Exame ecocardiográfico e histológico da morfologia cardíaca no Mouse

Resumo

Exame ecocardiográfico é frequentemente usada em ratos. Aparelhos de ultra-som de alta resolução caro foram desenvolvidos para esta finalidade. Este protocolo descreve um procedimento ecocardiográfico acessível, combinado com análises morfométricas histológica para determinar a morfologia cardíaca.

Resumo

Um número crescente de modelos do rato geneticamente modificados tornou-se disponível nos últimos anos. Além disso, o número de estudos farmacológicos realizados em ratos é alto. Caracterização fenotípica destes modelos do rato também requer o exame da função cardíaca e morfologia. Ecocardiograma e ressonância magnética (MRI) são abordagens comumente usadas para caracterizar a função cardíaca e morfologia em camundongos. Ecocardiográfica e ressonância magnética equipamentos especializados para uso em pequenos roedores é caro e exige um espaço dedicado. Este protocolo descreve medidas cardíacas em ratos usando um sistema clínico ecocardiográfico com uma sonda vascular humano de 15 MHz. As medições são realizadas em ratos adultos anestesiados. Pelo menos três sequências de imagem são registradas e analisadas para cada animal no modo-M na exibição de eixo curto paraesternal. Depois, exame histológico cardíaco é executado, e diâmetros de casos são determinados em hematoxilina-eosina - ou germe de trigo aglutininas (WGA)-manchado de parafina. Densidade do navio é determinado morfometricamente depois immunostaining Pecam-1. O protocolo tem sido aplicados com sucesso para estudos farmacológicos e diferentes modelos de animais geneticamente sob condições de linha de base, bem como após o infarto do miocárdio experimental pela ligadura permanente do (de artéria coronária descendente anterior esquerda RAPAZ). Em nossa experiência, a investigação ecocardiográfica é limitada a animais anestesiados e é viável em ratos adultos, pesando pelo menos 25 g.

Introdução

Uma grande variedade de modelos de rato geneticamente modificados estão disponíveis, e o número de estudos farmacológicos em camundongos é alta^1,2. Ecocardiograma e ressonância magnética são abordagens comumente usadas para a caracterização fenotípica da função cardíaca e morfologia nestes modelos de rato³. O objectivo do protocolo apresentado é analisar a função cardíaca e morfologia em ratos adultos. Ele combina ecocardiográfica, histológicos e medições de imuno-histoquímica. Exame ecocardiográfico é amplamente utilizado em ratos^{4,5,6,7,8,9,10,11, 12}. Pachon et al ¹¹ identificado 205 estudos publicados em circulação, Circulação pesquisa, American Journal of Physiology - coração e fisiologia do sistema circulatórioe Cardiovascular Research entre 2012 e 2015 que usado o exame ecocardiográfico em animais.

Ecocardiografia é usada para identificar fenótipos cardíacos em ratos geneticamente modificados^{5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22}, bem como para analisar a função cardíaca em hipertrofia induzida por sobrecarga crônica, isquemia miocárdica e modelos de cardiomiopatia em camundongos (revistos em¹²). Equipamento de ecocardiografia melhorado permite a medida padrão de imagem Doppler tecido ventricular esquerda dimensões de pressão sistólica e diastólica (LV), ecografia de contraste miocárdico e a avaliação da função regional de LV e reserva coronariana ¹². idealmente, exame ecocardiográfico deve ser executada em ratos conscientes para evitar os efeitos negativos da anestesia na função contrátil, controle reflexo autonômico, e¹¹a taxa de coração. No entanto, essa abordagem é limitada pela exigência de treinar os animais; dificuldades em manter a temperatura do corpo estável; artefatos de movimento; estresse; frequências cardíacas muito altas; e a exigência de pelo menos dois investigadores realizar o experimento, especialmente se um grande número de animais que estão sob investigação. Curiosamente, um estudo recente relatou não há diferenças em parâmetros ecocardiográficos em animais treinados e destreinados¹⁹. Realizamos medições ecocardiográficas em ratos anestesiados. Protocolos de anestesia diferente serão discutidos abaixo.

