Examen échocardiographique et histologique de morphologie cardiaque chez la souris

Résumé

L’examen échocardiographique est fréquemment utilisée chez les souris. Appareils à ultrasons à haute résolution coûteux ont été développés à cet effet. Ce protocole décrit une procédure échocardiographique abordable combinée avec histologique morphométrique des analyses pour déterminer la morphologie cardiaque.

Résumé

Un nombre croissant de modèles de souris génétiquement modifiées sont apparues ces dernières années. En outre, le nombre d’études pharmacologiques réalisées chez la souris est élevé. Caractérisation phénotypique de ces modèles murins nécessite également l’examen de la fonction cardiaque et de la morphologie. L’échocardiographie et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) sont des méthodes couramment utilisées pour caractériser la fonction cardiaque et la morphologie chez la souris. Échocardiographiques et IRM des équipements spécialisés pour utilisation dans les petits rongeurs est coûteuse et nécessite un espace dédié. Ce protocole décrit les mesures cardiaques chez des souris en utilisant un système échocardiographique clinique avec une sonde vasculaire humaine de 15 MHz. Des mesures sont effectuées sur des souris adultes anesthésiés. Au moins trois séquences d’images sont enregistrées et analysées pour chaque animal en mode M dans la vue de court-axe parasternale. Par la suite, un examen histologique cardiaque est effectué et cardiomyocyte diamètres sont déterminés sur l’hématoxyline-éosine - ou germe de blé agglutinine (WGA)-paraffine coupes colorées. Densité de navire est déterminée morphométrique après immunomarquage Pecam-1. Le protocole a été appliquées avec succès à des études pharmacologiques et différentes génétiques des modèles animaux en conditions basales, ainsi qu’après infarctus expérimental par la ligature permanente de la gauche (d’artère coronaire descendante antérieure DAL). Dans notre expérience, étude échocardiographique est limitée aux animaux anesthésiés et est réalisable chez la souris adulte pesant au moins 25 g.

Introduction

Il existe une grande variété de modèles de souris génétiquement modifiées, et le nombre d’études pharmacologiques chez la souris est élevée^1,2. Échographie et l’IRM sont des méthodes couramment utilisées pour la caractérisation phénotypique de la fonction cardiaque et de la morphologie chez ces souris modèles³. Le protocole présenté vise à analyser la fonction cardiaque et la morphologie chez la souris adulte. Il combine échocardiographiques, histologiques et immunohistochemical des mesures. L’examen échocardiographique est employé couramment dans la souris^{4,5,6,7,8,9,10,11, 12}. Pachon et al. ¹¹ identifié 205 études publiées dans Circulation, Circulation Research, American Journal of Physiology - coeur et la physiologie circulatoireet Recherche cardiovasculaire entre 2012 et 2015 qui a utilisé un examen échocardiographique chez les animaux.

L’échocardiographie est utilisé pour identifier des phénotypes cardiaques chez les souris génétiquement modifiées^{5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22}, ainsi qu’analyser la fonction cardiaque chez l’hypertrophie chronique induite par la surcharge, l’ischémie myocardique et les modèles de cardiomyopathie chez la souris (évaluées ๲). Équipement d’échocardiographie améliorée permet à la la mesure standard du ventricule gauche (LV) systoliques et diastoliques dimensions, Doppler tissulaire, échographie de contraste myocardique et l’évaluation de la fonction régionale de LV et réserve coronarienne ¹². idéalement, l’examen échocardiographique doit être effectué chez des souris conscientes afin d’éviter les effets négatifs de l’anesthésie sur la fonction contractile, système nerveux autonome contrôle réflexe, et¹¹la fréquence cardiaque. Néanmoins, cette approche est limitée par l’obligation de former les animaux ; difficultés à maintenir la température du corps stable ; artefacts de mouvement ; stress ; très hautes fréquences cardiaques ; et l’exigence d’au moins deux chercheurs réaliser l’expérience, en particulier si un grand nombre d’animaux est incriminés. Fait intéressant, une étude récente a indiqué aucune différence des paramètres échocardiographiques chez des animaux entraînés et inexpérimentées de¹⁹. Nous effectuons des mesures échocardiographiques chez les souris anesthésiés. Protocoles d’anesthésie différents seront discutés ci-dessous.

