedir.

Klasik Golgi boyama yöntemi ve daha modern varyasyonları, dendritik omurga morfolojisi ve yoğunluğunu incelemek için kullanışlıdır. Golgi boyamasının benzersiz bir özelliği, rasgele toplam nöronların% 5'ini lekelediğidir, bu da bireysel nöronların izini sağlar 14,15. Golgi metasının tam mekanizması olsa daOd lekeleri bireysel nöronlar hala bilinmemektedir, yöntemin prensibi, gümüş kromat (Ag ₂ CrO ₄ ) ^{16 , 17'nin} kristalleşmesine dayanmaktadır. Golgi yönteminin üç ana türü vardır: hızlı Golgi, Golgi-Cox ve Golgi-Kopsch ^{18 , 19} . Her üç yöntem de birkaç gün ila aylarca krom tuzlarında ilk inkübasyon evresi ile başlar ancak aralarında bazı önemli farklar vardır. Hızlı Golgi, ilk aşamada osmiyum tetroksit kullanırken, Golgi-Kopsch paraformaldehid içerir. Hem hızlı Golgi hem de Golgi-Kopsch boyama sonrasında, yaklaşık% 7 oranında,% 1-2 gümüş nitrat solüsyonunda inkübe edilir. Golgi-Cox yöntemi gümüş nitrat yerine mercurik klorür ve potasyum dikromat kullanır ve 2-4 hafta süreyle emprenyasyon süresine sahiptir. Dokular daha sonra kesitlendirilir ve seyreltilmiş amonyakÇözeltiyi, ardından tuzları gidermek için bir fotoğrafik düzeltici uygulayın. Üç tipten Golgi-Cox yönteminin, kısmen arka plana müdahale etmeden dendritik aplikleri boyamakta en iyi olduğu düşünülmektedir, çünkü kısmen kristal yapılar doku yüzeyinde oluşmaz (hızlı Golgi yönteminde olduğu gibi) ^{17 , 20 , 21} .

Mevcut yöntem, ticari bir Golgi boyama kiti ile sağlanan protokolün hafif bir varyasyonudur ve nispeten düşük bir dozda 5-Fu'nın dendritik morfolojik özellikleri ve omurganın yoğunluğunu nasıl etkilediğini değerlendirmek üzere tasarlanmıştır. Elde edilen veriler, kemoterapötik tedavinin nöronal devreleri nasıl etkilediği konusunda daha fazla bilgi sağlayabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Denemeler, UAMS 'da Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan etik standartlara uygun olarak yürütülmüştür.

1. Hayvanlar ve 5-Fu Enjeksiyon Paradigması

1. 6 aylık erkek C57Bl6 / J vahşi tipli fareler satın alarak bunları 1 yaşına gelene kadar sabit 12 saat aydınlık / karanlık döngü içinde yerleştirin.
2. 5-Fu'yı% 0.9 steril tuzlu suda inceltin. Fare başına gerekli doz olarak 60 mg / kg kullanın.
3. 5-Fu'nun intraperitoneal enjeksiyonlarını yapın (haftada bir kez üç hafta boyunca).
   1. Her gün aynı periyotta intraperitoneal enjeksiyonları verin. Örneğin, saat 09.00-1200 arasında.
4. Hayvanları durdurun ve son enjeksiyondan 30 gün sonra beyinlerini alın.

