Évaluation de la complexité dendritique de l'hippocampe chez les souris vieillies utilisant la méthode de Golgi-Cox

Résumé

Nous présentons ici un protocole Golgi-Cox avec beaucoup de détails. Cette méthode de tache tissulaire fiable permet une évaluation de haute qualité de la cytoarchitecture dans l'hippocampe et dans tout le cerveau, avec un dépannage minimal.

Résumé

Les épines dendritiques sont les protubérances des arbres dendritiques neuronaux qui contiennent des synapses excitatrices. Les variations morphologiques et ramifiées des dendrites neuronales dans l'hippocampe sont impliquées dans la cognition et la formation de la mémoire. Il existe plusieurs approches pour la coloration de Golgi, qui ont tous été utiles pour déterminer les caractéristiques morphologiques des arbrisseaux dendritiques et produire un fond clair. La présente méthode de Golgi-Cox (une légère variation du protocole qui est fourni avec un kit de coloration Golgi commercial) a été conçue pour évaluer comment une dose relativement faible du médicament chimiothérapeutique 5-flurouracile (5-Fu) affecterait la morphologie dendritique , Le nombre d'épines et la complexité de l'arborisation dans l'hippocampe. Le 5-Fu modulait de manière significative la complexité dendritique et réduisait la densité de la colonne vertébrale tout au long de l'hippocampe de manière spécifique à une région. Les données présentées montrent que la méthode de coloration de GolgiColoré efficacement les neurones matures dans le CA1, le CA3 et le gyrus denté (DG) de l'hippocampe. Ce protocole rapporte les détails pour chaque étape afin que d'autres chercheurs puissent tacher les tissus de façon fiable dans tout le cerveau avec des résultats de haute qualité et un dépannage minimal.

Introduction

Les dendrites sont la plus grande partie des neurones qui reçoivent et traitent l'entrée présynaptique ¹ . Leurs procédés dendritiques ont une géométrie complexe, où les branches proximales ont un diamètre plus grand que les branches distales. À mesure que les dendrites se développent, elles forment plusieurs connexions avec d'autres neurones dans un processus appelé arborisation dendritique. L'étendue et le motif de cette ramification détermine la quantité d'entrées synaptiques qu'un dendrite peut traiter de manière adéquate ² .

L'arborisation dendritique est un processus nécessaire pour la plasticité dépendant de l'activité et le développement approprié des circuits neuronaux. L'extension, la rétraction, la ramification et la synaptogenèse sont des processus complexes qui incluent des programmes génétiques intrinsèques et des influences de facteurs extrinsèques. Les variations morphologiques et ramifiées des dendrites neuronales dans l'hippocampe sont impliquées dans la cognition et la formation de la mémoireF "> 3 ^{, 4.} Les altérations de la complexité dendritique sont associées à des changements physiopathologiques et comportementaux ^5. Les anomalies sont liées à plusieurs états pathologiques, y compris le syndrome du X fragile et le syndrome de Down ⁶ .

Les épines dendritiques sont les compartiments sous-cellulaires spécialisés des arbrisseaux dendritiques qui reçoivent une entrée excitatrice dans le système nerveux central. Il existe trois classes morphologiques d'épines dendritiques, avec le nom de chaque classe en fonction de leur taille et leur forme: 1) épines de champignon, qui ont des densités postsynaptiques complexes avec plus de récepteurs de glutamate que d'autres épines ⁷ ; 2) épines tronquées, qui n'ont pas de tige; Et 3) épines minces, qui se composent d'une tige longue et prolongée et d'une tête globulaire ⁸ . Le volume dendritique de la colonne vertébrale est utilisé en partie pour les définir, avec des épines minces généralement plus petites (0,01 μm ³ ) Par rapport aux épines des champignons (0,8 μm ³ ) ^{9 , 10} . Les épines se stabilisent avec la maturation. Par exemple, les épines fines se rétractent après quelques jours ou se développent en épines de champignons. Alternativement, les épines des champignons sont relativement stables et peuvent survivre pendant une période prolongée. La force des connexions neuronales est pensée selon le nombre d'épines et / ou leur volume ^{11 , 12 , 13} .