Bien que l’échocardiographie résolution standard (> 10 MHz) est suffisante pour mesurer LV systolique et diastoliques dimensions et la fonction cardiaque chez la souris adulte, la méthode est limitée dans sa description des phénomènes structurels sous-jacents. Ainsi, nous combinons les mesures in vivo avec histologique et immunohistological analyses pour mesurer, par exemple, densité de diamètre et navire cardiomyocyte. Autres études histologiques et immunohistological, telles que la détermination de la prolifération, l’examen de l’apoptose, mesures de taille d’infarctus, détermination de la fibrose et l’expression des marqueurs spécifiques, peuvent également être effectuées sur le même type de traité des tissus mais ne font pas l’objet du présent protocole. La combinaison de in vivo l’examen échocardiographique avec analyse histologique permet de mieux comprendre supplémentaires altérations structurelles sous-jacentes. Dans une étape supplémentaire, nous pouvons compléter ces mesures par des études moléculaires et ultra-structurale. Des analyses histologiques non seulement terminer l’examen échocardiographique mais également devient indispensables lorsque la résolution de l’échocardiographie n’est pas suffisante. C’est particulièrement le cas dans les modèles de souris génétiquement modifiées qui sont embryonnaires létale^23,24.

Protocole

les expériences décrites ici ont été effectuées en conformité avec les lois pertinentes bien-être animal institutionnels et Français, lignes directrices et politiques. Ils ont été approuvés par le Comité d’éthique Français (Comité Institutionnel d ' l Ethique Pour ' Animal de Laboratoire ; numéro RCE/2012-106).

