Esame ecocardiografico ed istologico della morfologia cardiaca nel topo

Riepilogo

L'esame ecocardiografico è frequente nei topi. Sono stati sviluppati dispositivi costosi ultrasuono ad alta definizione per questo scopo. Questo protocollo descrive una procedura ecocardiografica conveniente combinata con analisi morfometriche istologico per determinare la morfologia cardiaca.

Abstract

Un numero crescente di modelli murini geneticamente modificati è diventato disponibile negli ultimi anni. Inoltre, il numero di studi farmacologici effettuati nei topi è alto. Caratterizzazione fenotipica di questi modelli del mouse richiede anche l'esame della morfologia e funzione cardiaca. L'ecocardiografia e la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) sono comunemente utilizzati approcci per caratterizzare la funzione cardiaca e morfologia nei topi. Apparecchiatura ecocardiografica e MRI specializzati per l'uso in piccoli roditori è costoso e richiede uno spazio dedicato. Questo protocollo descrive misure cardiache nei topi usando un sistema ecocardiografico clinico con una sonda vascolare umano 15 MHz. Misurazioni eseguite su topi adulti anestetizzati. Almeno tre sequenze di immagini sono registrati e analizzati per ogni animale in M-mode nella visualizzazione parasternale asse corto. In seguito, viene eseguito l'esame istologico cardiaco e del cardiomyocyte diametri sono determinati su ematossilina-eosina - o germe di grano dell'agglutinina (WGA)-paraffina sezioni macchiate. La densità del vaso è determinato morfometrico dopo Pecam-1 immunostaining. Il protocollo è stati applicati con successo agli studi farmacologici e diversi modelli animali genetici sotto condizioni di base, così come dopo infarto miocardico sperimentale di legatura permanente del (dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra LAD). Nella nostra esperienza, indagine ecocardiografica è limitata agli animali anestetizzati ed è fattibile in topi adulti peso corporeo di almeno 25 g.

Introduzione

Una grande varietà di modelli murini geneticamente modificati sono disponibili e il numero di studi farmacologici nei topi è alta^1,2. Ecocardiografia e MRI sono gli approcci comunemente utilizzati per la caratterizzazione fenotipica della funzione cardiaca e la morfologia in questi modelli del mouse³. L'obiettivo del protocollo presentato è quello di analizzare la funzione cardiaca e morfologia in topi adulti. Combina ecocardiografica, istologiche e immunohistochemical misurazioni. L'esame ecocardiografico è ampiamente usato in topi^{4,5,6,7,8,9,10,11, 12}. Pachon et al. ¹¹ identificato 205 studi pubblicati in circolazione, Circulation Research, American Journal of Physiology - cuore e fisiologia circolatoriae Ricerca cardiovascolare tra il 2012 e il 2015 che utilizzato l'esame ecocardiografico in animali.

L'ecocardiografia è utilizzato per identificare fenotipi cardiaci in topi geneticamente modificati^{5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22}, anche per analizzare la funzione cardiaca in ipertrofia indotta da sovraccarico cronico, l'ischemia del miocardio e modelli di cardiomiopatia in topi (rivisto in¹²). Migliorata l'ecocardiografia apparecchiature permettono la misura standard di sinistra-ventricolare dimensioni di sistolica e diastoliche (LV), formazione immagine di Doppler del tessuto, ecografia di contrasto del miocardio e la valutazione della funzione regionale di LV e riserva coronarica ¹². idealmente, esame ecocardiografico dovrebbe essere effettuato nei topi coscienti per evitare gli effetti negativi dell'anestesia sulla funzione contrattile, controllo riflesso autonomo, e frequenza cardiaca¹¹. Tuttavia, questo approccio è limitato dall'esigenza di addestrare gli animali; Difficoltà nel mantenere la temperatura corporea stabile; artefatti di movimento; stress; frequenze cardiache molto alte; e il requisito di almeno due investigatori eseguire l'esperimento, soprattutto se un gran numero di animali è sotto inchiesta. Interessante, uno studio recente ha non segnalato nessuna differenza nei parametri ecocardiografici in animali addestrati e inesperto¹⁹. Eseguiamo misurazioni ecocardiografiche nei topi anestetizzati. Protocolli di anestesia diversi saranno discusso di seguito.

