Examen ecocardiográfico e histológico de la morfología cardiaca en el ratón

Resumen

La examinación ecocardiográfica se utiliza con frecuencia en los ratones. Dispositivos de ecografía de alta resolución caro han sido desarrollados para este propósito. Este protocolo describe un procedimiento ecocardiográfico asequible combinado con análisis de morfometría histológica para determinar la morfología cardiaca.

Resumen

Un creciente número de modelos de ratón modificados genéticamente se ha convertido en disponible en los últimos años. Por otra parte, el número de los estudios farmacológicos realizados en ratones es alta. Caracterización fenotípica de estos modelos de ratón también requiere el examen de la morfología y la función cardiaca. La ecocardiografía y la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) son métodos utilizados para caracterizar la función cardiaca y morfología en ratones. Equipo ecocardiográfico y MRI especializado para uso en pequeños roedores es costoso y requiere un espacio dedicado. Este protocolo describe mediciones cardiacas en ratones usando un sistema ecocardiográfico clínico con una sonda vascular humano 15 MHz. Las mediciones se realizan en ratones adultos anestesiados. Al menos tres secuencias de imágenes se registran y se analizan para cada animal en modo M en la vista de eje corto paraesternal. Luego, la examinación histológica cardíaca se lleva a cabo, y cardiomiocitos diámetros se determinan con hematoxilina-aglutinina eosina o germen de trigo (WGA)-tinción de secciones de la parafina. Densidad del barco es determinada morfométricamente immunostaining de Pecam-1. El protocolo ha sido aplicados con éxito a los estudios farmacológicos y diferentes genética los modelos animales bajo las condiciones iniciales, así como después de infarto experimental por la ligadura permanente de la izquierda (anterior) de la arteria coronaria descendente CHAVAL). En nuestra experiencia, investigación ecocardiográfica se limita a los animales anestesiados y es factible en ratones adultos pesa por lo menos 25 g.

Introducción

Una gran variedad de modelos de ratón modificados genéticamente están disponibles, y el número de los estudios farmacológicos en ratones es alta^1,2. Ecocardiografía y MRI son métodos utilizados para la caracterización fenotípica de la función cardiaca y la morfología de estos modelos de mouse³. El protocolo presentado pretende analizar la función cardiaca y morfología en ratones adultos. Combina ecocardiográfica, histológicos, immunohistochemical y. La examinación ecocardiográfica es ampliamente utilizada en ratones^{4,5,6,7,8,9,10,11, 12}. Pachón et al. ¹¹ identificó 205 estudios publicados en circulación, la Investigación de circulación, Revista americana de fisiología - fisiología circulatoria y corazóne Investigación Cardiovascular entre 2012 y 2015 utilizan la examinación ecocardiográfica en animales.

La ecocardiografía se utiliza para identificar fenotipos cardíacos en ratones modificados genéticamente^{5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22}, así como para analizar la función cardiaca en hipertrofia inducida por sobrecarga crónica, isquemia miocárdica y cardiomiopatía modelos en ratones (revisados en¹²). Equipo de ecocardiografía mejorada permite la medida estándar de ventricular izquierda (LV) sistólicas y diastólicas dimensiones, Doppler tisular, ecografía de contraste miocárdico y la evaluación de la función regional del VI y reserva coronaria ¹². idealmente, la examinación ecocardiográfica debe realizarse en ratones conscientes para evitar los efectos negativos de la anestesia sobre la función contráctil, control reflejo autonómico, y ritmo cardíaco¹¹. Sin embargo, este enfoque está limitado por la necesidad de entrenar a los animales; dificultades para mantener la temperatura corporal estable; artefactos de movimiento; estrés; frecuencias cardíacas muy altas; y el requisito de al menos dos investigadores para llevar a cabo el experimento, especialmente si un gran número de animales está bajo investigación. Curiosamente, un estudio reciente divulgó ningunas diferencias en parámetros ecocardiográficos en animales entrenados y no entrenados¹⁹. Realizamos las mediciones ecocardiográficas en ratones anestesiados. Protocolos de anestesia diferentes se discutirá a continuación.