Apesar de ecocardiografia de resolução padrão (> 10 MHz) é suficiente para medir LV sistólica e diastólica dimensões e função cardíaca em ratos adultos, o método é limitado em sua descrição de fenômenos estruturais subjacentes. Assim, aliamos as medições na vivo com histológicos e reagidos análises para medir, por exemplo, casos de diâmetro e embarcação de densidade. Outras investigações histológicas e reagidos, tais como a determinação de proliferação, exame de apoptose, medições de tamanho do infarto, determinação de fibrose e a expressão do marcador específico, também podem ser executadas no mesmo tipo de tratados de tecido, mas não são objecto do presente protocolo. A combinação de na vivo exame ecocardiográfico com análise histológica fornece insights adicionais sobre alterações estruturais subjacentes. Em uma etapa adicional, podemos completar estas medições com investigações ultra estruturais e moleculares. Análise histológica não só completa o exame ecocardiográfico, mas também tornar-se indispensável quando a resolução da Ecocardiografia não é suficiente. Este é especialmente o caso em modelos de camundongos geneticamente modificados que são letal embrionário^23,24.

Protocolo

os experimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as leis de bem-estar animal francês e institucionais relevantes, diretrizes e políticas. Foram aprovados pelo Comitê de ética francês (Comité Institutionnel d ' Ethique Pour L' ' Animal de Laboratoire; número NCE/2012-106).