Anche se l'ecocardiografia risoluzione standard (> 10 MHz) è sufficiente per misurare LV sistolica e diastoliche dimensioni e funzione cardiaca nei topi adulti, il metodo è limitato nella sua descrizione di fenomeni strutturali sottostanti. Quindi, uniamo le misurazioni in vivo con istologici e immunohistological analisi per misurare, ad esempio, densità di diametro e la nave dei cardiomiociti. Altre indagini istologiche ed immunoistochimiche, quali la determinazione di proliferazione, esame di apoptosi, misure di dimensione di infarto, determinazione di fibrosi e di espressione di marcatori specifici, possono essere eseguite anche sullo stesso tipo di elaborati del tessuto, ma non sono oggetto del presente protocollo. La combinazione di esame ecocardiografico in vivo con analisi istologiche fornisce ulteriori approfondimenti alterazioni strutturali sottostanti. In un ulteriore passaggio, possiamo completare queste misure con le indagini ultrastrutturali e molecolari. Le analisi istologiche non solo completano l'esame ecocardiografico ma anche diventano indispensabile quando la risoluzione dell'ecocardiografia non è sufficiente. Questo è specialmente il caso in modelli di topi geneticamente modificati che sono letale embrionale^23,24.

Protocollo

gli esperimenti descritti qui sono stati effettuati in conformità con le leggi pertinenti istituzionale e francese sul benessere degli animali, linee guida e criteri. Essi sono stati approvati dal comitato etico francese (Comité Institutionnel d ' Ethique Pour il ' animale de Laboratoire; numero NCE/2012-106).