Aunque la ecocardiografía de resolución estándar (> 10 MHz) es suficiente para medir LV sistólico y diastólicas dimensiones y función cardiaca en ratones adultos, el método es limitado en su descripción de los fenómenos estructurales subyacentes. Por lo tanto, combinamos las mediciones en vivo con histológicos y análisis immunohistological para medir, por ejemplo, la densidad diámetro y buque de cardiomiocitos. Otras investigaciones histológicas e immunohistological, tales como la determinación de la proliferación, la examinación de apoptosis, medidas del tamaño del infarto, la determinación de la fibrosis y la expresión del marcador específico, también se pueden realizar en el mismo tipo de procesado del tejido, pero no son objeto del presente Protocolo. La combinación de en vivo la examinación ecocardiográfica con análisis histológicos ofrece ideas adicionales sobre alteraciones estructurales subyacentes. En un paso adicional, podemos completar estas medidas con investigaciones moleculares y ultraestructurales. Análisis histológicos no sólo completan la examinación ecocardiográfica pero también se convierten en indispensables cuando la resolución de la ecocardiografía no es suficiente. Esto es especialmente el caso en modelos de ratones modificados genéticamente que son letales embrionarios^23,24.

Protocolo

los experimentos descritos aquí se llevaron a cabo en cumplimiento de las leyes de bienestar animal francés e institucionales pertinentes, directrices y políticas. Que hayan sido aprobados por el Comité de ética francés (Comité Institutionnel d ' l Ethique Pour ' animales de laboratorio; número NCE/2012-106).

