マウスの心臓形態の心エコー検査・組織学的検討

要約

心エコー検査は、マウスで多用されます。高価な高分解能超音波デバイスは、この目的のために開発されています。このプロトコルでは、心臓形態を決定する組織学的形態計測学的解析と組み合わせて現実的な心エコー手順について説明します。

要約

遺伝子組み換えマウス モデル数の増加はここ数年で利用可能になりました。さらに、薬理学的研究マウスで実行される数が多いです。これらマウス モデルの表現型解析には、心臓の機能や形態の検討も必要です。心エコー検査や磁気共鳴画像 (MRI) は心機能とマウスの形態を特徴付けるため頻繁に使用されるアプローチが。心エコーと MRI の機器に特化した小さい齧歯動物での使用は高価な専用スペースが必要です。このプロトコルでは、15 MHz のひと血管プローブ臨床心エコー システムを用いたマウスの心臓の測定について説明します。測定は、成体マウスの麻酔で行われます。少なくとも 3 つの映像は記録および胸骨短軸ビューで M モードで各動物を分析します。その後、心臓の病理組織学的検査が行われ、心筋細胞の直径は、ヘマトキシリンで決定される-エオシンまたは小麦胚芽凝集素 (WGA)-パラフィン切片を染色します。血管密度は、決定 morphometrically を Pecam 1 染色後です。プロトコル モデルをされている薬理学的研究に正常に適用されるとは異なる遺伝的動物左前方降順冠状動脈 (永久的な結紮による実験的心筋梗塞後だけでなく、ベースラインの条件下で若者)。我々 の経験で心エコー法による調査は麻酔下の動物に限定され、少なくとも計量成体マウスで可能である 25 g。

概要

遺伝子組み換えマウス モデルの大きい変化があり、マウスの薬理学的研究の数は高^1,2です。心エコー検査や MRI は、心機能、これらマウス モデル³の形態の表現型特性の一般的に使用される方法です。提案するプロトコルの目的は、心機能と成体の形態を分析することです。それを組み合わせた心エコー、組織学的、免疫組織化学的測定。心エコー検査はマウス^{4,5,6,7,8,9,10、11で広く使用されて 12}。・ パション/ら¹¹識別 205 研究 2012 ~ 2015 の循環、循環研究、アメリカ生理学のジャーナル -学、心血管研究の公開動物の心エコー検査を使用します。

心エコー検査は遺伝子改変マウス^{5,6,13,14,15,16,}心臓表現型を識別するために使用します。^{17,18,19,20,21,22}、同様に慢性的な過負荷による肥大、心筋虚血、心筋症モデル (文献¹²) マウスの心機能の解析。向上心エコー検査機器では、左心室 (LV) シストリックおよび diastolic 寸法、組織ドップラー心エコー、心筋コントラスト エコー、LV 地域機能と冠予備能^{の評価の標準的な指標12}. 理想的には、収縮機能、自律神経の反射性制御の麻酔の負の影響を避けるために意識下マウスにおける心エコー検査を行うべきであり心拍数¹¹。それにもかかわらず、このアプローチは、動物を訓練するための要件によって制限されます。安定している; 体の温度を保つことの難しさ動きの人工物;ストレス;非常に高い心臓周波数;多数の動物調査中である場合は特に、実験を実行する少なくとも 2 つの調査官のための要件。興味深いことに、最近の研究には、訓練され、未熟な動物¹⁹における心エコー所見の違いは報告されません。麻酔下マウスにおける超音波測定を行います。異なる麻酔のプロトコルは後述します。