La méthode classique de coloration de Golgi et ses variations plus modernes ont tous été utiles pour examiner la morphologie et la densité de la colonne vertébrale dendritique. Un aspect unique de la coloration de Golgi est qu'il taches aléatoires d'environ 5% des neurones totaux, ce qui permet le traçage des neurones individuels ^{14 , 15} . Bien que le mécanisme exact dans lequel la méthamphétamie de GolgiLes tumeurs individuelles sont encore inconnues, le principe de la méthode est basé sur la cristallisation du chromate d'argent (Ag ₂ CrO ₄ ) ^{16 , 17} . Il existe trois types principaux de la méthode de Golgi: le Golgi rapide, le Golgi-Cox et le Golgi-Kopsch ^{18 , 19} . Les trois méthodes commencent par une phase d'incubation initiale dans des sels de chrome pendant plusieurs jours à plusieurs mois, mais il existe certaines différences clés entre elles. Le Golgi rapide utilise du tétroxyde d'osmium dans la première étape, tandis que le Golgi-Kopsch comprend du paraformaldéhyde. La coloration à la fois du Golgi rapide et du Golgi-Kopsch est suivie d'une incubation dans une solution de nitrate d'argent 1-2% pendant environ 7 jours. La méthode de Golgi-Cox utilise du chlorure de mercure et du dichromate de potassium au lieu du nitrate d'argent et a un temps d'imprégnation de 2-4 semaines. Les tissus sont ensuite sectionnés et placés rapidement dans un ammoniac diluéSolution, suivie d'un fixateur photographique pour éliminer les sels. Parmi les trois types, on pense que la méthode de Golgi-Cox est la meilleure pour la coloration des arbrisseaux dendritiques sans beaucoup d'interférences de fond, en partie parce que les artefacts de cristal ne se produisent pas à la surface du tissu (contrairement à la méthode rapide de Golgi) ^{17 , 20 , 21} .

La présente méthode est une légère variation du protocole fourni avec un kit de coloration Golgi commercial et a été conçue pour évaluer comment une dose relativement basse du 5-Fu affecterait les caractéristiques morphologiques dendritiques et la densité de la colonne vertébrale. Toute donnée acquise pourrait donner une idée plus approfondie de la façon dont le traitement chimiothérapeutique affecte les circuits neuronaux.

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Protocole

Les expériences ont été menées conformément aux normes éthiques approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux à l'UAMS.

1. Animaux et paradigme d'injection 5-Fu

1. Achetez des souris de type sauvage mâle C57Bl6 / J de 6 mois et les héberger sous un cycle continu clair / clair de 12 h jusqu'à ce qu'elles atteignent l'âge de 1 an.
2. Diluer le 5-Fu dans une solution saline stérile à 0,9%. Utilisez 60 mg / kg comme dose requise par souris.
3. Donner les injections intrapéritonéales du 5-Fu (une fois par semaine pendant trois semaines).
   1. Donner les injections intrapéritonéales autour du même temps chaque jour. Par exemple, entre 09h00 et 12h00.
4. Éuthaniser les animaux et extraire les cerveaux 30 jours après l'injection finale.