2. Ötenazi Prosedürü ve Beyin Çıkarma

1. Kemirgenleri sıkın ve kuyruk tabanı tutun. Öte yandan başparmak ya da parmağınızıKemirgen hayvanının boynu tabanı. Kemiricinin boynuna hızla baskı uygulayın ve diğer eliniz kuyruk tutarken geriye doğru çekin.
2. Kemirganı bir elinizle ve büyük makas makinesini diğeri ile tutun. Kemirgenlerin boynunu iki bıçak arasına yerleştirin ve kafayı çabucak kesin.
3. Kopmuş fare kafasını kaldırın ve kafatasının üstündeki kürkü düzeltmek için ince makasları kullanın. Daha sonra, makasın uçlarını her bir göz soketine yerleştirin ve hafifçe kuvvetle makarayı kapatın.
4. Serebellumun sağında ve solunda kafatasını kesmek için yaylı makas kullanın.
5. Serebellumu çevreleyen kafatasının bir kısmını yukarı kaldırıp kaldırmak için forseps kullanın.
6. Kafatasının midsagittal çizgisini kesmek için makas kullan.
7. Kafatasının kalan kısmını beyinden kaldırmak için forseps kullanın.
8. Beyni istenilen kaba koymak için bir spatula ve bir sonda kullanın. Paslanmaz çeliktenTeel bıçakla, her beyin midsagital düzlem boyunca kes. Sağ hemisferlerde aşağıdaki Golgi-Cox yöntemini uygulayın.

3. Golgi Boyama ve Doku Hazırlama

1. Yeni hasat edilen yarım beyinleri, 10 mL'lik konik bir tüpteki 5 mL cıva klorür esaslı çözeltiye (kitten çözelti A) daldırın. Cıvalı klorür çözeltisi ışığa duyarlıdır; Tüpü folyo ile örtün. Numuneyi oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
   NOT: Çözüm A, malzeme tablosunda listelenen kit içinde sağlanmıştır. Dikkat! Çözelti A (ayrıca civalı klorür çözeltisi olarak da adlandırılır), potasyum dikromat, mercurik klorür ve potasyum kromat gibi toksik reaktifler içerir. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın.
2. 1 gün sonra solüsyonu geçici bir kaba (büyük bir tartım botu gibi) yavaşça boşaltın ve bir biyolojik tehlikeli atık kabına atın. Beyinlerini (orijinal 10 mL konik tüplerde hala) 5 mLMercurik klorür solüsyonu ilave edin ve numuneyi oda sıcaklığında 13 gün daha karanlığa döndürün.
3. 90 ml damıtılmış veya deiyonize suya (dH20) 30 g emdirme sonrası tampon ekleyin. 6 oyuklu bir tabakın her kuyucuğunu 6.5 ml'lik post-emprenye tamponuyla, beyne göre birer tane doldurun
   NOT: Emdirme sonrası tampon maddesi, malzeme tablosunda listelenen kit içinde sağlanmaktadır.
   1. Cıva klorür solüsyonunda 14 gün sonra (toplamda), dokuyu dH20 ile durulayın, daha sonra emdirme sonrası tamponla birlikte 6 gözlü plakalara aktarın. Tabakları folyo ile örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.
4. 1 gün daldırıldıktan sonra emprenye sonrası tampon maddeyi pipetleyin ve yeni emdirme sonrası tampon ile yenileyin; Oda sıcaklığında karanlıkta 1 gün saklayın. Gerekirse, bunu 1 aya kadar 4 ° C'de saklayın ²² .