1. ecocardiografia

1. determinare il peso del corpo del mouse usando una bilancia di laboratorio standard, tenendola leggermente dalla coda per assicurare il posizionamento corretto.
2. Anestetizzare l'animale tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di 50 mg/kg pentobarbital ^{25 , 26}.
   Nota: Qualsiasi altro tipo di anestesia può essere utilizzato se viene utilizzato lo stesso protocollo in tutto lo studio. Vantaggi e svantaggi saranno discusso di seguito.
3. Mettere il mouse indietro nella propria gabbia e aspettare fino a quando esso non risponde, si vede il respiro regolare, e i riflessi del piede posteriore sono assenti. Per eseguire questo test, spremere un piede leggermente e osservare se la gamba si ritrae ancora.
4. Radere il lato sinistro del torace e l'ascella sinistra utilizzando un rasoio roditore commerciale.
   Nota: L'uso di un rasoio roditore dedicato consente la completa rimozione dei capelli del mouse bene per evitare interferenze nella misurazione ecocardiografica. Creme depilazione commerciali o soluzioni dovrebbero essere evitati, come di solito sono profumati, che disturbano l'animale dopo che si risveglia. Evitare eccessiva rasatura, in quanto aumenta la perdita di calore.
5. Mettere l'animale dorme su un pad caldo impostato su 40-42 ° C in una posizione di sinistra-parteggiato poco profonda, con la testa alle 12 o ' dell'orologio e la coda alle 6 o ' orologio. Fissare il braccio sinistro, la gamba sinistra e la coda con del nastro.
6. Applica l'ecocardiografia gel sul petto rasato e la testa del trasduttore preriscaldato.
7. Posizionare il trasduttore parasternale sinistra, orientandolo verso il lato destro del collo per ottenere una visione di lungo-asse bidimensionale (2D) parasternal al livello del muscolo papillare. Girare il trasduttore di 90° in senso orario per ottenere una vista corta-asse a livello del muscolo papilary. È possibile utilizzare un'impostazione di profondità minima e uno zoom per ingrandire immagine qualità e frame rate. Impostare la velocità di spazzata al massimo.
   1. Per ottenere queste impostazioni, zoom diversi e opzioni di regolazione della profondità può essere utilizzato, a seconda della macchina e software. Registrare immagini 2D-Guida M-mode in breve-asse Vedi ²⁷. Fare riferimento alla Figura 1A e B ²⁷.
      Nota: fare attenzione a evitare una eccessiva pressione al petto, poiché ciò può causare bradicardia.
8. Registra almeno 3 serie di 3 cuore battere cine loop per ciascun animale.
   Nota: Per il software di ecocardiografo utilizzato in questo studio, premere il " Acquire/Salva " solo una volta il pulsante. Questa metodologia è specifica per l'ecocardiografo con questo software particolare. Altri pacchetti software possono essere utilizzati con macchine diverse.
9. Dopo successo registrazioni, pulire l'ecocardiografia gel dal torace del mouse, rilievo di riscaldamento e trasduttore. Rimuovere il nastro dalle arti e la coda.
10. Lascia il mouse sotto osservazione il termocuscino, coperto di tessuto per evitare inutili perdite esposizione e calore luce, fino a quando si sveglia up.
11. Mettere l'animale torna nella sua gabbia.
12. Analizza registrato immagini M-mode da vista breve-asse parasternal per determinare la funzione e dimensioni di (LV) ventricolare sinistra. Misurare lo spessore della parete anteriore LV in sistole e diastole (LVAWs e LVAWd), i LV telesistolico e fine diastole diametri interni (LVIDs e LVIDd) e lo spessore di parete posteriore di LV (LVPW) in sistole e diastole (LVPWs e LVPWd) utilizzando la identificazione dell'interfaccia tessuto-sangue su immagini memorizzate.
13. Misurare le dimensioni diastoliche al tempo delle dimensioni diastoliche LV massimale apparente e LV dimensioni telesistolico al momento dell'escursione sistolica più anteriore della parete posteriore LV. Tocca il touchscreen sul " Analyze " icona e quindi sulla " LVAWd " icona. Posizionare il calibro elettronico sull'interfaccia fra la cavità ventricolare di destra e la parete anteriore di LV nel diastole.
14. Posizionare il calibro elettronico sull'interfaccia tra la parete anteriore di LV e la cavità di LV per ottenere lo spessore di parete anteriore diastolica di LV; il software passerà direttamente alla misura telediastolica interna LV.
15. Posizionare la pinza sull'interfaccia fra la cavità di LV e la parete posteriore di LV per ottenere il diametro interno fine-diastolica di LV; il software passerà per la misura di spessore di parete posteriore LV.
16. Posizionare la pinza sull'interfaccia tra la parete posteriore di LV e il pericardio per ottenere lo spessore di parete posteriore diastolica di LV. Per le dimensioni sistolica LV, toccare il touch screen il " LVAWs " icona e posizione il calibro elettronico sull'interfaccia fra la cavità ventricolare di destra e la parete anteriore di LV in sistole.
17. Posizione il calibro elettronico sull'interfaccia tra la parete anteriore di LV e la cavità di LV per ottenere lo spessore di parete anteriore sistolico di LV. Ripetere la procedura come descritto sopra per il diametro telesistolico interno LV e lo spessore di parete posteriore sistolica di LV. Utilizzare la convenzione di avanguardia adottata dalla American Society of Echocardiography per tracciare i confini endocardial e dell'epicardio ^{13 , 27}.
    Nota: I parametri di funzione contrattile di LV verranno calcolati automaticamente utilizzando le misurazioni precedenti. Il LV (FS) di riduzione frazionario è definito come FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. La frazione di eiezione (EF) di LV è calcolata con la formula di Teicholz modificata, dove EF (%) = [(LVIDd³-LVIDs³)/LVIDd ³] x 100 ¹². Fare riferimento alla Figura 1A e B.
18. Memorizzare i dati su compact disc o USB memory stick e fare copie di backup.
19. Importazione, analizzare ed esportare i dati utilizzando il software appropriato.
    Nota: Dopo queste misurazioni di base, l'esperimento può essere sospeso. Se si esegue un confronto diretto tra gli animali knockout e selvaggio-tipo littermates, procedere con l' analisi istologiche ⁶. Per Cre-ERT2; lox/lox mouse linee, continuare il giorno seguente con tamoxifene induzione da i.p. l'iniezione, come descritto ^{5 , 24}. Se indurre infarto miocardico sperimentale tramite la legatura dell'arteria coronaria sinistra ^{5 , 28}, la chirurgia può essere eseguita direttamente dopo le misurazioni ecocardiografiche, quando i topi sono sotto anestesia. In caso contrario, un ritardo minimo di una settimana tra due turni di anestesia dovrebbe essere mantenuto per limitare il tasso di mortalità post-operatoria.

