JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Ekokardiyografik inceleme farelerde sık sık kullanılır. Bu amaç için pahalı yüksek çözünürlüklü ultrason cihazları geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı histolojik xarakteristikaları analizler ile kardiyak Morfoloji belirlemek için birlikte uygun fiyatlı bir Ekokardiyografik yordamı açıklar.

Özet

Genetiği değiştirilmiş fare modelleri artan sayıda son yıllarda kullanılabilir hale gelmiştir. Ayrıca, farmakolojik çalışmalar farelerde gerçekleştirilen sayısı yüksektir. Bu fare modelleri fenotipik karakterizasyonu de kardiyak fonksiyon ve Morfoloji incelenmesi gerekir. Ekokardiyografi ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kardiyak fonksiyon ve Morfoloji farelerde karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar vardır. Küçük kemirgen kullanımda ve pahalı bir özel alanı gerektirir için Ekokardiyografik ve MRI donanımları uzman. Bu iletişim kuralı bir 15 MHz insan vasküler sonda ile klinik bir Ekokardiyografik sistemiyle farelerde kardiyak ölçüleri açıklar. Ölçümler imzalat yetişkin fareler üzerinde gerçekleştirilir. En az üç görüntü sıralarını kaydedilir ve her hayvan için M-modu parasternal kısa eksenli görünümünde analiz. Daha sonra kardiyak histolojik inceleme yapılır ve cardiomyocyte çapları Hematoksilen üzerinde belirlenir-Eozin - ya da buğday tohumu agglutinin (WGA)-parafin kesitler lekeli. Gemi kararlı morphometrically Pecam-1 immunostaining sonra yoğunluğudur. Protokol farmakolojik çalışmalar başarıyla uygulanan ve farklı genetik hayvan modelleri temel koşullar altında hem de deneysel akut miyokard infarktüsü sol ön inen koroner arter (kalıcı ligasyonu tarafından sonra oldu ÇOCUK). Bizim deneyim, Ekokardiyografik inceleme imzalat hayvanlara sınırlıdır ve en az ağırlığında yetişkin farelerde uygulanabilirdir 25 gr.

Giriş

Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, büyük bir çeşitlilik vardır ve farmakolojik çalışmalar farelerde yüksek1,2sayısıdır. Ekokardiyografi ve MRI kardiyak fonksiyon ve Morfoloji bu fare modelleri3fenotipik karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar vardır. Amacı sunulan protokolü, kardiyak fonksiyon ve Morfoloji yetişkin farelerde analiz etmektir. Ekokardiyografi, histolojik, birleştirir ve immunohistokimyasal ölçümleri. Ekokardiyografik inceleme fareler4,5,6,7,8,9,10,11'yaygın olarak kullanılır, 12. Pachon vd. 205 çalışmalar kan dolaşımı, Kan dolaşımı araştırma, Amerikan Journal Fizyoloji - kalp ve dolaşım fizyolojisive Kardiyovasküler araştırma 2.012 ve 2015 ki arasında yayınlanan 11 tespit Ekokardiyografik inceleme hayvanlarda kullanılan.

Ekokardiyografi kalp fenotipleri genetiği değiştirilmiş fare5,6,13,14,15,16, tanımlamak için kullanılır 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , kronik aşırı kaynaklı hipertrofisi, miyokardiyal iskemi ve kardiyomiyopati modelleri (12incelendi) farelerde kardiyak fonksiyon analiz olarak 22, de. Geliştirilmiş Ekokardiyografi cihazları bırakmak için standart ölçü birimi (LV) sol ventrikül sistolik ve diyastolik boyutların, doku Doppler görüntüleme, miyokardiyal kontrast echography ve LV bölgesel fonksiyon ve koroner rezerv değerlendirilmesi 12. ideal olarak, Ekokardiyografik inceleme bilinçli farelerde contractile işlev, otonomik refleks kontrolü, anestezi olumsuz etkilerini önlemek için gerçekleştirilmesi ve kalp hızı11. Bununla birlikte, bu yaklaşım hayvanları eğitmek için gereksinimin tarafından sınırlıdır; vücut ısısı istikrarlı tutmak zorlukları; hareket eserler; stres; çok yüksek kardiyak Frekanslar; ve özellikle çok sayıda hayvan soruşturma altında iseniz deneme, gerçekleştirmek en az iki müfettişler gereksinimi. İlginçtir, bir çalışmada eğitimli ve eğitimsiz hayvanlar19Ekokardiyografik parametreler yok farklılıkları bildirdi. Ekokardiyografik ölçümlere imzalat farelerde gerçekleştiriyoruz. Farklı anestezi protokoller aşağıda ele alınacaktır.