1. ecocardiografia

1. determinar o peso do corpo do mouse utilizando uma balança de laboratório padrão, mantendo-a levemente pela cauda para garantir o posicionamento adequado.
2. Anestesiar o animal pela injeção intraperitoneal (i.p.) de 50 mg/kg pentobarbital ^{25 , 26}.
   Nota: Qualquer outro tipo de anestesia pode ser usado se o mesmo protocolo que é usado ao longo do estudo. Vantagens e desvantagens serão discutidas abaixo.
3. o mouse de volta em sua própria gaiola e espere até que ele não está respondendo, ele mostra a respiração firme, e pé traseiro reflexos estão ausentes. Para testar isso, esprema um pé ligeiramente e observar se a perna ainda retrai.
4. Raspar o lado esquerdo do tórax e a axila esquerda, usando uma máquina de barbear roedor comercial.
   Nota: O uso de uma máquina de barbear roedor dedicado permite a remoção completa dos pelos de rato bem para evitar a interferência na medição ecocardiográfica. Comercial de cabelo remoção cremes ou soluções devem ser evitadas, como eles geralmente são perfumados, que irá perturbar o animal depois que ela desperta. Evite barbear excessiva, pois aumenta a perda de calor.
5. Colocar o animal dormindo sobre uma almofada quente consta para 40-42 ° C em uma posição superficial lado esquerdo, com a cabeça em 12 o ' relógio e a cauda em 6 o ' relógio. Fixar o braço esquerdo, perna esquerda e cauda com fita.
6. Aplicar pré aquecido ecocardiografia gel para o peito depilado e a cabeça do transdutor.
7. Coloca o transdutor paraesternal esquerdo, dirigindo-a para o lado direito do pescoço para obter um bidimensional (2D) longo-eixo esternal no nível do músculo papilar. O transdutor 90° gire no sentido horário para obter uma visão do eixo curto a nível do músculo papilary. Use uma configuração de profundidade mínima e um zoom para maximizar a imagem qualidade e taxa de quadros. Definir a velocidade de varredura para o máximo.
   1. Para obter essas configurações, definindo opções de profundidade e zoom diferente pode ser usado, dependendo da máquina e software. Gravar imagens de M-modo 2D-interativa no eixo curto ver ²⁷. Consulte a figura 1A e B ²⁷.
      Nota: tenha cuidado para evitar aplicar pressão excessiva no peito, pois isso pode causar bradicardia.
8. Série de registro pelo menos 3 de 3 loops de cine batida de coração por cada animal.
   Nota: Para o software ecocardiográficos utilizado neste estudo, pressione o " adquirir/Save " o botão apenas uma vez. Esta metodologia é específica para o ecocardiográficos com este software específico. Outros pacotes de software podem ser usados com diferentes máquinas.
9. Depois de gravações bem sucedidas, limpe a Ecocardiografia do gel do tórax de rato, almofada de aquecimento e transdutor. Remova a fita de membros e cauda.
10. Deixar o mouse sob observação na rampa de aquecimento, coberta com tecido para evitar desnecessária exposição e calor perda de luz, até que ele acorda de cima
11. Coloque o animal de volta em sua jaula.
12. Analyze gravou imagens da M-modalidade de esternal eixo curto para determinar a função e ventricular esquerdo (LV) dimensões. Medir a espessura de parede anterior LV na sístole e diástole (LVAWs e LVAWd), os LV final-sistólica e diastólica final diâmetros internos (LVIDs e LVIDd) e a espessura de parede posterior de LV (LVPW) em sístole e a diástole (LVPWs e LVPWd) usando o identificação da interface tecido-sangue sobre as imagens armazenadas.
13. Medir as dimensões diastólica aquando da aparente máxima LV diastólica dimensões e LV dimensões sistólica-final no momento da excursão sistólica mais anterior da parede posterior da LV. Toque de tela sensível ao toque no " Analyze " ícone e, em seguida, sobre o " LVAWd " ícone. Posicionar o paquímetro eletrônico na interface entre a cavidade ventricular direita e a parede anterior LV em diástole.
14. Posicionar o paquímetro eletrônico na interface entre a parede anterior do LV e cavidade para obter a espessura de parede anterior diastólica LV LV; o software vai mudar diretamente para a medição final-diastólica interna de LV.
15. Posicionar o paquímetro na interface entre a cavidade de LV e a parede posterior de LV para obter o diâmetro diastólico final interno LV; o software vai mudar para a medição de espessura de parede posterior de LV.
16. Posicionar o paquímetro na interface entre a parede posterior do LV e o pericárdio para obter a espessura de parede posterior diastólica LV. Para dimensões sistólica LV, toque a tela de toque sobre o " LVAWs " ícone e posição o compasso de calibre eletrônico na interface entre a cavidade ventricular direita e a parede anterior do LV no systole.
17. Posicionar o paquímetro eletrônico na interface entre a parede anterior do LV e cavidade para obter a espessura de parede anterior sistólica LV LV. Repita o processo conforme descrito acima para o diâmetro final-sistólica interno de LV e a espessura da parede posterior sistólica LV. Use a Convenção de ponta adotada pela sociedade americana de ecocardiografia para rastrear as fronteiras endocárdico e epicárdico ^{13 , 27}.
    Nota: Parâmetros da função contrátil LV serão automaticamente calculados usando as medidas anteriores. O LV fracionária de encurtamento (FS) é definido como FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. A fração de ejeção de LV (EF) é calculada com a fórmula modificada de Teicholz, onde EF (%) = [(LVIDd³-LVIDs³)/LVIDd ³] x 100 ¹². Consulte a figura 1A e B.
18. Armazenar os dados em CDs ou cartões de memória USB e faça cópias de backup.
19. Importação, analisar e exportar os dados usando o software apropriado.
    Nota: Após as medições de linha de base, o experimento pode ser pausado. Se realizar uma comparação direta entre animais nocaute e selvagem-tipo littermates, prosseguir com a análise histológica ⁶. Para Cre-ERT2; linhas de rato de salmão/salmão fumado, continuar no dia seguinte com tamoxifeno indução por injeção i.p., como descrito na ^{5 , 24}. Se induzir miocárdio experimental pela ligadura da artéria coronária esquerda ^{5 , 28}, a cirurgia poderia ser realizada diretamente após as medidas ecocardiográficas, quando os ratos estão sob anestesia. Caso contrário, um prazo mínimo de uma semana entre as duas rodadas da anestesia deve ser mantido para limitar a taxa de letalidade pós-operatória.