1. échocardiographie

1. déterminer le poids du corps de la souris à l’aide d’une balance de laboratoire standard en le tenant par la queue légèrement pour assurer un positionnement correct.
2. Anesthésier l’animal par l’injection intrapéritonéale (i.p.) de 50 mg/kg pentobarbital ^{25 , 26}.
   NOTE : Tout autre type d’anesthésie peut être utilisé si le même protocole est utilisé tout au long de l’étude. Avantages et inconvénients seront analysés ci-dessous.
3. Remettre la souris dans sa propre cage et attendre jusqu'à ce qu’il ne répond pas, il montre une respiration régulière, et les réflexes du pied arrière sont absents. Pour tester ceci, presser un pied légèrement et observer si la jambe se rétracte toujours.
4. Raser le côté gauche du thorax et de l’aisselle gauche à l’aide d’un rasoir commercial de rodent.
   Remarque : L’utilisation d’un rasoir rongeur dédié permet l’élimination complète des poils de souris fine pour éviter toute interférence dans l’évaluation échocardiographique. Crèmes dépilatoires commerciales ou des solutions il faut éviter, car ils sont généralement parfumées, qui perturberont l’animal après qu’il se réveille. Éviter le rasage excessive, car cela augmente la perte de chaleur.
5. Mettre l’animal dormant sur une dalle chaude située à 40-42 ° C en position côté gauche peu profonde, avec la tête à 12 o ' horloge et la queue à 6 o ' horloge. Fixer le bras gauche, jambe gauche et la queue avec du ruban.
6. Appliquer préchauffée échocardiographie gel sur la poitrine rasée et la tête du capteur de.
7. Place le transducteur parasternale gauche, orientez vers le côté droit du cou pour obtenir une vue d’axe à deux dimensions (2D) parasternale au niveau du muscle papillaire. Tourner le transducteur de 90° vers la droite pour obtenir une vue d’axe court au niveau du muscle papilary. Utiliser un réglage de profondeur minimale et un zoom pour maximiser la qualité et la cadence image. Régler la vitesse de balayage au maximum.
   1. Pour obtenir ces paramètres, le zoom différents et la définition des options de profondeur peut-être être utilisé, selon la machine et les logiciels. Images de mode M Records guidage 2D en court axe voir ²⁷. Reportez-vous à la Figure 1 a et B ²⁷.
      Remarque : prendre soin de ne pas appliquer une pression excessive sur la poitrine, car cela peut entraîner une bradycardie.
8. Série record au moins 3 de 3 boucles de cine battement de coeur pour chaque animal.
   Remarque : Pour le logiciel d’un échocardiographe utilisé dans cette étude, appuyez sur la " Acquire/Save " bouton une seule fois. Cette méthodologie est spécifique pour les échographies cardiaques avec ce logiciel particulier. Autres logiciels peuvent être utilisés avec des machines différentes.
9. Après le gel de bons enregistrements, essuyer l’échocardiographie du thorax de la souris, coussin chauffant et transducteur. Retirer le ruban de membres et queue.
10. Laissez la souris sous observation sur le coussin chauffant, recouvert de tissu afin d’éviter d’inutiles exposition et chaleur perte de lumière, jusqu'à ce qu’il réveille vers le haut
11. Remettre l’animal dans sa cage.
12. Analyse des images de mode M vue court-axe parasternale pour déterminer la fonction et les dimensions ventriculaires gauches de (LV) enregistrées. Mesurer l’épaisseur de la paroi antérieure de LV en systole et diastole (LVAWs et LVAWd), les LV télésystoliques et télédiastoliques diamètres internes (LVIDs et LVIDd) et l’épaisseur de paroi postérieure de LV (LVPW) dans la systole et la diastole (LVPWs et LVPWd) en utilisant le identification de l’interface sang-tissus sur les images stockées.
13. Mesurer les dimensions diastoliques au moment de l’apparentes dimensions diastoliques maximales de LV et LV télésystolique dimensions lors de l’excursion systolique plus antérieure de la paroi postérieure de la LV. Touchez l’écran tactile sur le " Analyze " icône et ensuite sur la " LVAWd " icône. Positionner le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la cavité ventriculaire droite et de la paroi antérieure de LV en diastole.
14. Placer le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la paroi antérieure du LV et la cavité de LV pour obtenir l’épaisseur de paroi antérieure diastolique LV ; le logiciel passera directement à la fin de diastole mesure interne du LV.
15. Placer l’étrier sur l’interface entre la cavité de LV et la paroi postérieure du LV pour obtenir le diamètre télédiastolique interne LV ; le logiciel basculera sur la mesure d’épaisseur de paroi postérieure LV.
16. Placer l’étrier sur l’interface entre la paroi postérieure de la LV et le péricarde pour obtenir l’épaisseur de paroi postérieure diastolique LV. Pour les dimensions systoliques LV, touchez l’écran tactile sur le " LVAWs " icône et position le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la cavité ventriculaire droite et de la paroi antérieure de LV en systole.
17. Placer le pied à coulisse électronique sur l’interface entre la paroi antérieure du LV et la cavité de LV pour obtenir l’épaisseur de paroi antérieure systolique LV. Répétez le processus tel que décrit ci-dessus pour le diamètre télésystolique interne LV et l’épaisseur de paroi postérieure systolique LV. Utiliser la pointe convention adoptée par l’American Society of Echocardiography pour tracer les frontières endocardiques et épicardique ^{13 , 27}.
    NOTE : Paramètres de la fonction contractile LV seront automatiquement calculées à l’aide de mesures antérieures. La fraction de raccourcissement (FS) LV est défini comme FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. La fraction d’éjection de LV (EF) est calculée avec la formule modifiée de Teicholz, où Fe (%) = [(LVIDd³-LVIDs³)/LVIDd ³] x 100 ¹². Se référer à la Figure 1 a et B.
18. Stocker les données sur les disques compacts ou les clés USB et de faire des copies de sauvegarde.
19. Import, analyser et exporter les données en utilisant le logiciel approprié.
    Remarque : Après ces mesures de référence, l’expérience peut être suspendue. Si vous effectuez une comparaison directe entre animaux knock-out et de type sauvage, procéder à des analyses histologiques ⁶. Pour Cre-ERT2 ; lignées de souris LOX/lox, continuer le lendemain avec induction de tamoxifène par injection intrapéritonéale, décrit ^{5 ,}, ²⁴. Si l’induction expérimentale de l’infarctus du myocarde par la ligature de l’artère coronaire gauche ^{5 , 28}, la chirurgie peut être effectuée directement après les mesures échocardiographiques, quand les souris sont sous anesthésie. Dans le cas contraire, un délai minimum d’une semaine entre deux tours de l’anesthésie devrait être maintenu afin de limiter le taux de létalité post-opératoire.