4. Kesit alma

1. Kapaklardaki 12 yuvalı plakları, soldan sağa ve yukarıdan aşağıya artan sırayla numaralandırın.
2. Beynin her birine bölünürse, beyin başına iki ya da üç 12 plakalı tabak hazırlayın.
   1. Her bir 12 bölmeli plakanın üst kısmını, kesit alan beyin tanımlama numarası ile etiketleyin.
   2. Her plakanın her kuyusuna 2 mL 1x PBS pipetleyin.
3. Sahneyi kurun ve vibratome'yu açın; Dokuyu kapatacak kadar kapta yeterli 1x PBS bulunduğundan emin olun.
   1. İki parça plastik parafin filmi kesin ve iki kat daha katlayın. 1x PBS'nin sayaca sızmasını önlemek için numune tutacağı çıkıntılarının deliklerine yerleştirin.
   2. Şişeyi örnek tutucunun doku bloğuna koyun ve sonra siyanoakrilat yapışkan tutkalı (malzeme tablolarına bakın) koyun.
4. Beyni 6 kuyucuklu plakadan çıkarın ve bir plastik veya cam tabak üzerine koyun. Paslanmaz çeliktenSerebellumun yarısını kesmek için çelik iki kanatlı bıçak.
   1. Serebellini kaudally kesin. Kalan kalan serebellinin bile eşit olduğundan emin olun.
5. Geri kalan serebellumun düz yüzeyini tutkal üzerine derhal yerleştirin.
   NOT: Dokunun dorsal kısmı (serebral korteks) bıçağın sağına veya sağına bakmalıdır. Daha önce koku alma ampulünün bulunduğu rostral uç yukarı bakmalıdır.
   1. Tutkalın tamamen kurutulduğundan emin olmak için en az birkaç dakika bekleyin.
6. Beyni yerinde tutan yapışkan kuruysa da numune banyosuna 1x PBS dökün. Tutkal kuruduktan sonra numune tutacağını doku ile birlikte numune banyosuna yerleştirin.
   1. Doku örneği tam olarak kaplanmamışsa, numune banyosuna 1x PBS daha dökün.
7. Bıçağı, vibratomun bıçak tutucusuna ve yavaşça l1x PBS'ye tamamen batıncaya kadar bıçağı numune banyosuna geçirin. Bıçağı, dokunun üstünün biraz altına düşene kadar indirmeye devam edin.
8. Vibrasyon hızı 7'ye, genliği 6'ya ve kesme açısını 12 °'ye ayarlayın (vibratome model için malzeme tablosuna bakın). Titreşimi başlatın ve 200 μm kesitleri kesin ²³ .
   1. Doku bölümlerini numune banyosundan 12 oyuklu plakaların belirlenmiş her bir oyuğuna taşımak için büyük bir fırça kullanın.
9. İstenen sayıda doku kesitine ulaşana kadar dokuyu kesmeye devam edin.

5. Post-boyama

1. Aşağıdaki boyama adımları ve durulamalar için her biri için belirtilen çözeltiden 2 mL kullanın. Çözümleri oyuklara aktarmak için motorlu bir pipet dolgusu kullanın (materyal tablosuna bakın). Çözümleri kuyulardan ve uygun atıklara aktarmak için bir transfer pipeti (bkz. Malzeme tablosu) kullanınkonteynerler.
2. Parçaları 0.01 M PBS-T'nin bir 30 dakika yıkamasında durulayın (3.0 mL deterjan ekleyin (materyal tablosuna bakın) 1000 mL 0.01 M PBS'ye ekleyin).
3. Amonyum hidroksit solüsyonunu (Dikkat) 3: 5 oranında dH20 ile seyreltin, kullanımdan hemen önce. Seyreltilmiş amonyum hidroksit solüsyonundaki kısımları 19-21 dakika boyunca boyayın.
   1. Işık hassas amonyum hidroksit solüsyonunu folyo ile koruyun.
      NOT: Çözeltideki amonyum hidroksit konsantrasyonu ~% 10'dur ve "tehlikeli" olarak sınıflandırılmıştır. Amonyum hidroksit çözeltisi deriyle temas halinde yanıklara neden olabilir. Solunduğunda solunum borusu tahrişine neden olabilir. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın.
4. Bölümleri, boyama sonrası tamponda boyayın (19 dakika boyunca 21 dakika boyunca 500 mL dH20 içinde 90 g reaktif D ekleyin). Boyama sonrası tampon ışığa duyarlıdır; Folyo ile koruyun ²² .
5. Kesitleri üç, 0.01 M PBS-T'nin 5-10 dk yıkaması.