標準的な解像度のエコー (> 10 MHz) はメジャー左心室収縮期と拡張期の寸法と成体マウスの心機能に十分なメソッドは、基になる構造の現象の説明に限られました。したがって、我々 は組織学的生体内測定を組み合わせると、たとえば、心筋細胞径と血管の密度を測定する免疫組織学的解析。同じタイプに拡散の定量、アポトーシス、梗塞サイズの測定、線維化、および特異的マーカーの発現の定量の検討など、その他の組織学的および免疫組織学的調査を実行することも組織を処理されますが、この議定書の対象とされていません。体内の組織学的解析と心エコー検査の組み合わせは、基になる構造変化に追加の洞察力を提供します。追加の手順で分子・超構造の調査でこれらの測定を完了できます。組織学的分析は、心エコー検査を完了するだけでなく、心エコー図の解像度が十分でない場合も不可欠になります。これは、胚性致死^23,24遺伝子改変マウスのモデルでは特にそうです。

プロトコル

ここで説明実験が関連する機関とフランス動物福祉法、ガイドライン、およびポリシーに準拠して実施されました。彼らはフランスの倫理委員会によって承認されている (Comité Institutionnel d ' Ethique 注ぐ l ' 動物ドゥ ・ ラボラトワール; 番号 nce-コード/2012-106).