2. Preparazione di campioni di cuore per la valutazione istologica

1. sacrificare gli animali dalla dislocazione cervicale. Misurare il loro peso corporeo. Disinfettare il petto e l'addome utilizzando un tampone di alcool al 70%.
2. Fare un'incisione trasversale nella pelle 1 cm distale allo sterno. Usando il forcipe smussato, togliere la pelle dal torace, si muove in direzione della testa. Tenere lo sterno leggermente con una pinzetta e aprire il diaframma inserendo l'estremità smussata di forbici bene.
3. Tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati paralleli allo sterno. Spostare lo sterno in direzione della testa. Individuare il cuore nel torace. Tenere il tronco vascolare del cuore con una pinzetta e taglio qui sotto utilizzando forbici bene.
4. Aprire il torace e asportare l'intero cuore fuori del torace, misurare il peso del cuore e stabilire un cuore-a-corpo peso rapporto ^{4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /sup >.}
5. Fix il cuore in 2 mL di soluzione di formalina neutra tamponata 10% in provette da 15 mL durante la notte a 4 ° C.
   Attenzione: pericolo! Lavoro con soluzioni di formalina deve essere fatto in una cappa chimica; indossare guanti e occhiali di sicurezza.
   Nota: Come la composizione di buffer per le soluzioni di formalina varia con diversi fornitori, utilizzare lo stesso fornitore in tutto lo studio.
6. Il giorno successivo, tagliare i cuori sul piano trasversale, in mezzo e trasferirli in cassette per inclusione in paraffina, che viene eseguita nel laboratorio di patologia utilizzando un apparato di incorporamento automatizzato.
7. Eseguire sezionamento.
   1. Paraffina sezione blocca ad uno spessore di 3 µm utilizzando un microtomo e galleggiare in acqua a 40 ° C vasca contenente l'acqua distillata.
   2. Trasferire le sezioni sui vetrini. Lasciare i vetrini per asciugare durante la notte in un incubatore a 37 ° C e conservarli a 4 ° C fino a che pronto per l'uso.
      Nota: Il protocollo può essere sospesa qui fino a quando l'utente è pronto per la colorazione (passaggio 3).
8. Deparaffinize e reidratare il tessuto scivola.
   1. Porre i vetrini in vaschette con inserti di vetro nel forno a 55 ° C per 10 min sciogliere la paraffina per colorazione.
   2. Deparaffinizzare le diapositive in due modifiche di 200 mL di xilene o sostituto di xilene per 5 minuti ciascuno.
      Attenzione: Altamente infiammabile e tossico! Lavorare in una cappa chimica; indossare guanti e occhiali di sicurezza.
   3. Trasferire i vetrini a 200 mL di alcole a 100%. Fare due modifiche per 3 minuti ciascuno e trasferire una volta attraverso 200 mL di alcol al 95% per un minimo di 3
      Attenzione: Altamente infiammabile! Tenere lontano da fonti di ignizione; non fumare.
   4. Sciacquare due volte in 200 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) per 5 minuti ciascuno e continuare con il passaggio 3, 4 o 5.

3. Ematossilina ed eosina

1. sciacquare i vetrini con le sezioni in acqua distillata.
2. Macchia i nuclei con soluzione di ematossilina per 8 min.
3. Sciacquare in acqua corrente per 10 min.
4. Macchia con la soluzione di eosina per 2 min.
5. Disidratare tre volte per 2 min in 100% di etanolo (EtOH). Deselezionare tre volte per 2 min in xilene o sostituto di xilene. Montaggio in un mezzo di montaggio a base di xilene.
6. Fotografare le diapositive e misurare il diametro dei cardiomiociti a livello del nucleo in sezioni longitudinali del setto interventricular. Misurare almeno 100 cellule per sezione e tre sezioni per cuore.