6. Montaj, Temizleme ve Kaplama

1. Büyük fırça ile% 1 jelatin kaplı slaytlara bölümleri monte edin. Oda sıcaklığında 20-30 dakika boyunca kurumalarını bekleyin ve sonra gece boyunca bir Coplin kavanozuna koyun.
2. Eldivenleri eldivenli ellerle Coplin kavanozundan çıkarın ve plastik bir rafa koyun (materyal tablosuna bakın). Plastik rafı% 100 etanol içeren boyama kabına (bkz. Malzeme tablosu) yerleştirin. Onları üç tane 5 dk yıkayarak kurutun.
3. Slaytları, her biri% 99 ksilen içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Sürgüleri bir cam rafa yerleştirin ve rafı, metal saplı ksilen içeren bir cam boyama kabına indirin (bkz. Malzeme tablosu).
   NOT: Dikkat, ksilen inhale edildiğinde zararlıdır ve deriye dokunursa tahrişe neden olur. Sıvı ve buhar hallerinde son derece yanıcıdır. Koruyucu eldiven takın ve duman kabininde çalışın.
4. Slaytları xyl'den kaldırEne birer birer alın ve dokuyu ~ 0.25 mL montaj medyasıyla hızlıca kaplayın (bkz. Malzeme Tablosu). Daha sonra, slayt kapaklarını alın ve onları ortamın üzerine koyun.
   1. Kapakların altındaki sıkışmış hava kabarcıklarını, bir fırça sonu gibi kör bir nesneyle kenara itin.
5. Slaytları güneş ışığından uzak bir alana yerleştirin ve 2-3 gün kurumalarını bekleyin.
6. Bir mikroskop kullanarak görüntü elde etmeye ve uygun yazılımla analiz etmeye devam edin.

7. Görüntü Yığını Edinme

1. Görüntüleme programını açın (bkz. Malzeme Tablosu ). Slayt mikroskop sahnesine yerleştirin. Programın üst kısmındaki menüde, "Edinme" yi tıklayın ve ardından "Canlı Resim" i tıklayın.
2. Mikroskopu 10X yapın. Tercih nöronunu belirleyin ve ardından kırmızı bir X gibi görünen imleci soma'nın merkezine getirin. Referans noktasını ayarlamak için sol tıklayın.
3. Mikroskopu 40X yapın. Programın üst kısmındaki menüden "Taşı" yı tıklayın ve ardından "Referans Noktasına" tıklayın.
4. Odak dışına gelene kadar dokunun üzerindeki ince objektifi elle kaydırarak görüntü yığını oluşturmaya başlayın.
   1. "Image Acquisition" başlığı altındaki programın sağ alt köşesindeki "Üstü Ayarla" yı tıklayın.
   2. Dokudan biraz dışarı doğru kaydırın ve ardından "Resim Alma" altındaki "Altını Ayarla" yı tıklayın. Ardından, "Görüntü Yığını Al" ı tıklayın.
5. Görüntü yığını edinildikten sonra, görüntülenen pencerede görüntü dosyası için istediğiniz adı yazın. "MBF Ascii dosyası" olarak kaydedin.
   1. İstendiğinde, dosya türünü "MBF JPEG2000 yığın dosyası" olarak seçin ve ardından "Kaydet" i tıklayın.

8. Nöronal İzleme

1. Toolba'daR menüsünün altındaki "Kontur Adı" başlıklı kutuyu tıklayın. Açılır menüden "Soma" yı seçin.
2. Elle soma izini almak. Ardından sağ tıklayın ve izleme tamamlandığında "Cell Body'yi Sonlandır" ı seçin.
3. "AutoNeuron Workflow" başlıklı başka bir sekme açmak için "AutoNeuron" u seçin.
4. "Yapılandırma Türü" nin altında "Yeni" yi seçin. Parametreleri ayarlayın ve "Soma Algılama" alt başlığını getirmek için "Sonraki Adım" ı tıklayın.
   1. Parametreleri ayarlamak için "Parlaklık Alanı" nı seçin. Ardından, "Maksimum İşlem Çapı" altında, "Ölçüm Başlat" ı tıklayın. İmleci kullanarak, dendritin tabanına gidin ve elle çapı ayarlayın.
5. Kullanıcının tüm görüntüyü izlemesini isteyen pencerede "Evet" seçeneğini tıklayın. Elle soma izini almak. "Tohum Yerleşimi" alt başlığını getirmek için Tıklayın ve ardından "Sonraki adım" a tıklayın.
6. "Doğrulama Tohumunu" tıklayınS "yazıp" Next Step "e basarak" Neuron Reconstruction "alt başlığını getirin.
7. "Neuron" altında, "Etkileşimli" yi tıklayın. Dendritlerin programındaki yönergeleri izleyerek ve program tarafından izlenen vurgulanan alanı tamamlamak için sağ tıklayarak etkileşimli izlemeyi gerçekleştirin. Tüm dendritleri izledikten sonra "Sonraki Adım" ı tıklayın.
8. Yeni bir pencere göründükten sonra, yeni konfigürasyonu istediğiniz başlık ile kaydedin. "Kaydet" i tıklayın.