Her ne kadar standart çözünürlük Ekokardiyografi (> 10 MHz) olduğunu ölçü LV sistolik ve diyastolik boyutlar ve kardiyak fonksiyon yetişkin farelerde yeterli, belgili tanımlık yöntem açıklamasını temel yapısal olayları sınırlıdır. Böylece, biz vivo ölçümleri ile histolojik birleştirmek ve immunohistological analizler, örneğin, cardiomyocyte çap ve gemi yoğunluğunu ölçmek için. Nükleer silahların yayılmasına karşı belirlenmesi, sınav apoptosis, enfarktüsü boyut ölçüleri, fibrozis ve belirli işaret ifade, belirlenmesi gibi diğer histolojik ve immunohistological araştırmalar da aynı tür üzerinde gerçekleştirilebilir doku işlenen ama bu protokol konusu değildir. Vivo Ekokardiyografik inceleme histolojik analizler ile kombinasyonu temel yapısal değişiklikler ilgili ek bilgiler sağlar. Ek bir adım olarak, bu ölçümler moleküler ve ultra yapısal İncelemeler ile tamamlayabilirsiniz. Histolojik analizler sadece Ekokardiyografik inceleme tamamlamak ama Ekokardiyografi çözünürlük yeterli olmadığında da vazgeçilmez olmak. Bu özellikle modelleri genetiği değiştirilmiş farelerin embriyonik öldürücü23,24olan durumdur.

Protokol

ilgili Kurumsal ve Fransız hayvan refah yasaları, kuralları ve ilkeleri ile uyumlu burada açıklanan deneyler yapılmıştır. Fransız Etik Komitesi tarafından onaylanmış olan (Comité Institutionnel d ' ki Pour l ' hayvan de Laboratoire; sayı NCE/2012-106).