1. ecocardiografía

1. determinar el peso del cuerpo del ratón con una balanza de laboratorio estándar mientras sujeta suavemente por la cola para asegurar la colocación apropiada.
2. Anestesiar el animal por la inyección intraperitoneal (i.p.) de 50 mg/kg pentobarbital ^{25 , 26}.
   Nota: Puede utilizarse cualquier otro tipo de anestesia si se utiliza el mismo protocolo durante todo el estudio. Ventajas y desventajas serán discutidos abajo.
3. Poner el ratón de nuevo en su jaula y esperar hasta que sea insensible, muestra respiración constante y pie posterior reflejos están ausentes. Para probar esto, apriete ligeramente un pie y observe si la pierna todavía se retrae.
4. Afeitar el lado izquierdo del tórax y la axila izquierda con una afeitadora roedor comercial.
   Nota: El uso de una máquina de afeitar roedor dedicado permite la eliminación completa del pelo del ratón fino para evitar interferencias en la medición ecocardiográfica. Soluciones o cremas de eliminación de pelo comerciales deben evitarse, ya que son generalmente perfumadas, que perturbarán el animal después que despierta. Evite afeitar excesivo, ya que aumenta la pérdida de calor.
5. Poner el animal para dormir en una almohadilla caliente situada a 40-42 ° C en una posición superficial de lado izquierdo, con la cabeza a las 12 o ' reloj y la cola en 6 o ' reloj. Fijar el brazo izquierdo, pierna izquierda y la cola con cinta de.
6. Aplicar previamente calentado ecocardiografía gel en el pecho depilado y la cabeza del transductor de.
7. Coloque el transductor paraesternal izquierda, encaminándolo hacia el lado derecho del cuello para obtener una vista de dos dimensiones (2D) paraesternal eje largo a nivel del músculo papilar. Gire el transductor 90° para obtener una vista de eje corto a nivel de músculo papilar. Utilice un ajuste de la profundidad mínima y un zoom para maximizar la imagen calidad y velocidad de fotogramas. Ajustar la velocidad de barrido al máximo.
   1. Para obtener estos ajustes, diferentes zoom y configuración de opciones de profundidad puede usarse, dependiendo de la máquina y el software. Grabar imágenes de modo M guiado por 2D en eje corto ven el ²⁷. Consulte la figura 1A y B ²⁷.
      Nota: tenga cuidado de no aplicar demasiada presión en el pecho, ya que puede causar bradicardia.
8. Serie de registro por lo menos 3 de 3 corazón cine beat bucles para cada animal.
   Nota: Para el software de la ecocardiografía transesofágica utilizado en este estudio, presione el " adquirir/Save " el botón sólo una vez. Esta metodología es específica a la ecocardiografía transesofágica con este software en particular. Otros paquetes de software se pueden utilizar con máquinas diferentes.
9. Después de exitosas grabaciones, limpie la ecocardiografía del gel del tórax de ratón, cojín de calentamiento y transductor. Retire la cinta de las extremidades y la cola.
10. Deja el ratón bajo observación en la almohada, cubierta con papel para evitar la innecesaria exposición y calor pérdida de luz, hasta que despierta arriba
11. Puso el animal de nuevo en su caja.
12. Analizar registró imágenes modo M paraesternal eje corto para determinar dimensiones de (LV) ventriculares izquierdas y función. Medir el espesor de la pared anterior de la LV en sístole y diástole (LVAWs y LVAWd), el LV telesistólico y telediastólico diámetros internos (LVIDs y LVIDd) y el espesor de la pared posterior del LV (LVPW) en sístole y diástole (LVPWs y LVPWd) utilizando el identificación de la interfaz de tejido sanguíneo en las imágenes almacenadas.
13. Medir las dimensiones de la diastólicas en el momento de las aparente dimensiones diastólicas máximas LV y LV telesistólico dimensiones en el momento de la excursión sistólica más anterior de la pared posterior del LV. Toque la pantalla táctil en el " analizar " icono y luego en el " LVAWd " icono. Coloque la pinza electrónica en la interfaz entre la cavidad ventricular derecha y la pared anterior de la LV en diástole.
14. Coloque la pinza electrónica en la interfase entre la pared anterior del LV y la cavidad del LV para obtener el espesor de pared anterior diastólico LV; el software cambiará directamente a la medición diastólica final interna LV.
15. Coloque la pinza en la interfaz entre la cavidad del LV y la pared posterior del LV para obtener el diámetro telediastólico interno LV; cambiará el software a la medida de espesor de pared posterior de LV.
16. Coloque la pinza en la interfase entre la pared posterior de la LV y el pericardio para obtener el espesor de la pared posterior diastólica de LV. Dimensiones sistólica del LV, toque la pantalla táctil en el " LVAWs " icono y posición de la pinza electrónica en la interfaz entre la cavidad ventricular derecha y la pared anterior del LV en sístole.
17. Coloque la pinza electrónica en la interfase entre la pared anterior del LV y la cavidad del LV para obtener el espesor de pared anterior sistólica del LV. Repita el proceso como se describe anteriormente para el diámetro telesistólico interno de LV y el espesor de pared posterior sistólica del LV. Utilizar la Convención de punta aprobada por la sociedad americana de ecocardiografía para trazar los bordes endocárdico y epicárdico ^{13 , 27}.
    Nota: Los parámetros de la función contráctil del LV se calculan automáticamente usando las medidas anteriores. LV (FS) del acortamiento fraccional se define como FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. La fracción de eyección del LV (EF) se calcula con la fórmula de Teicholz modificada, donde EF (%) = [(LVIDd³-LVIDs³)/LVIDd ³] x 100 ¹². Consulte la figura 1A y B.
18. Almacenar los datos en discos compactos o sticks de memoria USB y hacer copias de seguridad.
19. Importación, analizar y exportar los datos utilizando el software correspondiente.
    Nota: Después de estas mediciones iniciales, el experimento puede hacer una pausa. Si se realiza una comparación directa entre animales knockout y hermanos de camada de tipo salvaje, proceder con el análisis histológico ⁶. Para Cre-ERT2; líneas de ratón de LOX/lox, continúe al día siguiente con la inducción de tamoxifeno por inyección i.p., como se describe ^{5 , 24}. Si la inducción experimental de infarto de miocardio por ligadura de la arteria coronaria izquierda ^{5 , 28}, podría realizar la cirugía inmediatamente después de las mediciones ecocardiográficas, cuando los ratones están bajo anestesia. De lo contrario, un retardo mínimo de una semana entre las dos rondas de la anestesia debe mantenerse para limitar la tasa de letalidad postoperatoria.