2. Preparação de amostras de coração para avaliação histológica

1. sacrificar os animais por deslocamento cervical. Meça seu peso corporal. Desinfectar o peito e abdômen, usando um algodão embebido em álcool 70%.
2. Fazer uma incisão transversa na pele 1cm distal ao esterno. Usando pinças sem corte, retire a pele do tórax, indo na direção da cabeça. Segure o esterno levemente com a pinça fina e abrir o diafragma, inserindo o fim brusco da tesoura bem.
3. Cortar a caixa torácica em ambos os lados paralelos ao esterno. Mova o esterno na direção da cabeça. Localize o coração no tórax. Mantenha o tronco vascular do coração com a pinça fina e corte abaixo usando a tesoura bem.
4. Abra o baú e retirar todo o coração fora do tórax, medir o peso de coração e estabelecer um peso do coração-a-corpo relação ^{4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.}
5. Fix o coração em 2 mL de solução de formol tamponado a 10% neutro em tubos de 15 mL a noite no 4 ° C.
   Cuidado: perigo! Trabalho com soluções de formalina deve ser feito em uma coifa de química; usar luvas e óculos de segurança.
   Nota: Como a composição do tampão de soluções de formol varia com diferentes fornecedores, utilize o mesmo fornecedor ao longo do estudo.
6. No dia seguinte, cortar os corações no plano transversal, no meio e transferi-los para fitas para a incorporação de parafina, que é realizada no laboratório de patologia, usando um aparelho automatizado de encastre.
7. Executar seccionamento.
   1. Blocos de parafina de seção em uma espessura de 3 µm usando um micrótomo e boia-los em uma água de 40 ° C do banho com água destilada.
   As seções sobre guias de transferência de
   2. . Permitir que os slides para secar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C e armazená-los em 4 ° C até que esteja pronto para uso.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui até que o usuário está pronto para a coloração (etapa 3).
8. Deparaffinize e hidratar o tecido desliza.
   1. Coloque os slides na coloração de frascos com pastilhas de vidro em um forno de 55 ° C por 10 min derreter a parafina.
   2. Deparaffinize os slides em duas mudanças de 200ml de xilol ou xileno substituto por 5 min cada.
      Atenção: Altamente inflamável e tóxico! Trabalho em uma coifa de química; usar luvas e óculos de segurança.
   3. Transferir os slides para 200 mL de álcool a 100%. Fazer duas alterações por 3 min cada e transferir uma vez através de 200 mL de álcool 95% por 3 min.
      Cuidado: Inflamável! Mantenha longe de fontes de ignição; Não se pode fumar.
   4. Lavar duas vezes em 200 mL de tampão fosfato solução salina (PBS) por 5 min cada e continue com o passo 3, 4 ou 5.

3. Hematoxilina e eosina coloração

1. enxaguar os slides com suas seções em água destilada.
2. Mancha os núcleos com solução de hematoxilina de 8 min.
3. Enxaguar em água corrente durante 10 min.
4. Mancha com solução de eosina por 2 min.
5. Desidratando três vezes por 2 min em 100% de etanol (EtOH). Limpe 3 vezes por 2 min em xilol ou xileno substituto. Monte em um meio de montagem baseada em xileno.
6. Fotografar os slides e medir o diâmetro de casos a nível do núcleo em secções longitudinais do septo interventricular. Medir a pelo menos 100 células por seção e três seções por coração.

4. Coloração de WGA

1. a incubar obtidos de passo 2.7 com diversos (ou outros corantes fluorescentes)-conjugados WGA (1: 100 em PBS) para 60 min à temperatura ambiente em uma câmara húmida.
2. Lave tres vezes com PBS por 5 min cada.
3. Montagem com fluorescência montagem mídia contendo DAPI. Loja a 4 ° C, no escuro antes da análise.
   Cuidado: Use proteção para os olhos e luvas resistentes a produtos químicos compatíveis.
4. Fotografar os slides.
   1. Uso um microscópio equipado com epi-iluminação de fluorescência e filtro define para DAPI e diversos (consulte a Tabela de materiais). Definir a abertura para o máximo e o brilho para auto-exposição.
   2. Adquirir separa imagens na ampliação de x 400 para o azul e os vermelhos canais. Abra as imagens no ImageJ. Ajustar o brilho e o contraste se necessário (imagem > ajuste > brilho/contraste).
   3. Definir cada imagem de 8 bits (imagem > tipo > 8-bit). Sobrepor as imagens DAPI e WGA. Use o canal azul para DAPI e o canal vermelho para WGA; definir os canais verdes e cinzento para none (imagem > cor > mesclar canais) ³¹.
5. Determinar os diâmetros de casos a nível do núcleo em secções transversais do septo interventricular.
   1. Define a escala das imagens no ImageJ. Para este efeito, fotografar um objeto de tamanho conhecido (por exemplo, uma câmara de hemocytometer a mesma ampliação como as seções de coração; passo 4.4).
   2. Usar a ferramenta em linha reta para desenhar uma linha do começo ao fim da estrutura conhecida (Analyze > definir escala).
      Nota: A distância em pixels será exibida automaticamente; a unidade de comprimento e distância conhecida terá que ser inserido. Prosseguir com as medições de casos a nível do núcleo.
   3. Desenhar uma linha reta da membrana WGA-positivo através do núcleo de DAPI-positivo para o site oposto da membrana celular WGA-positivo (Analyze > medida). Na janela de resultados, verifique se os valores de comprimento tem um significativo número de casas decimais (Analyze > definir medidas > casas decimais).
   4. Medida pelo menos 100 células por seção e três seções pelo coração. Exportar os resultados para Excel (clique em resultados > arquivo > salve como >. csv) ^{6 , 31}.

5. Immunostaining pecam-1

1. executar o antígeno desmascaramento. Buffer
   1. Adicionar 1.600 mL de citrato de sódio (citrato de sódio de 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6.0) para uma panela de pressão. Coloque a panela sobre a chapa e transformá-lo em força total. Não prenda a tampa da panela de pressão neste ponto; simplesmente coloque-o no topo.
      Cuidado: Quente!
   2. , Uma vez que o tampão de citrato de sódio está fervendo, transferir os slides da etapa 2.5 para a panela de pressão. Fixe a tampa da panela de pressão. Assim que a panela atingir pressão completa, espere por 7 min. Quando transcorridos 7 min, desligue a chapa e coloque a panela de pressão em um coletor de vazio. Ativar a válvula de alívio de pressão e correr água fria sobre o fogão. Uma vez que ele tem de pressurizado, abra a tampa e correr água fria na panela de 5 min. do lugar os slides em 200 mL de PBS.
      Nota: Como alternativa, desmascaramento de antígeno de microondas poderia ser utilizado, embora o risco de superaquecimento é aumentado.
2. Uso 0,3% de peróxido de hidrogênio em metanol para atividade de peroxidase endógena bloco 5 min. enxágue os slides para três vezes por 2 min cada em 200 mL de PBS.
   Cuidado: Inflamável e tóxico!
3. a incubar por 15 min em diluídos bloqueio soro normal (5% de soro de cabra normal em PBS) que também contém um bloco de avidina (4 gotas em 1 mL).
4. Com cuidado toque o líquido das seções e incube-os com Pecam-1 anticorpos de coelho, diluída 01:50 em PBS contendo 2,5% de soro de cabra normal e 4 gotas de bloco de biotina por mL. Incubar os slides durante a noite em uma câmara húmida a 4 ° C.
5. Lavar as lâminas 3 vezes durante 5 min cada em 200 mL de PBS. Incube as secções com biotinilado cabra anti-coelho IgG anticorpo diluído 1: 200 em PBS contendo 2,5% de soro de cabra normal por 1h à temperatura ambiente. Lavar as lâminas 3 vezes durante 5 min cada em 200 mL de PBS.
6. Incubar tseções do com um sistema baseado em avidina/biotina peroxidase por 20 min (Reagente A e Reagente B precisa ser combinados 30 minutos antes de usar). Lavar as lâminas 3 vezes durante 5 min cada em 200 mL de PBS.
7. Dissolver 1 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio 1 ureia comprimido em 5 mL de água bidestilada. Incube as secções com DAB solução por aproximadamente 3 min, monitorando cuidadosamente desenvolvimento de cor. Parar a reação de cor lavando suavemente os slides em 200 mL de PBS.
   Cuidado: Cancerígenos; usar luvas resistentes a produtos químicos!
8. Counterstain os núcleos para 6 min com hematoxilina. Enxaguar em água corrente por 2 min. desidratando por 2 min cada por três vezes em 200 mL de álcool a 100%. Limpe 3 vezes por 2 min cada em 200 mL de xileno ou um substituto do xileno. Monte em um meio de montagem baseada em xileno.
9. Fotografar os slides (pelo menos dez campos na ampliação de 40x do septo interventricular de cada coração) e medir a densidade de área Pecam-1 usando o livremente disponível de software ImageJ ³¹. Usar o plugin de ³² de deconvolução de cor para DAB e hematoxilina e ajustar o contraste da imagem ao mesmo nível.
   Nota: caso a cor marrom e roxo/azul tem sobreposição espectral significativa, o que pode causar dificuldades com deconvolução de cor, um poderia tentar diferentes marcas de solução de hematoxilina, para obter a coloração nuclear clara, luz-azul. Alternativamente, pode ser executada de imunofluorescência ou contagem manual dos capilares.

Resultados

Na Figura 1, representante gravações ecocardiográficas demonstram a utilidade da ecocardiografia para identificar fenótipos cardíacos em camundongos geneticamente modificados. A diferença entre um mouse com função cardíaca normal (figura 1A) e um animal com uma dilatação do ventrículo esquerdo e função LV reduzida (figura 1B) pode ser facilmente identificada. A Figu...

Discussão

Diferentes métodos têm sido desenvolvidos para avaliar a estrutura cardíaca e função em ratos, incluindo ecocardiografia avançada contraste MRI, micro CT e PET-scan. Devido à sua relação custo-eficácia e simplicidade, a Ecocardiografia é a técnica mais amplamente utilizada para a análise funcional em ratos¹¹. Em geral, por causa do pequeno tamanho do coração e a alta frequência da frequência cardíaca em ratos, Transdutores com frequência > MHz 10 deve ser usado, embora medi?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine	Life Technologies, Molecular Probes	W849
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vectorlabs	BA-1000
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vectorlabs	SP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)	Vectorlabs	PK-6100
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4168
Hydrogen peroxide solution	Sigma	H1009
Anti-Pecam-1 (CD31) antibody	Abcam	ab28364
Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100	Parker
Linear ultrasound probe, L15-7io	Philips Healthcare
Echocardiograph, IE33 xMATRIX	Philips Healthcare
Microscope, Leica DMi8	Leica
Fluorescence Filterset DAPI	Leica	11525304
Filterset TxR	Leica	11525310
Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider	Spot Imaging
Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software	Spot Imaging
Imaging Computer	Dell
Fine Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Large Scissors	Fine Science Tools	14501-14
Scalpel blades	Fine Science Tools	10023-00
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11650-10
Rodent shaver	Harvard Apparatus	34-0243
cassettes for paraffin embedding	Sakura	4155F
neutral buffered Formalin	Sakura	8727
Xylene	Sakura	8733
Paraffine TEK III	Sakura	4511
automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP	Sakura	6032
paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5	Sakura	5229
microtome blades,Accu-Edge S35	Sakura	4685
microscopy slides, Tissue-Tek	Sakura	9533
cover slips, Tissue-Tek	Sakura	9582
Mounting medium Tissue-Tek	Sakura	1408
slide boxes	Sakura	3958
eosine solution	Sakura	8703
hematoxyline solution	Sakura	8711
microtome, RM2125RT	Leica	720-1880 (VWR)
water bath, Leica HI1210	Leica	720-0113(VWR)
Ethanol	VWR	ACRO444220050
15 ml tubes	VWR	734-0451
staining glass dish	VWR	MARI4220004
staining jars	VWR	MARI4200005
Incubator	Binder	9010-0012
DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4293
PBS (10X)	Thermo Fisher Scientific	70011044