1. Ekokardiyografi

  1. kullanarak uygun konumlandırma emin olmak için bir standart laboratuvar denge hafifçe kuyruğundan tutarak farenin vücut ağırlığını belirlemek.
  2. 50 mg/kg Fentobarbital 25 , 26 mayi (IP) enjeksiyonu ile hayvan anestezi.
    Not: aynı iletişim kuralını çalışma kullanılırsa, anestezi başka türlü kullanılabilir. Avantajları ve dezavantajları aşağıda tartışılacaktır.
  3. Fare geri kendi kafes ve bekleyin kadar tepkisiz yerine, sürekli nefes gösterir ve arka ayak refleks yok. Bu test etmek için bir ayak hafifçe sıkmak ve bacak hala geri çeker olup olmadığını gözlemlemek.
  4. Sol tarafındaki Toraks ve ticari bir kemirgen tıraş makinesi kullanarak sol koltuk altı tıraş.
    Not: Ekokardiyografik ölçümdeki girişimi engellemek için iyi fare saç tamamen kaldırılması için adanmış bir kemirgen tıraş makinesi kullanımına izin verir. Onlar genellikle, o uyanır sonra hangi hayvan rahatsız kokulu gibi ticari saç kaldırma krem veya çözümleri, kaçınılmalıdır. Isı kaybı arttıkça önlemek aşırı tıraş.
  5. 40-42 ° C-12 kafa ile bir sığ sol taraflı pozisyonda ayarla bir sıcak yastık üzerinde uyku hayvan koymak o ' saat ve 6 kuyruk o ' saat. Sol kol, sol ayak ve kuyruk bant ile düzeltmek.
  6. Uygula önceden Ekokardiyografi jel traş göğüs ve dönüştürücü başkanı üzerine ısındı.
  7. Dönüştürücü parasternal sağdan sola, Papiller kas düzeyde bir iki boyutlu (2D) parasternal uzun eksen görünümü elde etmek için boynun sağ tarafında yönlendiren yerleştirin. Dönüştürücü 90 ° papilary kas düzeyinde bir kısa-eksen görünümü elde etmek için saat yönünde çevir. Görüntü kalitesi veya kare hızını en üst düzeye çıkarmak için en az derinlik ayarı ve zoom kullanın. Tarama hızını maksimuma ayarlayın. Bu ayar, farklı yakınlaştırma ve derinlik ayar seçenekleri elde etmek için
    1. , makine ve yazılıma bağlı olarak kullanılabilir. Kayıt 2D güdümlü M-modu kısa-eksenindeki 27 görüntüleri. şekil 1A ve B 27 için başvurun.
      Not: göğüs için aşırı basınç uygulamaktan kaçının bu bradikardiyi neden dikkatli ol.
  8. Kayıt en az 3 Serisi 3 kalp beat cine döngüler her hayvan için.
    Not: Bu çalışmada kullanılan echocardiograph yazılım için basın " edinme/Kaydet " yalnızca bir kez düğme. Bu metodoloji echocardiograph bu yazılım ile özeldir. Diğer yazılım paketleri ile farklı makineleri kullanılabilir.
    9. Başarılı kayıtları, silme Ekokardiyografi kapalı fare Toraks, Isıtma yastığını ve dönüştürücü jel sonra
  9. . Bacaklarda ve kuyruk bandı çıkarın.
  10. Fare yukarı uyanır kadar gereksiz ışık pozlama ve ısı kaybına yol açmamak için doku ile kaplı Isıtma yastığını gözlem altında
  11. Hayvan geri onun kafes içinde yerine.
  12. Analiz parasternal kısa eksen görünümü sol ventrikül (LV) boyutu ve işlevi belirlemek için M-modu görüntüleri kaydetti. Sistol ve diastole (LVAWs ve LVAWd), LV iç son sistolik ve diyastolik uç çapı (LVIDs ve LVIDd) ve Sistol ve diastole (LVPWs ve LVPWd) kullanarak LV posterior duvar kalınlığı (LVPW) LV ön duvar kalınlığını ölçmek stok imge doku-kan arabirimde tanımlaması.
  13. Belirgin maksimal LV diyastolik boyutları anda diyastolik boyutlarını ölçün ve son sistolik boyutları en ön sistolik gezi LV posterior duvar saatinde LV. Dokunmatik ekran dokunun " analiz " simgesini ve sonra " LVAWd " simgesi. Sağ ventrikül boşluğuna ve diastole LV anterior duvarda arasında arayüz elektronik Kaliper çubuğuyla.
  14. LV ön duvar ve LV diyastolik ön duvar kalınlığı elde etmek için LV boşluğu arasında arayüz elektronik Kaliper çubuğuyla; yazılım doğrudan LV iç end-diastolik ölçüm için geçiş.
  15. LV kavite ve LV LV iç son diyastolik çap elde etmek için posterior duvar arasında arayüz Kaliper çubuğuyla; yazılım LV posterior duvar kalınlığı ölçümü için geçiş.
  16. LV posterior duvar ve LV diyastolik posterior duvar kalınlığı elde etmek için kalp zarını arasında arayüz Kaliper getirin. Dokunmatik ekran dokunun LV sistolik boyutları için " LVAWs " simgesi ve Sistol pozisyonda sağ ventrikül boşluğuna ve LV ön duvar arasında arayüz üzerinde elektronik Kaliper.
  17. Elektronik Kaliper LV ön duvar ve LV sistolik ön duvar kalınlığı elde etmek için LV boşluğu arasında arayüz üzerinde konumlandırın. LV iç son sistolik çapı ve LV sistolik posterior duvar kalınlığı için yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın. Ekokardiyografi Amerikan toplum tarafından kabul edilen öncü Kongre endocardial ve epicardial sınırları 13 , 27 izlemek için kullanın.
    Not: Önceki ölçümleri kullanarak LV contractile işlev parametreleri otomatik olarak hesaplanır. LV (FS) kısaltılması kesirli FS (%) tanımlanan [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd =] x 100. LV ejeksiyon fraksiyonu (EF) değiştirilmiş Teicholz formülüyle hesaplanır nerede EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. şekil 1A ve B başvurun.
  18. CD'ler veya USB bellek sopa verileri depolamak ve yedek kopyalarını.
  19. Alma, analiz ve uygun yazılımı kullanarak veri ihracat.
    Not: Bu temel ölçü birimlerinin sonra deneme duraklatılmış. Nakavt hayvanlar ve vahşi-türü littermates arasında doğrudan bir karşılaştırma yapmak, histolojik analizler 6 ile devam edin. CRE-ERT2 için; füme balığı/füme balığı fare hatları, açıklanan 5 , 24 olarak ı.p. enjeksiyonla tamoxifen indüksiyon ile ertesi gün devam. Deneysel akut miyokard infarktüsü sol koroner arter 5 , 28 ligasyonu tarafından inducing takdirde doğrudan Ekokardiyografi ölçümleri sonra ameliyat yapılır zaman fareler anestezi altında bulunmaktadır. Aksi takdirde, anestezi iki tur arasında bir haftanın en az bir gecikme ameliyat sonrası ölümcül hızını sınırlamak için saklanması gerekebilir.