1 エコー

1. 尾でそれを軽く押しながら適切な位置を確保するため標準研究所バランスを使ってマウスの体重を決定します。
。
2. は、50 mg/kg のペントバルビ タール ^{25 , 26} の腹腔注入による動物を麻酔します
   。 注: 研究を通して同じプロトコルを使用する場合は、麻酔の他の種類を使用できます。長所と短所は以下で説明する
。
3. マウスはケージで待機戻る応答まで入れて、それは安定した呼吸を示し、後部足の反射が欠席しています。これをテストする足を少し絞るし、脚がまだ撤回するかどうかを確認します
。
4. 剃る胸部、左脇の下の商業齧歯動物のシェーバーを使用しての左側にある
   。 注: 専用の齧歯動物のシェーバーの使用マウスの細かい毛を完全に取り除く心エコー測定干渉を避けるためにできます。市販の脱毛クリームやソリューションは避けてください、彼らは通常香り、それを目覚めさせる後動物に迷惑をかけるよう。熱損失を増加すると、過剰なシェービングを避ける
。
5. は暖かいパッド、12 で、頭で左サイドの浅い位置に 40-42 ° C に設定に眠っている動物を置く o ' 時計と 6 尾 o ' 時計。左腕、左脚と尾を修正テープで
。
6. 適用は予め剃毛胸と探触子の頭に心エコー法ゲルを加温します
。
7. は胸骨左乳頭筋レベルでの二次元 (2 D) 傍胸骨長軸像を取得への首の右側にそれを指示、探触子を配置します。トランスデューサー 90 ° を回り papilary 筋肉レベルで短い軸のビューを取得します。画像品質とフレーム レートを最大化するために最小深さ設定とズームを使用します。掃引速度は最大に設定します。 マシンとソフトウェアに応じて、これら設定、異なるズーム オプションを設定の深さを取得する
   1. を使用可能性があります。短軸でレコード 2 D ガイド M モードの画像は、 ²⁷ を表示します。 図 1 a と B の ²⁷ を参照してください
      。 注: は、胸に過度の圧力を適用することを避けるためにこれは徐脈を引き起こす可能性があります世話します
   。
8. レコード 3、少なくとも一連の各動物のための 3 心ビート シネ ループします
   。 注: この研究で使用される心臓ソフトウェアを押して、" 取得/保存 " ボタンは一度だけ。この方法論は、この特定のソフトウェアで心臓に固有です。他のソフトウェア パッケージは別のマシンで使用できます
。
9. マウス胸郭や加熱パッド、探触子からゲルの巧妙な録音、エコー拭き取り後。手足やしっぽからテープを削除します
。
10. 不要な光露出と熱の損失を避ける、それは間違いなく目覚めるまでに組織で覆われて加熱パッドの観察の下にマウスを残す
11. 動物のケージに戻る入れて
。
12. 分析には、左心室 (LV) 寸法と関数を決定する胸骨短軸ビューから M モードの画像が記録されます。収縮期と拡張期 (LVPWs と LVPWd) を使用して LV 後壁厚 (LVPW)、左心室収縮末期、末期内径 (LVIDs と LVIDd) と (LVAWs と LVAWd) は拡張期収縮期左心室前壁の厚さを測定、格納されたイメージの組織血インターフェイスの識別
。
13. は、見かけの最大 LV 拡張寸法の時に拡張期の寸法を測定し、左心室後壁の最も前方シストリック遠足の時に左心室の収縮末期の寸法。タッチ スクリーンをタップ、" 分析 " アイコンとし、" LVAWd " アイコン。拡張期に左心室の前壁と心室キャビティ間のインタ フェースの電子キャリパーを配置します
。
14. 左室前壁と左心室拡張期前方壁の厚さを取得する LV キャビティ間のインタ フェースの電子キャリパーの位置; ソフトウェアは直接 LV 内部終期測定を切り替える
。
15. LV キャビティと LV の末期内径を取得する左心室後壁との間のインターフェイスで、キャリパーの位置; ソフトウェアは、左室後壁厚測定に切り替えられます
。
16. LV 期の後部壁厚を取得する左心室後壁および心膜の界面にキャリパーの位置。左心室収縮寸法のタッチ スクリーンをタップして、" LVAWs " アイコンと収縮期の右心室と左心室の前壁との間のインタ フェースの電子キャリパー位置
。
17. は、左心室の前壁と左心室収縮期前方壁の厚さを取得する LV キャビティ間のインタ フェースの電子キャリパーを配置します。左室の収縮末期内径と LV 収縮後肉厚のため上記のようにプロセスを繰り返します。心内膜と心外膜の境界線 ^{13 , 27} をトレースするアメリカのエコーを採用した最先端規則を使用します
    。 注: LV 収縮機能パラメーターを自動的に計算する前の測定値を用いたします。(FS) を短縮の LV は FS (%) として定義されている [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd =] x 100。左室駆出率 (EF) は、変更後の Teicholz 式で計算されます、EF (%) = [(LVIDd³-LVIDs³)/LVIDd ³] x 100 ¹²。 図 1 a および B を参照してください
。
18. コンパクト ディスクまたは USB メモリスティックにデータを格納し、バックアップ コピーを作成します
。
19. インポート、分析、および適切なソフトウェアを使用してデータをエクスポートします
    。 注: これらのベースライン測定後実験を一時停止することができます。ノックアウト動物と野生型同腹子の直接比較を実行すると、組織学的解析 ⁶ に進みます。Cre ERT2; の液体酸素/液体酸素マウス線説明 ^{5 , 24} としての i. p. 注入によるタモキシフェン誘導と次の日を続行します。心エコー測定後直接手術を実行だった場合は左冠動脈 ^{5 , 28} の結紮による実験的心筋梗塞を誘発するときに、マウス麻酔下にあります。それ以外の場合、麻酔の 2 つのラウンドの間の 1 週間の最小遅延を術後の致死率を制限する維持されるべき
。