2. Procédure d'euthanasie et extraction du cerveau

1. Rallumez le rongeur et saisissez la base de la queue. D'autre part, placez le pouce ou le premier doigtE base du cou du rongeur. Pressez rapidement le cou du rongeur et enfoncez en même temps que l'autre main tendant la queue vers l'arrière.
2. Tenir le rongeur d'une main et les gros ciseaux chirurgicaux avec l'autre. Placez le cou du rongeur entre les deux lames et décapitez rapidement la tête.
3. Prenez la tête de la souris coupée, et utilisez les ciseaux fins pour couper la fourrure au-dessus du crâne, jusqu'à l'oeil. Ensuite, placez les pointes des ciseaux dans chaque douille oculaire et fermez les ciseaux avec une légère force.
4. Utilisez des ciseaux à ressort pour couper le crâne à gauche et à droite du cervelet.
5. Utilisez des pinces pour soulever la partie du crâne entourant le cervelet directement de haut en bas.
6. Utilisez les ciseaux à ressort pour couper le long de la ligne midsagittal du crâne.
7. Utilisez la pince pour soulever la partie restante du crâne hors du cerveau.
8. Utilisez une spatule et une sonde pour extraire le cerveau dans le contenant désiré. Utilisation d'un acier inoxydableTaper la lame, couper chaque cerveau le long de l'avion midsagittal. Effectuez la méthode suivante de Golgi-Cox sur les hémisphères droit.

3. Coloration de Golgi et préparation des tissus

1. Immergez les demi-cerveaux récemment récoltés dans une solution à base de chlorure mercurique de 5 ml (solution A du kit) dans un tube conique de 10 ml. La solution de chlorure de mercure est sensible à la lumière; Recouvrir le tube avec du papier d'aluminium. Rangez l'échantillon dans l'obscurité à température ambiante.
   REMARQUE: la solution A est fournie dans le kit qui figure dans la table des matières. Mise en garde! La solution A (également appelée solution de chlorure mercurique) contient des réactifs toxiques tels que le dichromate de potassium, le chlorure de mercure et le chromate de potassium. Porter des gants de protection et travailler dans une hotte aspirante.
2. Après 1 jour, décanter lentement la solution dans un récipient provisoire (comme un gros bateau à peser), et la jeter dans un conteneur de déchets biologiques. Immergez le cerveau (encore dans les tubes coniques de 10 ml d'origine) avec 5 mL deLa solution de chlorure de mercure et renvoyer l'échantillon à l'obscurité à température ambiante pendant 13 jours de plus.
3. Ajouter 30 g de tampon post-imprégnation à 90 ml d'eau distillée ou désionisée (dH ₂ O). Remplissez chaque puits d'une plaque à 6 puits avec 6,5 ml du tampon post-imprégnation, un puits par cerveau
   REMARQUE: le tampon après imprégnation est fourni dans le kit figurant dans la table des matières.
   1. Après 14 jours (au total) dans la solution de chlorure mercurique, rincer le tissu avec du dH ₂ O, puis les transférer dans des plaques à 6 puits avec un tampon après imprégnation. Couvrez les plaques avec du papier d'aluminium et rangez-les à température ambiante dans l'obscurité.
4. Pipetter le tampon après imprégnation après 1 jour d'immersion et renouveler avec un tampon de post-imprégnation frais; Conserver pendant 1 jour dans l'obscurité à température ambiante. Si nécessaire, conservez ce à 4 ° C pendant 1 mois maximum ²² .