2. Histolojik değerlendirme için kalp örnekleri hazırlanması

  1. kurban hayvanlar tarafından servikal çıkığı. Onların beden ağırlık ölçmek. Göğüs ve karın bir % 70 alkol bez kullanarak dezenfekte.
  2. Enine bir kesi Cilt 1 cm distal göğüs kemiği için yapmak. Künt forseps kullanarak, baş yönde hareket Toraks cilt kaldırın. Göğüs kemiği hafifçe iyi Forseps ile tutun ve iyi makas künt sonuna ekleyerek diyafram açın.
  3. Göğüs kafesi her iki tarafta göğüs kemiği paralel kesti. Göğüs kemiği kafa yönünde taşır. Kalp göğüs bulun. İyi Forseps ile kalp damar gövde tutun ve iyi makas kullanarak aşağıda kesti.
  4. Sandığı aç ve toraks dışında tüm kalp tüketim, kalp ağırlık ölçmek ve bir kalp vücut ağırlığı oranı 4 , 5 , 6 , kurmak 23 , 29 , 30 < /SUP >.
  5. Düzeltme 2 mL % 10 tarafsız tampon formalin çözeltisi 15 mL tüpler kalbinde gecede, 4 ° C.
    Dikkat: tehlike! Formalin çözümleri ile iş bir kimyasal duman mahallede yapılmalıdır; eldiven ve koruyucu gözlük.
    Not: arabellek oluşturma formalin çözümler için farklı tedarikçiler ile değişir gibi çalışma boyunca aynı tedarikçi kullanın.
  6. Ertesi gün, kalpleri transvers düzlemde ortasında, kesilmiş ve parafin yerleştirme, kaset içine aktarmak otomatik bir gömme cihazı kullanarak patoloji laboratuarında yapıldığı.
  7. Gerçekleştirmek kesit.
    1. Bölüm parafin blok bir microtome ve onları 40 ° C suda banyo içeren distile su kayan nokta kullanarak 3 µm kalınlığında.
    2. Bölümleri slaytlar üzerine aktarın. Kuru gecede slaytlara 37 ° C kuluçka makinesine izin ve kullanım için hazır kadar 4 ° C'de depolayabilirsiniz.
      Not: kullanıcı (Adım 3) boyama için hazır olması ne kadar protokol burada duraklatılmış.
  8. Deparaffinize ve suyla temasa doku slaytlar.
    1. Kavanoz cam ekler parafin eritmek 10 dk 55 ° C fırında ile boyama slaytları yerleştirin.
    2. Deparaffinize 200 ml Ksilen veya Ksilen yerine 5 min için iki değişiklik slaytları.
      Dikkat: Son derece yanıcı ve zehirli! Kimyasal duman mahallede iş; eldiven ve koruyucu gözlük.
    3. 200 mL % 100 alkol slaytları aktarın. 3 min için iki değişiklik yapmak ve bir kez 200 mL % 95 alkol 3 dakika süreyle aracılığıyla transfer
      Dikkat: Son derece yanıcı! Ateşleme kaynaklarından uzak tutun; sigara içmek yasak.
    4. 200 mL fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) 5 min için içinde iki defa durulayın ve adım 3, 4 veya 5'e geçin.