2. Preparación de muestras de corazón para la evaluación histológica

1. sacrificar a los animales por dislocación cervical. Medir su peso corporal. Desinfectar el pecho y el abdomen mediante una torunda de alcohol al 70%.
2. Hacer una incisión transversal en la piel 1 cm distal del esternón. Con unas pinzas embotadas, retirar la piel del tórax, en la dirección de la cabeza. Sostener el esternón ligeramente con unas pinzas finas y abra el diafragma insertando el extremo despuntado de tijeras finas.
3. Cortar las costillas en ambos lados paralelo al esternón. Mover el esternón en dirección a la cabeza. Coloque el corazón en el tórax. Mantenga el tronco vascular del corazón con las pinzas finas y cortar por debajo con unas tijeras finas.
4. Abre el cofre y suprimir el entero corazón fuera del tórax, medir el peso del corazón y establecer un corazón peso proporción ^{4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.}
5. Fijar el corazón en 2 mL de solución de formalina tamponada neutra 10% en tubos de 15 mL durante la noche a 4 ° C.
   PRECAUCIÓN: peligro! Trabajo con soluciones de formalina debe realizarse en una campana de vapores químicos; Use guantes y gafas de seguridad.
   Nota: Como la composición del tampón para soluciones de formalina varía con los diferentes proveedores, utilizar el mismo proveedor durante todo el estudio.
6. Al día siguiente, cortar los corazones en el plano transversal, en el centro y transferirlas en cassettes para inclusión en parafina, que se realiza en el laboratorio de patología, utilizando un aparato automatizado empotrar.
7. Realizar seccionamiento.
   1. Bloques de parafina de sección en un grosor de 3 μm utilizando un micrótomo y flotar en un agua de 40 ° C baño que contiene agua destilada.
   2. La transferencia de las secciones en diapositivas. Deje que los portaobjetos se seque durante la noche en una incubadora de 37 ° C y almacenarlos a 4 ° C hasta que esté listo para uso.
      Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí hasta que el usuario esté listo para la tinción (paso 3).
8. Deparaffinize y rehidratar el tejido correderas.
   1. Coloque los portaobjetos en tinción frascos con insertos de vidrio en un horno de 55 ° C durante 10 minutos derretir la parafina.
   2. Desparafinizar el portaobjetos en dos cambios de 200 mL de xileno o sustituto de xileno durante 5 minutos.
      PRECAUCIÓN: Altamente inflamable y tóxico. Trabajar en una campana de vapores químicos; Use guantes y gafas de seguridad.
   3. Transfiera los portaobjetos a 200 mL de alcohol al 100%. Hacer dos cambios de 3 minutos cada uno y una vez la transferencia a través de 200 mL de alcohol 95% por 3 minutos
      PRECAUCIÓN: Altamente inflamable! Mantener alejado de fuentes de ignición; no fumar.
   4. Enjuague dos veces en 200 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 minutos y continúe con el paso 3, 4 o 5.

3. Hematoxilina y eosina

1. enjuague los portaobjetos con las secciones en agua destilada.
2. Teñir los núcleos con solución de hematoxilina durante 8 min.
3. Enjuague en agua corriente durante 10 minutos
4. Tinción con solución de eosina durante 2 min.
5. Deshidratar tres veces por 2 min en 100% de etanol (EtOH). Claro tres veces por 2 minutos xileno o sustituto de xileno. Monte en un medio de montaje con xileno.
6. Fotografía las diapositivas y mida el diámetro del cardiomiocito a nivel del núcleo en secciones longitudinales del tabique interventricular. Medir por lo menos 100 células por tramo y tres por corazón.