2. Préparation des échantillons de coeur pour une évaluation histologique

1. sacrifier les animaux par dislocation cervicale. Mesurer leurs poids corporel. Désinfecter la poitrine et l’abdomen à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool 70 %.
2. Faire une incision transversale dans la peau 1 cm distal au sternum. Avec une pincette émoussé, retirer la peau du thorax, se déplaçant dans la direction de la tête. Maintenez le sternum légèrement avec une pince fine et ouvrir le diaphragme en insérant l’extrémité arrondie de ciseaux fines.
3. Couper la cage thoracique sur les deux côtés parallèles au sternum. Déplacez le sternum en direction de la tête. Localiser le coeur dans le thorax. Tenez le tronc vasculaire du cœur avec la pince fine et coupe ci-dessous à l’aide des ciseaux.
4. Ouvrir le coffre et le coeur entier hors de la cage thoracique de l’accise, mesurer le poids du cœur et d’établir un cœur-à-corps poids ratio ^{4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.}
5. Fix coeur dans 2 mL de solution de 10 % de formol tamponné neutre dans des tubes de 15 mL durant la nuit à 4 ° C.
   ATTENTION : Danger ! Travail avec des solutions de formol doit être effectué sous une hotte chimique ; porter des gants et des lunettes de sécurité.
   Remarque : Étant donné que la composition du tampon pour les solutions de formol varie avec les différents fournisseurs, utilisez le même fournisseur tout au long de l’étude.
6. Le lendemain, découper les cœurs dans le plan transversal, au milieu et transférez-les dans cassettes pour l’enrobage de paraffine, qui est effectuée dans le laboratoire de pathologie à l’aide d’un appareil automatisé encastrement.
7. Effectuer sectionnement.
   1. Paraffine section bloque sur une épaisseur de 3 µm à l’aide d’un microtome et flotteur contenant l’eau distillée de bain dans une eau à 40 ° C.
   2. Transférer les sections sur les diapositives. Laisser les lames sécher jusqu’au lendemain dans un incubateur à 37 ° C et les stocker à 4 ° C jusqu’au prêt à l’emploi.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici jusqu'à ce que l’utilisateur est prête pour la coloration (étape 3).
8. Deparaffinize et réhydrater le tissu glisse.
   1. Déposer les lames dans la coloration des pots avec des insertions de verre dans un four à 55 ° C pendant 10 min faire fondre de la paraffine.
   2. Déparaffiner les diapositives de deux changements de 200 mL de xylène ou substitut du xylène de 5 min chacun.
      ATTENTION : Très inflammable et toxique ! Travailler sous une hotte chimique ; porter des gants et des lunettes de sécurité.
   3. Transférer les lames à 200 mL d’alcool à 100 %. Apporter deux modifications pendant 3 min chaque et transférer une fois par le biais de 200 mL d’alcool à 95 % pour 3 min.
      ATTENTION : Inflammable ! Tenir à l’écart des sources d’inflammation ; ne pas fumer.
   4. Rincer deux fois dans 200 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 5 min chacun et passez à l’étape 3, 4 ou 5.

3. L’hématoxyline et éosine coloration

1. rincer les lames avec leurs sections dans l’eau distillée.
2. Tacher les noyaux avec solution hématoxyline pendant 8 min.
3. Rincer à l’eau courante pendant 10 min.
4. Tache avec la solution d’éosine pendant 2 min.
5. Dehydrate trois fois pendant 2 min à 100 % d’éthanol (EtOH). Effacer trois fois pendant 2 min dans le xylène ou substitut du xylène. Montage sur un support de montage à base de xylène.
6. Photographier les diapositives et mesurer le diamètre du cardiomyocyte au niveau du noyau dans des coupes longitudinales du septum interventriculaire. Mesurer au moins 100 cellules par section et trois sections par cœur.