4. Section

1. Étiquetez les plaques à 12 puits sur leurs couvercles avec des chiffres en ordre croissant de gauche à droite et vers le haut vers le bas.
2. Préparez deux ou trois plaques de 12 puits par cerveau si vous sectionnez tout le cerveau.
   1. Étiquetez le haut de chaque couvercle de plaque de 12 puits avec le numéro d'identification du cerveau sectionné.
   2. Pipettez 2 mL de 1x PBS dans chaque puits de chaque assiette.
3. Mettre en place la scène et allumer le vibratome; Assurez-vous qu'il y a suffisamment de 1x PBS dans le récipient pour couvrir le tissu.
   1. Couper deux morceaux de film de paraffine en plastique et les plier deux fois. Placez-les sur les trous pour les boutons du porte-échantillon pour éviter que PBS ne pèche sur le comptoir.
   2. Mettez le ruban sur le bloc de tissu du porte-échantillon, puis posez-le sur une colle adhésive au cyanoacrylate (voir tableau).
4. Retirez le cerveau de la plaque à 6 puits et placez-le sur un plat en plastique ou en verre. Utilisez l'acier inoxydableLame à double tranchant en acier pour couper environ la moitié du cervelet.
   1. Couper le cervelet au caudal. Assurez-vous que la partie du cervelet restant est égale.
5. Placez immédiatement la surface plane du cervelet restant sur la colle.
   NOTE: La partie dorsale du tissu (le cortex cérébral) doit être tournée vers la gauche ou vers la droite par rapport à la lame. L'extrémité rostrale qui contenait précédemment l'ampoule olfactive attachée devrait faire face vers le haut.
   1. Attendez au moins quelques minutes pour vous assurer que la colle sèche complètement.
6. Alors que la colle qui maintient le cerveau en place est en train de sécher, versez 1x PBS dans le bain d'échantillon. Une fois la colle séchée, placez le porte-échantillon avec le tissu dans le bain d'échantillon.
   1. Si l'échantillon de tissu n'est pas entièrement recouvert, versez plus de 1x PBS dans le bain d'échantillon.
7. Fixez la lame sur le porte-lame du vibratome et lentement lMettre la lame dans le bain de l'échantillon jusqu'à ce qu'il soit complètement immergé dans 1x PBS. Continuez à abaisser la lame jusqu'à ce qu'elle soit légèrement en dessous du haut du tissu.
8. Réglez la vitesse du vibratome sur 7, l'amplitude à 6 et l'angle de coupe à 12 ° (voir la table des matériaux pour le modèle vibratome). Démarrez les vibrations et coupez les sections de 200 μm ²³ .
   1. Utilisez un grand pinceau pour déplacer les sections de tissu du bain d'échantillon dans chaque puits désigné des plaques à 12 puits.
9. Continuer à couper le tissu jusqu'à ce que le nombre souhaité de sections de tissu soit atteint.

5. Post-coloration

1. Pour chacune des étapes de coloration et des rinçages suivants, utiliser 2 ml de la solution indiquée par puits. Utilisez un remplisseur de pipette motorisé (voir le tableau des matériaux) pour transférer les solutions dans les puits. Utilisez une pipette de transfert (voir le tableau des matériaux) pour transférer les solutions des puits et dans les déchets appropriésConteneurs.
2. Rincer les sections dans un lavage de 30 minutes de PBS-T 0,01 M (ajouter 3,0 ml de détergent (voir tableau de matériaux) à 1 000 ml de PBS 0,01 M).
3. Diluer la solution d'hydroxyde d'ammonium (Attention) 3: 5 en volume avec dH ₂ O immédiatement avant utilisation. Tacher les sections dans la solution diluée d'hydroxyde d'ammonium pendant 19-21 min.
   1. Protégez la solution d'hydroxyde d'ammonium sensible à la lumière avec du papier d'aluminium.
      REMARQUE: L'hydroxyde d'ammonium dans la solution a une concentration de ~ 10% et elle est classée comme "dangereuse". La solution d'hydroxyde d'ammonium peut provoquer des brûlures si elle entre en contact avec la peau. Cela peut provoquer une irritation des voies respiratoires si inhalé. Porter des gants de protection et travailler dans une hotte aspirante.
4. Tacher les sections dans le tampon post-colorant (ajouter 90 g de réactif D dans 500 ml dH ₂ O) pendant 19-21 min. Le tampon de post-coloration est sensible à la lumière; Protégez-le avec du papier d'aluminium ²² .
5. Rincez les sections en trois, 5-10 minutes de lavage de 0,01 M de PBS-T.