4. Tinción de WGA

1. incubar los portaobjetos de paso 2.7 con tetramethylrhodamine (u otros tintes fluorescentes)-conjugado WGA (1: 100 en PBS) durante 60 min a temperatura ambiente en cámara húmeda.
2. Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos.
3. Monte con fluorescencia media con DAPI de montaje. Almacenar a 4 ° C en la oscuridad antes del análisis.
   PRECAUCIÓN: Use protección ocular y guantes resistentes a productos químicos compatibles.
4. Fotografiar las diapositivas.
   1. Uso un microscopio equipado con fluorescencia epi-iluminación y filtro establece para DAPI y tetramethylrhodamine (consulte la Tabla de materiales). Ajuste la abertura al máximo y el brillo a la exposición.
   2. Acquire separado imágenes con 400 aumentos para el azul y el rojo canales. Abra las imágenes en ImageJ. Ajustar el brillo y contraste si fuera necesario (imagen > ajuste > brillo/contraste).
   3. Set cada imagen a 8 bits (imagen de > tipo > 8 bits). Superposición de las imágenes de DAPI y WGA. Utilizar el canal azul para DAPI y el canal rojo para WGA; Establezca los canales verdes y gris en ninguno (imagen > Color > combinar canales) ³¹.
5. Determinar los diámetros de cardiomiocitos en el nivel del núcleo en secciones transversales del septo interventricular.
   1. Definir la escala de las imágenes en ImageJ. Para ello, fotografiar un objeto de tamaño conocido (por ejemplo, una cámara del hemocitómetro en el mismo aumento como las secciones de corazón; paso 4.4).
   2. Utilice la herramienta de línea recta a trazar una línea desde el principio hasta el final de la estructura conocida (analizar > ajustar escala).
      Nota: La distancia en píxeles se mostrará automáticamente; la unidad de longitud y distancia conocida debe introducirse. Proceder con las mediciones de cardiomiocitos en el nivel del núcleo.
   3. Trazar una línea recta de la membrana positivo WGA por el núcleo positivo DAPI para el sitio opuesto de la membrana celular de WGA-positivo (analizar > medida). En la ventana resultados, asegúrese de que los valores de longitud tienen un significativo número de lugares decimales (analizar > establecer medidas > lugares decimales).
   4. Medir por lo menos 100 células por tramo y tres por el corazón. Exportar los resultados a Excel (haga clic en resultados > archivo > guardar como > .csv) ^{6 , 31}.

5. Inmunotinción de PECAM-1

1. realizar antígeno desenmascaramiento. Buffer
   1. añadir 1.600 mL de citrato de sodio (citrato de sodio 10 mM, 0,05% Tween 20, pH 6.0) en una olla a presión. Coloque la olla a presión sobre la placa y convertirlo en potencia. No fije la tapa de la olla a presión en este punto; simplemente apoyarlo en la parte superior.
      PRECAUCIÓN: Caliente!
   2. Una vez que este hirviendo el buffer de citrato de sodio, transfiera los portaobjetos de paso 2.5 a la olla a presión. Asegure la tapa de la olla a presión. En cuanto la olla ha alcanzado la presión, espere 7 minutos. Cuando han transcurrido 7 minutos, apagar la placa y coloque la olla a presión en un tanque vacío. Activar la válvula de liberación de presión y deje correr agua fría sobre la olla. Una vez que se ha presurizado, abra la tapa y deje correr agua fría en la olla por 5 min lugar las diapositivas en 200 mL de PBS.
      Nota: Como alternativa, microondas desenmascaramiento del antígeno podría utilizarse, aunque aumenta el riesgo de sobrecalentamiento.
2. Uso 0.3% peróxido de hidrógeno en metanol a bloque actividad de peroxidasa endógena por 5 min enjuague los portaobjetos tres veces durante 2 minutos cada uno en 200 mL de PBS.
   PRECAUCIÓN: Inflamable y tóxico!
3. Incube los portaobjetos durante 15 min en suero bloqueo normal diluido (5% de suero normal de cabra en PBS) que también contiene un bloque de avidina (4 gotas en 1 mL).
4. Cuidadosamente el líquido de las secciones de toque e incubar con el anticuerpo de Pecam-1 de conejo, diluido 1:50 en PBS con suero normal de cabra de 2,5% y 4 gotas de bloque de biotina por mL. Incube los portaobjetos durante la noche en cámara húmeda a 4 ° C.
5. Lave los portaobjetos tres veces por 5 minutos cada uno en 200 mL de PBS. Incubar las secciones con biotinilado cabra anti-conejo IgG anticuerpo diluido 1: 200 en PBS con suero de cabra normal 2,5% durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar los portaobjetos tres veces por 5 minutos cada uno en 200 mL de PBS.
6. Incubar a tsecciones de con un sistema basado en avidina/biotina peroxidasa durante 20 min (reactivo A y reactivo B necesidad combinadas 30 minutos antes de usar). Lavar los portaobjetos tres veces por 5 minutos cada uno en 200 mL de PBS.
7. Disolver 1 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) y peróxido de hidrógeno de 1 urea tableta en 5 mL de agua destilada doble. Incubar las secciones con solución de DAB por aproximadamente 3 minutos, cuidadosamente monitoreo desarrollo de color. Detener la reacción de color lavando suavemente el portaobjetos en 200 mL de PBS.
   PRECAUCIÓN: Cancerígeno; guantes resistentes a químicos!
8. Contratinción los núcleos de 6 minutos con hematoxilina. Lavar en el chorro del grifo durante 2 min deshidratar tres veces de 2 minutos cada uno en 200 mL de alcohol al 100%. Claro tres veces durante 2 minutos cada uno en 200 mL de xileno o sustituto de xileno. Monte en un medio de montaje con xileno.
9. Fotografía las diapositivas (por lo menos diez campos con 40 aumentos del septo interventricular de cada corazón) y medir la densidad de área de Pecam-1 usando el libremente disponible de software ImageJ ³¹. Use el plugin de ³² color deconvolución para DAB y hematoxilina y ajustar el contraste de la imagen al mismo nivel.
   Nota: en caso de que el color marrón y púrpura/azul tienen una superposición espectral significativa, que puede causar dificultades con deconvolución de color, uno podría tratar de diferentes marcas de hematoxilina en solución para obtener coloración nuclear transparente, de color azul. Alternativamente, podría realizar inmunofluorescencia o conteo manual de los tubos capilares.