9. Analiz

1. Analiz programını açın (materyal tablosuna bakın).
2. Üst menüden "Dosya" yı tıklayın ve ardından "Veri Dosyasını Aç" ı tıklayın. İlgilenilen dosyayı seçin.
3. Analiz alt başlığı altında, "Sholl Analizi" ni seçin.
4. "Sholl Analysis" penceresinde başlangıç ​​yarıçapını 10 μm olarak ayarlayın. "Analiz" altında, "Dendritler" ve "Şube Siparişleri" kutularını tıklayın.
5. Sağ clYeni açılan pencereleri tıklayın ve "Excel Dışa Aktar" ı tıklayın. "Kaydet" i tıklayın.
6. Analizde "Dallanmış Yapı Analizleri" ni tıklayın. "Tüm Olası Analizler" i seçin.
7. Yeni açılan pencereyi sağ tıklatın ve "Excel Dışa Aktar" ı tıklayın ²⁴ .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

5-Fu işleminin, Golgi ile boyanmış beyin bölümlerinin hipokampusundaki dendritik taşlama ve kompleksite üzerindeki etkileri, ticari olarak mevcut bir görüntüleme yazılımı kullanılarak nicelleştirildi ve izlendi. İzlemeden sonra, dendritik kabarcıklanma, omurga yoğunluğu ve omurga morfolojisi Sholl analizi ve dendritik karmaşıklık indeksi (DCI) kullanılarak analiz edildi. Sholl analizi, dendritik çember morfolojisini belirlemek için kullanılan nicel bir analitik ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Daha modern tekniklerle karşılaştırıldığında, Golgi-Cox yöntemi, omurga morfolojisini incelemek için tercih edilen yöntem olan çeşitli avantajlara sahiptir: 1) Boyama esasen herhangi bir doku için kullanılabilir 2) Basit bir ışık mikroskopu kurulumu, 3) Golgi-Cox görüntüleme konfokal görüntülemeden daha hızlıdır ve 4) Golgi lekeli bölümler birkaç ay ila yıllarca floresanla işaretlenmiş örneklerden daha uzun süre yaşayabilir. Bu avantajlarla bile, Golgi-Cox yönteminin hala bazı sın?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
superGolgi Kit	Bioenno Lifesciences	30100	Contains hazardous materials.
PBS 10x powder concentrate	Fisher	BP665-1
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
Permount	Fisher	SP 15-100
Slide cover	Fisher	12-546-14
7 mL Transfer pipette	Globe Scientific	135030
10 mL Falcon tubes	BD Biosciences	352099
Foil	Fisher	01-213-105
12-well plate	BD Biosciences	353043
200 proof Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Xylene	Acros Organics	1330-20-7	Hazardous.
Permabond 200	Permabond LLC	GF2492
25 mL serological pipette	Sigma	SIAL1489
Parafilm	Midsci	HS234526C
Vibratome	World Precision Instruments	NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice	The Jackson Laboratory	000664
Axio Imager 2	ZEISS	Multiple components, see website for details.
AxioCam MRc Camera	ZEISS	426508-9902-000
Staining Dish , Green	Tissue-Tek	62541-12
Staining Dish Set	Electron Microscopy Sciences	70312-20
Motorized Pipet Filler	Fisher	03-692-168
Neurolucida	mbf Bioscience
Neurolucida Explorer	mbf Bioscience
Prism	GraphPad