6. Montage, nettoyage et revêtement

1. Montez les sections sur 1% de glacières revêtues de gélatine avec le grand pinceau. Laissez-les sécher pendant 20-30 min à température ambiante, puis placez-les dans un pot de Coplin pendant la nuit.
2. Retirez les diapositives avec des mains gantées du pot de Coplin et placez-les dans une grille en plastique (voir la table des matières). Placez le support en plastique dans le plat de coloration (voir le tableau des matières) contenant 100% d'éthanol. Déshydratez-les avec trois lavages de 5 min.
3. Lavez les diapositives deux fois pendant 5 min chacun dans du xylene à 99%. Placez les diapositives dans une grille en verre et abaissez la crémaillère dans un plat de vitrage contenant du xylène avec une poignée métallique (voir la table des matières).
   REMARQUE: Attention, le Xylène est nocif par inhalation et provoque une irritation s'il touche la peau. Il est très inflammable dans les états liquide et vapeur. Porter des gants de protection et travailler dans une hotte aspirante.
4. Retirez les diapositives du xylEn un à la fois et couvrez rapidement le tissu avec ~ 0,25 ml de support de montage (voir la table des matériaux). Ensuite, prenez les coulisseaux et placez-les sur les médias.
   1. Poussez toutes les bulles d'air piégées sous les coulisseaux vers le bord avec un objet émoussé, comme la fin d'un pinceau.
5. Placez les glissières dans une zone à l'abri de la lumière du soleil et laissez-les sécher pendant 2-3 jours.
6. Procédez à l'acquisition d'images à l'aide d'un microscope et analysez avec le logiciel approprié.

7. Acquérir une pile d'images

1. Ouvrez le programme d'imagerie (voir Tableau des matériaux ). Placez la glissière sur la scène du microscope. Dans le menu en haut du programme, cliquez sur "Acquisition", puis cliquez sur "Live Image".
2. Mettre le microscope sur 10X. Identifiez le neurone de préférence, puis amenez le curseur, qui apparaît comme un X rouge, sur le centre du soma. Cliquez à gauche pour définir le point de référence.
3. Mettre le microscope à 40X. Cliquez sur «Déplacer» dans le menu en haut du programme, puis cliquez sur «Point de référence».
4. Commencez à créer la pile d'images en défilant manuellement avec l'objectif fin au-dessus du tissu jusqu'à ce qu'il soit légèrement hors de portée.
   1. Cliquez sur "Set Top" dans le coin inférieur droit du programme sous la rubrique "Acquisition d'image".
   2. Faites défiler légèrement sous le tissu jusqu'à ce qu'il soit légèrement hors de portée, puis cliquez sur "Set Bottom" sous "Image Acquisition". Ensuite, cliquez sur "Acquérir la pile d'images".
5. Une fois la pile d'images acquise, tapez le nom souhaité pour le fichier image dans la fenêtre qui s'affiche. Enregistrer sous "Fichier MBF Ascii".
   1. Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez le type de fichier comme "Fichier de pile MB2000 JPEG2000", puis cliquez sur "Enregistrer".

8. Traçage neuronal

1. Dans la toolbaDessous du menu, cliquez sur la case intitulée «Contour Name». Sélectionnez "Soma" dans le menu déroulant.
2. Tracer manuellement le soma. Ensuite, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez "Terminer le corps de la cellule" lorsque le suivi est terminé.
3. Sélectionnez "AutoNeuron" pour afficher un autre onglet intitulé "AutoNeuron Workflow".
4. Sous "Type de configuration", sélectionnez "Nouveau". Réglez les paramètres, puis cliquez sur "Prochaine étape" pour afficher la sous-position "Soma Détection".
   1. Pour définir les paramètres, sélectionnez "Brightfield". Ensuite, sous "Max Process Diameter", cliquez sur "Démarrer la mesure". À l'aide du curseur, accédez à la base du dendrite et définissez manuellement le diamètre.
5. Cliquez sur "Oui" dans la fenêtre qui demande à l'utilisateur de tracer l'image entière. Tracer manuellement le soma. Désinstalle, puis cliquez sur "Prochaine étape" pour afficher la sous-position "Placement de semences".
6. Cliquez sur "Valider la graine"S ", puis cliquez sur" Prochaine étape "pour afficher la sous-position" Neuron Reconstruction ".
7. Sous "Neuron", cliquez sur "Interactif". Effectuez un suivi interactif en suivant la direction du programme des dendrites et cliquez avec le bouton droit de la souris pour compléter la zone en surbrillance tracée par le programme. Après avoir tracé toutes les dendrites, cliquez sur "Prochaine étape".
8. Une fois qu'une nouvelle fenêtre apparaît, enregistrez la nouvelle configuration avec le titre souhaité. Cliquez sur "Enregistrer".