2。組織学的評価のための心臓用試料の調製

1. 頚部転位によって動物を犠牲に。自分の体重を測定します。胸部と腹部の 70% アルコール綿棒を使用して駆除します
。
2. は、横切開皮膚 1 cm 遠位胸骨に。鈍い鉗子を使用すると、頭の方向に動いて、胸部から皮膚を削除します。微細鉗子で胸骨を軽く握るし、高級はさみの鈍い端を挿入することによって横隔膜を開きます
。
3. はカット両側の肋骨を胸骨に平行。胸骨を頭の方向に移動します。胸部の中心を探します。微細鉗子で心臓の血管のトランクを押しながら高級はさみを使ってカットします
。
4. 胸を開くと、胸部から心臓全体を切除、心重量を測定および心体重比 ^{4 , 5 , 6 ,} の確立 ^{23, 29, 30} .
5. 修正 15 mL チューブに 10% 中性緩衝ホルマリン溶液 2 mL で心一晩で 4 ° C
   注意: 危険!化学の発煙のフード; ホルマリン ソリューションの操作を行う必要があります。手袋と安全メガネを着用します
   。 注: ホルマリン ソリューションのバッファー組成は異なるサプライヤーによって異なります、研究を通して同じ業者を使用します
。
6. 次の日、心、真ん中に横の平面で切り取ってパラフィン包埋、ビデオカメラのテープに転送自動埋め込み装置を用いて病理学研究室で実行する
。
7. 断面を実行します。
   1. セクション パラフィン ブロック ミクロトームとそれらの 40 ° C の水は含んでいる蒸留水をお風呂のフロートを使用して 3 μ m の厚さで
   。
   2. は、スライド上にセクションを転送します。37 ° C のインキュベーターで一晩乾燥してスライドを許可して、使用する準備ができるまで 4 ° C で保存します
      。 注: プロトコルを一時停止できるここでユーザー (ステップ 3) を染色の準備が整うまで
   。
8. 組織スライドを Deparaffinize と rehydrate。
   1. パラフィンを溶かすに 10 分間、55 ° C のオーブンでガラスを挿入して瓶を染色にスライドを配置します
   。
   2. Deparaffinize キシレンまたはキシレン代替 5 分の 200 mL の 2 つの変更のスライドです
      。 注意: 非常に可燃性、有毒な!化学の発煙のフードの仕事します。手袋と安全メガネを着用します
   。
   3. は、スライドを 100% アルコールの 200 mL に転送します。3 分の 2 つの変更を加えるし、3 分 95% アルコールの 200 の mL を通じて一度転送
      注意: 非常に可燃性!着火源から離して保管します。禁煙します
   。
   4. リンス 200 mL、リン酸緩衝生理食塩水液 (PBS) 5 分で 2 回、手順 3、4、または 5 に進みます
   。

3。ヘマトキシリン ・ エオシン染色

1. 蒸留水中セクションにそれらのスライドをすすいでください
。
2. 8 分のヘマトキシリン液が核を染色
3. 10 分間流水ですすぎ
4. 2 分のエオシン浸と染色
5. Dehydrate 100% エタノール (エタノール) に 2 分間の 3 回。キシレンまたはキシレン代替で 2 分の 3 倍をオフにします。メディアをキシレン ベース マウントにマウント
。
6. 写真のスライドと心室中隔の縦断の核のレベルで心筋細胞の直径を測定します。セクションと 3 つのセクションごとに心ごとの少なくとも 100 セルを測定します
。

4。WGA 染色

1. tetramethylrhodamine (または他の蛍光染料) 2.7 ステップから取得されたスライドを孵化させなさい-WGA (PBS で 1: 100) を湿気の多い部屋に室温で 60 分間共役します
。
2. 5 分 PBS 洗浄 3 回
。
3. 蛍光 DAPI を含むメディアのマウントとマウントします。解析の前に暗闇の中で 4 ° c ストア
   。 注意: は、眼の保護と互換性のある耐薬品性手袋を着用します
。
4. スライド写真します。
   1. 使用落射蛍光とフィルターを搭載した顕微鏡を DAPI と tetramethylrhodamine (材料の表 を参照) を設定します。最大値と自動露出の明るさに絞り値を設定します
   。
   2. 取得は、青と赤のチャンネルの 400 倍の倍率で画像を分離します。ImageJ で画像を開きます。明るさを調整し、必要に応じて比較 (画像 > 調整 > 輝度/コントラスト).
   3. は、各イメージを 8 ビットに設定 (画像 > タイプ > 8 ビット)。DAPI と WGA の画像をオーバーレイします。WGA の DAPI や赤のチャンネルの青のチャネルを使用します。緑とグレーのチャンネルを none に設定 (画像 > 色 > チャンネルの統合) ³¹.
5. 横断心室中隔核のレベルで心筋細胞径を決定する。
   1. ImageJ でイメージのスケールを定義します。この目的のため (例えば、 心臓セクションと同じ倍率で商工会議所検定; ステップ 4.4) サイズがわかっているオブジェクトの写真します
   。
   2. では、直線ツールを使用して、最初から最後まで線を引く構造で知られる (分析 > スケールを設定) です
      。 注: ピクセル単位での距離が自動的に表示されます。既知の距離と長さの単位を入力する必要があります。心筋細胞核のレベル測定を続行します
   。
   3. DAPI 陽性核によって WGA 陽性膜から WGA 陽性細胞膜の反対側に直線を描画する (分析 > 測定)。[結果] ウィンドウで、長さの値が小数点以下の桁数の意味のある数であることを確認します (分析 > 測定を設定 > 小数点以下の桁数).
   4. は、セクションと 3 つのセクションごとに心ごとの少なくとも 100 セルを測定します。結果を Excel にエクスポート (結果をクリックして > ファイル > として保存 > .csv) ^{6 , 31}
   。