4. WGA coloration

1. Incuber les lames obtenues à l’étape 2.7 avec tétraméthylrhodamine (ou autres colorants fluorescents)-conjugué WGA (1/100 dans du PBS) pendant 60 min à température ambiante dans une chambre humide.
2. Laver trois fois avec du PBS pour chaque 5 min.
3. Mont avec fluorescence montage média contenant DAPI. Conserver à 4 ° C dans l’obscurité avant analyse.
   ATTENTION : Porter des lunettes de protection et des gants résistant aux produits chimiques compatibles.
4. Photographier les diapositives.
   1. Utiliser un microscope à fluorescence épi-illumination et filtre définit pour DAPI et tétraméthylrhodamine (voir la Table des matières). Réglez l’ouverture à la valeur maximale et la luminosité d’auto-exposition.
   2. Acquire séparer les images à un grossissement de x 400 pour les canaux rouges et bleu. Ouvrez les images dans ImageJ. Ajuster la luminosité et de contraste si nécessaire (Image > Adjust > luminosité/contraste).
   3. La valeur chaque image 8 bits (Image > Type > 8-bit). Superposer les images DAPI et WGA. Utiliser la couche bleue pour DAPI et le canal rouge pour WGA ; régler les canaux verts et gris None (Image > couleur > fusionner canaux) ³¹.
5. Déterminer les diamètres de cardiomyocyte au niveau du noyau dans des sections transversales du septum interventriculaire.
   1. Définir l’échelle des images dans ImageJ. À cette fin, photographier un objet de taille connue (par exemple, une chambre hémocytomètre au même grossissement que les sections de coeur ; étape 4.4).
   2. Utiliser l’outil linéaire pour tracer une ligne du début à la fin de la structure connue (Analyze > définissez échelle).
      Remarque : La distance en pixels s’affichera automatiquement ; l’unité de longueur et de distance connue devra figurer. Aller de l’avant avec les mesures du cardiomyocyte au niveau du noyau.
   3. Tracer une ligne droite de la membrane de WGA-positifs par le noyau DAPI-positifs sur le site en face de la membrane cellulaire de WGA-positive (Analyze > mesure). Dans la fenêtre de résultats, vérifiez que les valeurs de longueur ont un nombre significatif de chiffres après la virgule (Analyze > définir les mesures > décimales).
   4. Mesurer au moins 100 cellules par section et trois sections par cœur. Exporter les résultats vers Excel (cliquez sur résultats > fichier > enregistrer sous > .csv) ^{6 , 31}.

5. Immunomarquage PECAM-1

1. effectuer antigène démasquant. Tampon
   1. Ajouter 1 600 mL de citrate de sodium (citrate de sodium 10 mM, 0,05 % de Tween 20, pH 6,0) dans un autocuiseur. Placer la cocotte sur la plaque chauffante et tourner à pleine puissance. Ne montez pas le couvercle de la marmite à pression, à ce stade ; Posez-le simplement sur le dessus.
      ATTENTION : Chaud !
   2. Une fois que le tampon citrate de sodium est en ébullition, transférer les lames de l’étape 2.5 dans l’autocuiseur. Fixez le couvercle de la marmite à pression. Dès que la cuisinière a atteint la pleine pression, attendre pendant 7 min. 7 min révolues, éteignez la plaque de cuisson et placez la cocotte dans un évier vide. Activer la vanne de décharge, puis exécutez l’eau froide l’auto-cuiseur. Une fois qu’il a dépressurisé, ouvrez le couvercle et faites couler l’eau froide dans le cuiseur pendant 5 min Place les diapositives dans 200 mL de PBS.
      NOTE : Alternativement, micro-ondes antigène démasquer pourrait être utilisé, bien que le risque de surchauffe augmente.
2. Emploi 0,3 % de peroxyde d’hydrogène dans le méthanol à activité peroxydasique endogène bloc pendant 5 min. Rincer les lames pour chaque 200 mL dans du PBS, trois fois pendant 2 min.
   ATTENTION : Inflammable et toxique !
3. Incuber les lames pendant 15 min en normal blocage du sérum dilué (5 % de sérum de chèvre normal dans du PBS) qui contient également un bloc avidine (4 gouttes dans 1 mL).
4. Soigneusement taper le liquide provenant des sections et les incuber avec Pecam-1 anticorps de lapin, dilués 01:50 dans du PBS contenant 2,5 % de sérum de chèvre normal et 4 gouttes de bloc de biotine par mL. Incuber les lames pendant la nuit dans une chambre humide à 4 ° C.
5. Laver les lames trois fois de 5 min chacun dans 200 mL de PBS. Incuber les sections avec biotinylé chèvre anti-lapin IgG anticorps dilué 1 : 200 en PBS contenant 2,5 % de sérum de chèvre normal pendant 1 h à température ambiante. Laver les lames trois fois de 5 min chacun dans 200 mL de PBS.
6. Incuber tsections de He avec un système basé sur l’avidine/biotine peroxydase pendant 20 min (réactif A et réactif B doivent être combinés 30 minutes avant utilisation). Laver les lames trois fois de 5 min chacun dans 200 mL de PBS.
7. Dissoudre 1 3,3 '-diaminobenzidine (DAB) et 1 urée peroxyde d’hydrogène comprimé dans 5 mL d’eau bidistillée. Incuber les sections avec DAB solution pendant environ 3 min, soigneusement suivi de l’évolution de la couleur. Arrêter la réaction de la couleur en lavant délicatement les diapositives dans 200 mL de PBS.
   ATTENTION : Cancérigènes ; porter des gants résistant aux produits chimiques !
8. Contre-coloration les noyaux pendant 6 min avec l’hématoxyline. Rincer à l’eau du robinet pendant 2 min. Dehydrate trois fois pendant 2 min de chaque en cours d’exécution dans 200 mL d’alcool à 100 %. Effacer trois fois pendant 2 min chaque dans 200 mL de xylène ou un substitut de xylène. Montage sur un support de montage à base de xylène.
9. Photographier les diapositives (au moins dix champs au grossissement x 40 le septum interventriculaire de chaque cœur) et de mesurer la densité de zone Pecam-1 à l’aide de logiciels ImageJ librement disponibles ³¹. Utiliser le plugin de ³² de déconvolution de couleur pour DAB et l’hématoxyline et ajuster le contraste de l’image au même niveau.
   Remarque : dans le cas où la couleur marron et violet/bleu ont un chevauchement important spectral, qui risquent d’entraîner des difficultés avec la déconvolution de couleur, on pourrait essayer différentes marques de solution de l’hématoxyline pour obtenir une coloration nucléaire clair et bleu clair. Alternativement, immunofluorescence ou comptage manuel des capillaires pourrait être réalisée.