9. Analyse

1. Ouvrez le programme d'analyse (voir la table des matières).
2. Cliquez sur "Fichier" dans le menu principal, puis cliquez sur "Ouvrir le fichier de données". Sélectionnez le fichier d'intérêt.
3. Sous la sous-rubrique d'analyse, sélectionnez "Analyse Sholl".
4. Dans la fenêtre "Analyse Sholl", définissez le rayon de départ à 10 μm. Sous «Analyse», cliquez sur les cases «Dendrites» et «Branch Orders».
5. Droit ClIck la fenêtre nouvellement ouverte et cliquez sur "Excel Export". Cliquez sur "Enregistrer".
6. Sous l'analyse, cliquez sur "Analyses de structure dérivée". Sélectionnez "Toutes les analyses possibles".
7. Cliquez avec le bouton droit sur la fenêtre nouvellement ouverte et cliquez sur "Exporter Excel" ²⁴ .

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Résultats

Les effets du traitement 5-Fu sur l'arborisation et la complexité dendritiques dans l'hippocampe des sections cérébrales colorées par Golgi ont été quantifiés et tracés à l'aide d'un logiciel d'imagerie disponible dans le commerce. Après le traçage, l'arborisation dendritique, la densité de la colonne vertébrale et la morphologie de la colonne vertébrale ont été analysées à l'aide de l'analyse Sholl et de l'indice de complexité dendr...

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Discussion

Par rapport aux techniques plus modernes, la méthode de Golgi-Cox présente plusieurs avantages qui en font la méthode préférée pour l'examen de la morphologie de la colonne vertébrale: 1) La coloration peut être utilisée pour essentiellement n'importe quel tissu, 2) Une configuration de base du microscope optique est tout ce qui est nécessaire pour Acquérir des images basées sur Golgi, 3) L'imagerie de Golgi-Cox est plus rapide que l'imagerie confocale, et 4) Les sections colorées de Golgi s...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
superGolgi Kit	Bioenno Lifesciences	30100	Contains hazardous materials.
PBS 10x powder concentrate	Fisher	BP665-1
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
Permount	Fisher	SP 15-100
Slide cover	Fisher	12-546-14
7 mL Transfer pipette	Globe Scientific	135030
10 mL Falcon tubes	BD Biosciences	352099
Foil	Fisher	01-213-105
12-well plate	BD Biosciences	353043
200 proof Ethanol	Pharmco-AAPER	111000200
Xylene	Acros Organics	1330-20-7	Hazardous.
Permabond 200	Permabond LLC	GF2492
25 mL serological pipette	Sigma	SIAL1489
Parafilm	Midsci	HS234526C
Vibratome	World Precision Instruments	NVSLM1
C57Bl/6 Male Mice	The Jackson Laboratory	000664
Axio Imager 2	ZEISS	Multiple components, see website for details.
AxioCam MRc Camera	ZEISS	426508-9902-000
Staining Dish , Green	Tissue-Tek	62541-12
Staining Dish Set	Electron Microscopy Sciences	70312-20
Motorized Pipet Filler	Fisher	03-692-168
Neurolucida	mbf Bioscience
Neurolucida Explorer	mbf Bioscience
Prism	GraphPad