5。Pecam 1 染色

1. 抗原のアンマス キングを実行します。 圧力鍋に
   1. 追加 1,600 mL クエン酸ナトリウムのバッファー (クエン酸ナトリウム 10 mM、0.05 のトゥイーン 20%、pH 6.0)。ホット プレートに圧力鍋を置き、フルパワーでそれをオンにします。圧力鍋の蓋はこの時点で確保されていません単に上に置きます
      。 注意: ホット!
   2. ナトリウム クエン酸バッファーが沸騰され、一度は、圧力鍋に 2.5 のステップからスライドを転送します。圧力鍋の蓋を固定します。炊飯器は、完全な圧力に達しているとすぐに 7 分を待ちます。7 分が経過した場合、ホット プレートを切りながら空流しに圧力鍋を配置します。圧力解放弁をアクティブにし、炊飯器に冷たい水を実行します。それは加圧解除は、一度ふたを開けるし、200 mL の PBS でスライドを 5 分位の炊飯器に冷たい水を実行します
      。 注: また、マイクロ波抗原のアンマス キングされる可能性があります、過熱のリスクを増加します
   。
2. 三回 2 分間各で 200 mL の PBS の 5 分間ブロック内因性ペルオキシダーゼ活性メタノール使用 0.3% 過酸化水素リンス スライドです
   。 注意: 可燃性、有毒!
3. 希薄化後普通ブロック血清 (PBS で 5% ヤギ血清) アビジン ブロック (1 mL に 4 滴) を含むで 15 分間スライドをインキュベートします
。
4. は慎重にセクションから液体をタップし、ウサギから Pecam 1 抗体、希釈 1:50 2.5% ヤギ血清 1 mL あたりビオチン ブロックの 4 が値下がりしましたを含む PBS にそれらをインキュベートします。湿気の多い部屋で一晩スライドをインキュベート 4 ° C
5. は、200 mL の PBS で 3 回各 5 分用のスライドを洗います。ビオチン標識ヤギ抗家兎 IgG 抗体希釈 1: 200 1 時間室温で 2.5% ヤギ血清を含む PBS でセクションを孵化させなさい。200 mL の PBS で 3 回各 5 分用のスライドを洗うです
。
6. インキュベート t20 分 (試薬 A と試薬 B 必要合計 30 分前を使用する) にペルオキシダーゼのアビジン ・ ビオチン ・ ベース システムと彼のセクション。200 mL の PBS で 3 回各 5 分用のスライドを洗うです
。
7. 溶解 1 3, 3 '-ジアミノベンジジン (軽打) と 1 尿素過酸化水素二重蒸留水 5 mL のタブレットします。カラー開発を注意深く監視、約 3 分間軽打の解決セクションを孵化させなさい。200 mL の PBS でスライドを優しく洗浄することにより発色反応を停止します
   。 注意: 発がん性;化学薬品耐性の手袋を着用!
8. Counterstain ヘマトキシリンと 6 分のため核です。100% アルコールの 200 mL の 2 分 Dehydrate 2 分の 3 倍の水道の流水ですすいでください。キシレンまたはキシレン代替ごとに 200 mL 3 回 2 分間オフにします。メディアをキシレン ベース マウントにマウント
。
9. は、スライド (それぞれの心の心室中隔から 40 倍の倍率で少なくとも 10 フィールド) を写真し、Pecam 1 の面積密度を自由に利用できる ImageJ ソフトウェア ³¹ を使用しての測定します。軽打のヘマトキシリン色デコンボリューション ³² プラグインを使用して同じレベルに画像のコントラストを調整します
   。 注: 茶色と紫/青のカラー色デコンボリューションの困難を引き起こす可能性があります、重要なスペクトル オーバー ラップを持っている場合に、明確な明るい青色染色性が核を取得するヘマトキシリン液のさまざまなブランドを試みることができる 1 つ。また、蛍光抗体法や毛細血管の手動カウントを実行でした
。