Résultats

Dans la Figure 1, représentant échocardiographiques enregistrements démontrent l’utilité de l’échocardiographie pour identifier des phénotypes cardiaques chez des souris génétiquement modifiées. La différence entre une souris avec une fonction cardiaque normale (Figure 1 a) et un animal avec un ventricule gauche dilaté et la fonction ventriculaire réduite (Figure 1 b) peut facilement ...

Discussion

Différentes méthodes ont été développées pour évaluer la structure cardiaque et la fonction chez les souris, y compris l’échocardiographie, renforcement du contraste MRI, micro CT et PET scan. En raison de son rapport coût/efficacité et simplicité, échocardiographie est la technique plus largement utilisée pour l’analyse fonctionnelle de souris¹¹. En général, en raison de la petite taille du cœur et la haute fréquence de la fréquence cardiaque chez les souris, les transducteu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine	Life Technologies, Molecular Probes	W849
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vectorlabs	BA-1000
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vectorlabs	SP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)	Vectorlabs	PK-6100
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4168
Hydrogen peroxide solution	Sigma	H1009
Anti-Pecam-1 (CD31) antibody	Abcam	ab28364
Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100	Parker
Linear ultrasound probe, L15-7io	Philips Healthcare
Echocardiograph, IE33 xMATRIX	Philips Healthcare
Microscope, Leica DMi8	Leica
Fluorescence Filterset DAPI	Leica	11525304
Filterset TxR	Leica	11525310
Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider	Spot Imaging
Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software	Spot Imaging
Imaging Computer	Dell
Fine Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Large Scissors	Fine Science Tools	14501-14
Scalpel blades	Fine Science Tools	10023-00
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11650-10
Rodent shaver	Harvard Apparatus	34-0243
cassettes for paraffin embedding	Sakura	4155F
neutral buffered Formalin	Sakura	8727
Xylene	Sakura	8733
Paraffine TEK III	Sakura	4511
automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP	Sakura	6032
paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5	Sakura	5229
microtome blades,Accu-Edge S35	Sakura	4685
microscopy slides, Tissue-Tek	Sakura	9533
cover slips, Tissue-Tek	Sakura	9582
Mounting medium Tissue-Tek	Sakura	1408
slide boxes	Sakura	3958
eosine solution	Sakura	8703
hematoxyline solution	Sakura	8711
microtome, RM2125RT	Leica	720-1880 (VWR)
water bath, Leica HI1210	Leica	720-0113(VWR)
Ethanol	VWR	ACRO444220050
15 ml tubes	VWR	734-0451
staining glass dish	VWR	MARI4220004
staining jars	VWR	MARI4200005
Incubator	Binder	9010-0012
DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4293
PBS (10X)	Thermo Fisher Scientific	70011044