3. Hematoksilen ve Eozin boyama

  1. Slaytlar onların bölümlerde distile su ile durulama.
  2. 8 dakika süreyle Hematoksilen Çözümle çekirdeklerin leke
  3. Musluk suyu 10 dakika süreyle çalışan durulama
  4. 2 min. Eozin çözüm ile leke
  5. Dehydrate % 100 etanol (alkol) 2 min için üç kez. Ksilen veya Ksilen yerine 2 min için üç kez temizleyin. Montaj montaj Ksilen tabanlı ortamda.
  6. Fotoğraf slaytlar ve boyuna interventricular septum bölümlerini çekirdeğinde düzeyde cardiomyocyte çapı ölçmek. Bölüm ve kalp başına üç bölüm başına en az 100 hücre ölçmek.

4. WGA boyama

  1. Adım 2.7 tetramethylrhodamine (ya da diğer floresan boyalar) ile elde edilen slaytlar kuluçkaya-nemli bir oda oda sıcaklığında 60 dk için WGA (1: 100 PBS içinde) Birleşik.
  2. Yıkama üç kez PBS ile 5 dk her.
  3. Dağı ile floresan DAPI içeren ortam takma. Stok Analiz önce karanlıkta 4 ° C'de.
    Dikkat: Göz koruması ve uyumlu kimyasal dayanıklı eldiven giymek.
  4. Fotoğraf slaytları.
    1. Kullanım Floresans epi-aydınlatma ve filtre ile donatılmış bir mikroskop DAPI ve tetramethylrhodamine (Tablo malzemeler için başvurmak) için ayarlar. Maksimum diyafram otomatik poz için parlaklığı ayarlayın.
    2. Edinme resimleri, mavi ve kırmızı kanalları için 400 x büyütme ayrı. Görüntüleri ImageJ içinde açın. Parlaklığı ayarlayın ve gerekirse kontrast (görüntü > ayarla > Parlaklık/Kontrast).
    3. Ayarla her görüntüyü 8 bitlik (görüntü > türü > 8-bit). DAPI ve WGA görüntüleri yerleşimi. Mavi kanal DAPI ve kırmızı kanalı için WGA için yeşil ve gri kanalları yok olarak ayarlayın (görüntü > renk > birleştirme kanalları) 31.
  5. Cardiomyocyte çapları interventricular septum enine bölümlerini çekirdeğinde düzeyde belirlemek.
    1. Tanımla ImageJ Albümdeki ölçeğini. Bu amaçla, (Örneğin, bir hemasitometre odası kalp bölümler aynı büyütmede; adım 4.4) bilinen boyutlardaki fotoğraf.
    2. Başından sonuna kadar bir çizgi çizmek için normal amortisman aracı kullanmak bilinen yapısı (Analyze > ayarla ölçek).
      Not: Olan uzaklığını piksel otomatik olarak görüntülenir; bilinen uzaklık ve uzunluk birimi girilmesi gerekir. Cardiomyocyte ölçümler çekirdek düzeyde devam.
    3. WGA-pozitif zar DAPI pozitif çekirdeği ile WGA-pozitif hücre zarının ters siteye düz bir çizgi çizmek (Analyze > ölçü birimi). Sonuçları penceresinde uzunluğu değerleri anlamlı sayıda ondalık basamak bulunduğundan emin olun (Analyze > ayarla ölçümleri > ondalık basamak).
    4. Bölüm ve kalp başına üç bölüm başına en az 100 hücre ölçmek. Sonuçları Excel'e ver (tıklatın sonuçlarına > dosyayı > olarak kaydedin > .csv) 6 , 31.