結果

図 1、代表的な心エコー録音における遺伝子改変マウス心臓表現型を識別するために心エコー法の有用性を示す.正常な心臓機能 (図 1 a) をマウスと拡張した左心室と減らされた LV 機能 (図 1 b) を持つ動物の違いは、簡単に識別できます。図 2に示します心筋細胞の比較直径測定せ...

ディスカッション

別の方法は、心エコー検査、造影 MRI、マイクロ CT、PET 検査を含むマウスの心臓の構造と機能を評価するため開発されています。その費用対効果とシンプルさのため心エコー検査、マウス¹¹の機能分析のため最も広く使用されている手法です。心とマウスの心拍数、探触子の周波数の高周波数のサイズが小さいため一般に、> 10 MHz は使用する必要がありますが、成功の測?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine	Life Technologies, Molecular Probes	W849
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vectorlabs	BA-1000
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vectorlabs	SP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)	Vectorlabs	PK-6100
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4168
Hydrogen peroxide solution	Sigma	H1009
Anti-Pecam-1 (CD31) antibody	Abcam	ab28364
Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100	Parker
Linear ultrasound probe, L15-7io	Philips Healthcare
Echocardiograph, IE33 xMATRIX	Philips Healthcare
Microscope, Leica DMi8	Leica
Fluorescence Filterset DAPI	Leica	11525304
Filterset TxR	Leica	11525310
Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider	Spot Imaging
Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software	Spot Imaging
Imaging Computer	Dell
Fine Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Large Scissors	Fine Science Tools	14501-14
Scalpel blades	Fine Science Tools	10023-00
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11650-10
Rodent shaver	Harvard Apparatus	34-0243
cassettes for paraffin embedding	Sakura	4155F
neutral buffered Formalin	Sakura	8727
Xylene	Sakura	8733
Paraffine TEK III	Sakura	4511
automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP	Sakura	6032
paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5	Sakura	5229
microtome blades,Accu-Edge S35	Sakura	4685
microscopy slides, Tissue-Tek	Sakura	9533
cover slips, Tissue-Tek	Sakura	9582
Mounting medium Tissue-Tek	Sakura	1408
slide boxes	Sakura	3958
eosine solution	Sakura	8703
hematoxyline solution	Sakura	8711
microtome, RM2125RT	Leica	720-1880 (VWR)
water bath, Leica HI1210	Leica	720-0113(VWR)
Ethanol	VWR	ACRO444220050
15 ml tubes	VWR	734-0451
staining glass dish	VWR	MARI4220004
staining jars	VWR	MARI4200005
Incubator	Binder	9010-0012
DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4293
PBS (10X)	Thermo Fisher Scientific	70011044