Resultados

En la figura 1, representante ecocardiográficas grabaciones demuestran la utilidad de la ecocardiografía para identificar fenotipos cardíacos en ratones modificados genéticamente. Puede identificar fácilmente la diferencia entre un ratón con función cardíaca normal (figura 1A) y un animal con un ventrículo izquierdo dilatado y función reducida de la LV (figura 1B). Figu...

Discusión

Se han desarrollado diferentes métodos para evaluar la estructura cardiaca y la función en los ratones, incluyendo ecocardiografía, poner en contraste-realzado MRI, micro CT y PET scan. Debido a su eficacia y simplicidad, la ecocardiografía es la técnica más ampliamente utilizada para el análisis funcional en ratones¹¹. En general, debido al pequeño tamaño del corazón y el de alta frecuencia del ritmo cardíaco en ratones, transductores con una frecuencia de > debe utilizarse 10 MHz,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine	Life Technologies, Molecular Probes	W849
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vectorlabs	BA-1000
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vectorlabs	SP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)	Vectorlabs	PK-6100
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4168
Hydrogen peroxide solution	Sigma	H1009
Anti-Pecam-1 (CD31) antibody	Abcam	ab28364
Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100	Parker
Linear ultrasound probe, L15-7io	Philips Healthcare
Echocardiograph, IE33 xMATRIX	Philips Healthcare
Microscope, Leica DMi8	Leica
Fluorescence Filterset DAPI	Leica	11525304
Filterset TxR	Leica	11525310
Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider	Spot Imaging
Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software	Spot Imaging
Imaging Computer	Dell
Fine Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Large Scissors	Fine Science Tools	14501-14
Scalpel blades	Fine Science Tools	10023-00
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11650-10
Rodent shaver	Harvard Apparatus	34-0243
cassettes for paraffin embedding	Sakura	4155F
neutral buffered Formalin	Sakura	8727
Xylene	Sakura	8733
Paraffine TEK III	Sakura	4511
automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP	Sakura	6032
paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5	Sakura	5229
microtome blades,Accu-Edge S35	Sakura	4685
microscopy slides, Tissue-Tek	Sakura	9533
cover slips, Tissue-Tek	Sakura	9582
Mounting medium Tissue-Tek	Sakura	1408
slide boxes	Sakura	3958
eosine solution	Sakura	8703
hematoxyline solution	Sakura	8711
microtome, RM2125RT	Leica	720-1880 (VWR)
water bath, Leica HI1210	Leica	720-0113(VWR)
Ethanol	VWR	ACRO444220050
15 ml tubes	VWR	734-0451
staining glass dish	VWR	MARI4220004
staining jars	VWR	MARI4200005
Incubator	Binder	9010-0012
DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4293
PBS (10X)	Thermo Fisher Scientific	70011044