4. Macchiatura di WGA

1. Incubare i vetrini ottenuti dal passaggio 2.7 con tetrametilrodamina (o altri coloranti fluorescenti)-coniugato WGA (1: 100 in PBS) per 60 min a temperatura ambiente in una camera umida.
2. Lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
3. Mount con fluorescenza montaggio supporti contenenti DAPI. Conservare a 4 ° C al buio prima dell'analisi.
   Attenzione: Indossare occhiali protettivi e guanti resistenti alle sostanze chimiche compatibili.
4. Fotografare le diapositive.
   1. Uso un microscopio dotato di fluorescenza epi-illuminazione e filtro imposta per DAPI e tetrametilrodamina (fare riferimento alla Tabella materiali). Impostare il diaframma al massimo e la luminosità di esposizione automatica.
   2. Acquire separare immagini a 400 ingrandimenti per i canali rossi e il blu. Aprire le immagini in ImageJ. Regolare la luminosità e il contrasto se necessario (immagine > regolare > luminosità/contrasto).
   3. Impostare ogni immagine a 8 bit (immagine > tipo > 8-bit). Sovrapporre le immagini DAPI e WGA. Utilizzare il canale blu per DAPI e il canale rosso per WGA; impostare i canali verdi e grigi su nessuno (immagine > colore > unire i canali) ³¹.
5. Determinare i diametri dei cardiomiociti a livello del nucleo in sezioni trasversali del setto interventricular.
   1. Definire la scala delle immagini in ImageJ. Per questo scopo, fotografare un oggetto di dimensioni note (ad es., un'emocitometro camera allo stesso ingrandimento come le sezioni di cuore; punto 4.4).
   2. Utilizzare lo strumento linea retta per disegnare una linea dall'inizio alla fine della struttura conosciuta (Analyze > impostare scala).
      Nota: La distanza in pixel verrà visualizzata automaticamente; l'unità di lunghezza e distanza nota dovrà essere inserito. Procedere con le misurazioni dei cardiomiociti a livello del nucleo.
   3. Disegnare una linea retta dalla membrana WGA-positivi attraverso il nucleo di DAPI-positivo al lato opposto della membrana cellulare WGA-positivi (Analyze > misura). Nella finestra dei risultati, assicurarsi che i valori di lunghezza hanno un significativo numero di posizioni decimali (Analyze > impostare misure > decimali).
   4. Misurare almeno 100 cellule per sezione e tre sezioni al cuore. Esportare i risultati in Excel (fare clic su risultati > File > salvare come >. csv) ^{6 , 31}.

5. Immunostaining PECAM-1

1. eseguire antigene smascheramento. Buffer di
   1. aggiungere 1.600 mL di sodio citrato (citrato di sodio di 10 mM, 0,05% di Tween 20, pH 6.0) per una pentola a pressione. Posizionate la pentola a pressione sulla piastra e ruotare a piena potenza. Non fissare il coperchio della pentola a pressione a questo punto; Basta appoggiarla sulla parte superiore.
      Attenzione: Caldo!
   2. Una volta che il buffer di citrato di sodio è bollente, trasferire le diapositive da passo 2.5 per la pentola a pressione. Fissare il coperchio della pentola a pressione. Non appena la pentola ha raggiunto piena pressione, attendere 7 min. Quando siano trascorsi 7 min, spegnere il fornello e mettere la pentola a pressione in un lavandino vuoto. Attivare la valvola di rilascio pressione e correre acqua fredda sopra il fornello. Una volta che esso è depressurizzato, aprire il coperchio ed eseguire acqua fredda nella pentola per 5 min posto le diapositive in 200 mL di PBS.
      Nota: In alternativa, forno a microonde antigene smascheramento poteva essere utilizzato, anche se il rischio di surriscaldamento.
2. Uso 0,3% perossido di idrogeno in metanolo al blocco attività perossidasica endogena per 5 min, sciacquare i vetrini per tre volte per 2 min ogni in 200 mL di PBS.
   Attenzione: Infiammabile e tossico!
3. Incubare i vetrini per 15 min in siero blocco normale diluito (siero di capra normale di 5% in PBS) che contiene anche un blocco di avidina (4 gocce in 1 mL).
4. Attentamente toccare il liquido dalle sezioni e li incubare con l'anticorpo Pecam-1 da coniglio, diluito 01:50 in PBS contenente siero di capra normale 2,5% e 4 gocce di blocco della biotina / mL. Incubare le diapositive durante la notte in una camera umida a 4 ° C.
5. Lavare i vetrini tre volte per 5 minuti ciascuno, in 200 mL di PBS. Incubare le sezioni con biotinilati goat anti-rabbit IgG Anticorpo diluito 1: 200 in PBS contenente siero di capra normale 2,5% per 1 h a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte per 5 minuti ciascuno, in 200 mL di PBS.
6. Incubare tsezioni di lui con un sistema basato su avidina/biotina perossidasi per 20 min (Reagente A e reagente B devono essere combinati 30 minuti prima di utilizzare). Lavare i vetrini tre volte per 5 minuti ciascuno, in 200 mL di PBS.
7. Sciogliere 1 3,3 '-diaminobenzidina (DAB) e perossido di idrogeno 1 urea tablet in 5 mL di acqua bidistillata. Incubare le sezioni con DAB soluzione per circa 3 min., monitoraggio attentamente lo sviluppo del colore. Arrestare la reazione di colore lavando delicatamente le diapositive in 200 mL di PBS.
   Attenzione: Cancerogeni; indossare guanti resistenti alle sostanze chimiche!
8. Colorante di contrasto i nuclei per 6 min con ematossilina. Sciacquare in acqua corrente per 2 min disidratare tre volte per 2 minuti ciascuno, in 200 mL di alcole a 100%. Deselezionare tre volte per 2 min ogni in 200 mL di xilene o un sostituto di xilene. Montaggio in un mezzo di montaggio a base di xilene.
9. Fotografare le diapositive (almeno dieci campi all'ingrandimento di 40x dal setto interventricular di ogni cuore) e misurare la densità di zona Pecam-1 utilizzando il liberamente disponibile di software ImageJ ³¹. Utilizzare il colore deconvoluzione ³² plugin per DAB ed ematossilina e regolare il contrasto dell'immagine allo stesso livello.
   Nota: nel caso in cui il colore marrone e viola/blu hanno significativa sovrapposizione spettrale, che potrebbe causare difficoltà con deconvoluzione di colore, uno potrebbe provare diverse marche di soluzione di ematossilina di ottenere chiaro, azzurro di macchiatura nucleare. In alternativa, potrebbe essere eseguita immunofluorescenza o il conteggio manuale dei capillari.

Risultati

Nella Figura 1, rappresentante registrazioni ecocardiografiche dimostrano l'utilità di ecocardiografia per identificare fenotipi cardiaci in topi geneticamente modificati. La differenza tra un mouse con la normale funzione cardiaca (Figura 1A) e un animale con un ventricolo di sinistra dilatato e ridotta funzione di LV (Figura 1B) possa essere facilmente identificata. Figura 2

Discussione

Sono stati sviluppati diversi metodi per valutare la struttura cardiaca e funzione in topi, tra cui l'ecocardiografia, MRI contrapporre-aumentato, micro CT e scansione PET. Grazie alla sua economicità e semplicità, l'ecocardiografia è la tecnica più ampiamente usata per l'analisi funzionale in topi¹¹. In generale, a causa delle piccole dimensioni del cuore e l'alta frequenza della frequenza cardiaca nei topi, trasduttori con una frequenza > MHz 10 dovrebbe essere usato, anche se misure di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine	Life Technologies, Molecular Probes	W849
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vectorlabs	BA-1000
Avidin/Biotin Blocking Kit	Vectorlabs	SP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)	Vectorlabs	PK-6100
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vectorlabs	H-1200
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4168
Hydrogen peroxide solution	Sigma	H1009
Anti-Pecam-1 (CD31) antibody	Abcam	ab28364
Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100	Parker
Linear ultrasound probe, L15-7io	Philips Healthcare
Echocardiograph, IE33 xMATRIX	Philips Healthcare
Microscope, Leica DMi8	Leica
Fluorescence Filterset DAPI	Leica	11525304
Filterset TxR	Leica	11525310
Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider	Spot Imaging
Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software	Spot Imaging
Imaging Computer	Dell
Fine Scissors	Fine Science Tools	14028-10
Large Scissors	Fine Science Tools	14501-14
Scalpel blades	Fine Science Tools	10023-00
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11650-10
Rodent shaver	Harvard Apparatus	34-0243
cassettes for paraffin embedding	Sakura	4155F
neutral buffered Formalin	Sakura	8727
Xylene	Sakura	8733
Paraffine TEK III	Sakura	4511
automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP	Sakura	6032
paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5	Sakura	5229
microtome blades,Accu-Edge S35	Sakura	4685
microscopy slides, Tissue-Tek	Sakura	9533
cover slips, Tissue-Tek	Sakura	9582
Mounting medium Tissue-Tek	Sakura	1408
slide boxes	Sakura	3958
eosine solution	Sakura	8703
hematoxyline solution	Sakura	8711
microtome, RM2125RT	Leica	720-1880 (VWR)
water bath, Leica HI1210	Leica	720-0113(VWR)
Ethanol	VWR	ACRO444220050
15 ml tubes	VWR	734-0451
staining glass dish	VWR	MARI4220004
staining jars	VWR	MARI4200005
Incubator	Binder	9010-0012
DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets	Sigma	D4293
PBS (10X)	Thermo Fisher Scientific	70011044