5. Pecam-1 Immunostaining

  1. antijen maskesini gerçekleştirmek. Bir düdüklü tencere
    1. ekleyin 1 600 mL sodyum sitrat arabelleğe (10 mM sodyum sitrat, %0.05 ara 20, pH 6.0). Ocağın üzerinde düdüklü tencere yerleştirin ve tam güç açın. Bu noktada düdüklü tencere kapağı güvenli olmayana; Sadece üst üzerinde bekletin.
      Dikkat: Sıcak!
      2. Sodyum sitrat arabellek kaynar bir kez
    2. düdüklü tencere 2.5 adımından slaytları aktarın. Düdüklü tencere kapağı güvenli. En kısa zamanda tam basınç Ocak ulaşmıştır için 7 dakika bekleyin. 7 dk. geçen zaman, ocağın açmak ve boş bir lavaboda düdüklü tencere yerleştirin. Basınç yayın Vana etkinleştirmek ve soğuk su Ocak üzerinde çalıştırın. Bir kez de-basınçlı, kapağı açın ve soğuk su içine Ocak 5 dk. yer için slaytları 200 mL PBS çalıştırın.
      Not: her ne kadar aşırı ısınma riski artar alternatif olarak, mikrodalga antijen maskesini, kullanılabilir gibi.
  2. Kullanımı % 0,3 hidrojen peroksit blok endojen peroksidaz aktivitesi 5 dakika süreyle metanol içinde durulama slaytlar için üç kez 2 min için PBS içinde her 200 mL.
    Dikkat: Yanıcı ve toksik!
  3. 15dk Serumda bir avidin bloğu (4 damla 1 ml) da içeren seyreltilmiş normal engelleme (% 5 normal keçi serum içinde PBS) slaytlarını kuluçkaya.
  4. Dikkatle sıvı bölümlerden dokunun ve onları kuluçkaya Pecam-1 antikor tavşan üzerinden, seyreltilmiş 1:50 % 2.5 normal keçi serum ve biotin blok mL başına 4 damla içeren PBS ile. Slaytları gecede nemli bir Odası 4'te kuluçkaya ° C.
  5. 200 mL PBS slaytlar 5 min için üç kez yıkayın. Biotinylated keçi Anti-tavşan IgG antikor seyreltilmiş 1: 200, oda sıcaklığında 1 h için % 2.5 normal keçi serum içeren PBS içinde bölümlerle kuluçkaya. 200 mL PBS slaytlar 5 min için üç kez yıkayın.
  6. t kuluçkayao bölümleri için 20 dk (Reaktif A ve Reaktif B kombine 30 dakika önceki gerek kullanmak için) bir peroksidaz avidin/biotin tabanlı sistemi ile. 200 mL PBS slaytlar 5 min için üç kez yıkayın.
  7. Erimesi 1 3.3 '-diaminobenzidine (DAB) ve 1 üre hidrojen peroksit tablet 5 mL çift distile su. Yaklaşık 3 dk., renk geliştirme dikkatle izlenmesi için DAB çözüm bölümlerle kuluçkaya. Yavaşça 200 mL PBS slaytları yıkayarak renk reaksiyonu durdurmak.
    Dikkat: Kanserojen; kimyasal dayanıklı eldiven giymek!
  8. Çekirdeği Hematoksilen ile 6 min için counterstain. 2 dk. Dehydrate 2 min için üç kez musluk suyu 200 mL % 100 alkol durulama. Üç kez 2 min için Ksilen veya Ksilen yerine içinde her 200 mL temizleyin. Montaj montaj Ksilen tabanlı ortamda.
  9. Slaytlar (en az on alanları, her kalp interventricular septum üzerinden 40 x büyütme) Fotoğraf ve serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılım 31 kullanarak Pecam-1 alan yoğunluğunu ölçmek. Renk deconvolution 32 eklenti DAB ve Hematoksilen ve görüntü kontrastı ile aynı düzeye ayarlayın.
    Not: kahverengi ve mor/mavi renk var zorluklar ile renk deconvolution neden olabilir, önemli spektral çakışma durumunda bir Hematoksilen çözüm açık, açık mavi nükleer boyama elde etmek için farklı markalar deneyebilirsiniz. Alternatif olarak, ayirt veya el ile kılcal damarlar sayma yerine olabilir.

Sonuçlar

Şekil 1' de, genetiği değiştirilmiş farelerde kardiyak fenotipleri tanımlamak için Ekokardiyografi kullanışlılığı temsilcisi Ekokardiyografik kayıtları gösterir. Bir fare ile normal kardiyak fonksiyon (şekil 1A) ve dilate sol ventrikül ve azaltılmış LV fonksiyonu (şekil 1B) bir hayvanla arasındaki fark kolayca tespit edilebilir. Resim 2 (

Tartışmalar

Kardiyak yapısı ve fonksiyonu farelerde, Ekokardiyografi, kontrast-artırılmış MRI, CT mikro ve PET taraması gibi değerlendirmek için farklı yöntemler geliştirilmiştir. Maliyet-etkililik ve kolaylık nedeniyle Ekokardiyografi fareler11fonksiyonel analiz için en çok kullanılan tekniktir. Genel olarak, kalp ve nabız farelerde, dönüştürücü bir frekans ile yüksek frekans küçük boyutu nedeniyle > 10 MHz kullanılmalıdır, her ne kadar başarılı ölçümleri 8 ya da 9 MH...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Çalışma "Yatırımlar gelecek için" LABEX SIGNALIFE program sayesinde (başvuru ANR-11-LABX-0028-01) (Ulusal araştırma ajansı, ANR) Fransız hükümeti tarafından desteklenen ve K. hibe tarafından Derneği'nden D. W. pour la Recherche sur le kanser, Fondation de France ve kanser INSERM planı. D. B. ve A. V. Arkadaş grupları sırasıyla Fondation pour la Recherche Médicale ve Nice şehir aldı. Philips tarafından sağlanan echocardiograph ve dönüştürücü nazik idi. A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Karatepe, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini ve S. M. Wagner onların yetenekli teknik yardım için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamineLife Technologies, Molecular ProbesW849
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG AntibodyVectorlabsBA-1000
Avidin/Biotin Blocking KitVectorlabsSP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)VectorlabsPK-6100
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVectorlabsH-1200
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tabletsSigmaD4168
Hydrogen peroxide solutionSigmaH1009
Anti-Pecam-1 (CD31) antibodyAbcamab28364
Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100Parker
Linear ultrasound probe, L15-7ioPhilips Healthcare
Echocardiograph, IE33 xMATRIXPhilips Healthcare
Microscope, Leica DMi8Leica
Fluorescence Filterset DAPILeica11525304
Filterset TxRLeica11525310
Digital Camera, SPOT RT3 Color SliderSpot Imaging
Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic SoftwareSpot Imaging
Imaging ComputerDell
Fine ScissorsFine Science Tools14028-10
Large ScissorsFine Science Tools14501-14
Scalpel bladesFine Science Tools10023-00
Graefe ForcepsFine Science Tools11650-10
Rodent shaverHarvard Apparatus34-0243
cassettes for paraffin embeddingSakura4155F
neutral buffered FormalinSakura8727
XyleneSakura8733
Paraffine TEK IIISakura4511
automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIPSakura6032
paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5Sakura5229
microtome blades,Accu-Edge S35Sakura4685
microscopy slides, Tissue-TekSakura9533
cover slips, Tissue-TekSakura9582
Mounting medium Tissue-TekSakura1408
slide boxesSakura3958
eosine solutionSakura8703
hematoxyline solutionSakura8711
microtome, RM2125RTLeica720-1880 (VWR)
water bath, Leica HI1210Leica720-0113(VWR)
EthanolVWRACRO444220050
15 ml tubesVWR734-0451
staining glass dishVWRMARI4220004
staining jarsVWRMARI4200005
IncubatorBinder9010-0012
DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tabletsSigmaD4293
PBS (10X)Thermo Fisher Scientific70011044

Referanslar

  1. Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
  2. Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
  3. Phoon, C. K., Turnbull, D. H. Cardiovascular Imaging in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 6 (1), 15-38 (2016).
  4. Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
  5. Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).
  6. Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).
  7. Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
  8. de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
  9. Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).
  10. Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).
  11. Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
  12. Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
  13. Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
  14. Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
  15. Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
  16. Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
  17. Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
  18. Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
  19. Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, S124-S129 (2011).
  20. Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
  21. Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
  22. Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960 (2016).
  23. Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms' tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
  24. Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852 (2014).
  25. Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
  26. Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
  27. Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
  28. van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
  29. Wagner, K. D., et al. The Wilms' tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
  30. Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
  33. Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
  34. Ismail, J. A., et al. Immunohistologic labeling of murine endothelium. Cardiovasc Pathol. 12 (2), 82-90 (2003).
  35. Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
  36. Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
  37. Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
  38. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psorunu 128Transgenic fare modellerimiyokard infarkt sanesteziEkokardiyografisistolik ve diyastolik boyutlarHistolojiparafin kesitlerWGA boyamaPecam 1 imm nhistokimyaxarakteristikalar analizleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır