Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo para la proyección de imagen en vivo de la retina de ratón con tomografía de coherencia óptica de alta resolución de dominio espectral (SD-OCT). Se centra en las células ganglionares de la retina (RGC) en la región de pepipapilar, con varios análisis y cuantificación de enfoques descritos.

Resumen

Cambios estructurales en la retina son manifestaciones comunes de enfermedades oftálmicas. Tomografía de coherencia óptica (OCT) que permite su identificación en vivo— rápidamente, repetidor y con una alta resolución. Este protocolo describe OCT la proyección de imagen en la retina de ratón como una poderosa herramienta para el estudio de neuropatías ópticas (OPN). El sistema de OCT es una alternativa no invasiva, basada en la interferometría a común análisis histológico post mortem . Proporciona una evaluación rápida y precisa del grueso retiniano, lo que permite la posibilidad de cambios, tales como adelgazamiento o engrosamiento retiniano. Presentamos el proceso de proyección de imagen y análisis con el ejemplo de la línea de ratón Opa1^delTTAG . Se proponen tres tipos de análisis, con dos métodos de cuantificación: calibradores estándar y caseros. Este último es mejor para el uso en la retina pepipapilar durante exploraciones radiales; siendo más precisos, es preferible para el análisis de las estructuras más finas. Todos los enfoques descritos aquí están diseñados para que las células ganglionares de la retina (RGC), pero son fácilmente adaptables a otras poblaciones de la célula. En conclusión, la OCT es eficiente en fenotipado de modelo ratón y tiene el potencial de ser utilizado para la evaluación confiable de las intervenciones terapéuticas.

Introducción

OCT es una herramienta de diagnóstico que facilita la examinación de estructuras retinianas¹, incluyendo la cabeza del nervio óptico (HNO). Con los años se ha convertido en un indicador confiable de la progresión de la enfermedad en los seres humanos^2,3, así como en roedores^4,5. Utiliza la interferometría para crear imágenes transversales de las capas retinales con una resolución axial de 2 μm. La capa más interna es la capa de fibras nerviosas retinianas (RNFL), que contiene axones RGC, que es seguida por la capa de células ganglionares (GCL), que contienen en su mayoría grave. El siguiente es la capa plexiforme interna (IPL), encuentro de dendritas RGC axones de células bipolares, horizontales y amacrinas. Éstos, junto con las células horizontales, forman la capa nuclear interna (INL), y sus salientes se conectan con axones de fotorreceptor en la capa plexiforme externa (OPL). Esto es seguido por la capa nuclear externa (ONL), con cuerpos de la célula del fotorreceptor y está separada de la capa del fotorreceptor por la membrana limitante externa (OLM), también llamada segmento segmento interno/externo (IS / OS) capa. Finalmente, las últimas capas observables en la retina de ratón son el epitelio retiniano del pigmento (RPE) y la coroides (C). El RNFL solo normalmente es demasiado fina para medirse en ratones; así, analizando la RNFL/GCL es preferible^4,5. Otra posibilidad es la capa compleja de GC, que contiene el último además de la IPL, lo que es más grueso y así aún más fácil medir en OCT explora⁴. En consecuencia, OCT permiten comprender mejor la situación patológica de la retina, como en OPNs.

Por otra parte, el espesor de la retina de ratón se analiza a menudo con la histología post mortem . Sin embargo, esta técnica enfrenta limitaciones relacionadas con la colección de tejidos, fijación, corte, coloración, montaje, etc. por lo tanto, algunos defectos, tales como cambios de espesor sutil, no pueden ser detectado. Por último, porque el mismo ratón no puede ser probado en tiempo varios puntos, el número de animales por estudiar mucho aumento, a diferencia de OCT. Todo, la no invasividad, alta resolución, posibilidad de repetición, control de tiempo en tiempo y facilidad de uso de la tecnología OCT hacen el método de elección en los estudios de la enfermedad retiniana.

Modelos de ratón se utilizan para identificar defectos del gene y para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes de retinopatías⁶. OPN es una forma de retinopatía con considerable daño al nervio óptico (en), que se compone de axones RGC aproximadamente 1,2 millones. OPN se puede centrar en el o puede ser secundaria a otros trastornos congénitos o no⁷, llevando a la pérdida de campo visual y más tarde, ceguera. Rasgos característicos de OPN son leve pérdida y daño, que pueden observarse en humano OCT RNFL y GCL adelgazamiento^2,3. Mientras tanto, la fisiopatología de la OPN es todavía mal entendida, y por lo tanto, permanece la necesidad de probar la retina de ratón.

Este manuscrito describe la proyección de imagen y cuantificación del espesor de la capa retiniana, usando el ejemplo del Opa1^delTTAG ratón línea^8,9, un modelo de la atrofia óptica dominante (DOA)¹⁰. Evaluar la patofisiología RGC, se cuantificaron exploraciones radiales, rectangulares y anulares. Esto fue hecha con pinzas estándar proporcionadas por el software de OCT o con una macro casera desarrollado para un programa de procesamiento de imágenes de código abierto. Las pinzas estándar son difíciles de manipular y a menudo más grueso que el RNFL/GCL, mientras que las pinzas caseras son más precisos, reproducibles y fáciles de usar. La macro realiza una medición de una capa automáticamente detectada, en 5 puntos y en posiciones fijas, en ambos lados del HNO en la región de pepipapilar. El objetivo del protocolo presentado es describir adquisición de exploración de OCT para especificar posición retiniana, con un enfoque en RGCs.

Protocolo

el protocolo experimental fue aprobado por el Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, Francia), es consistente con las directivas europeas y cumple con la declaración de ARVO para el uso de animales en investigación oftálmica. Se llevó a cabo bajo el acuerdo del Languedoc Rosellón Comité de ética en animales de experimentación (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).

1. configuración del equipo y preparación antes de la proyección de imagen

Nota: aquí, OCT fue realizada en la retina de ratón usando el sistema de proyección de imagen oftálmica de dominio espectral (SD) ( figura 1A). El aparato de la SD-OCT consiste en una base y un montaje de imágenes animal (AIM) con un escenario de alineación roedores (RAS) ( figura 1B). La base incluye la computadora, el motor de la OCT, la sonda de la SD-OCT y el objetivo específico de ratón. La sonda está montada en el objetivo, que incluye el Z-traductor. El RAS se utiliza para el posicionamiento gracias a la mesa con el traductor X y Y, el casete que puede girar y girar, de ratón y la barra de mordedura desprendible con la banda de la nariz. El software proporcionado por el fabricante permite la adquisición y análisis de archivos de la OCT, aunque este último también se puede hacer con un programa de procesamiento de imagen de la abrir-fuente.

1. Firmemente Coloque la sonda en el objetivo.
2. Conectar el objetivo específico de ratón a la sonda.
3. Ajustar el brazo de referencia para el objetivo específico (aquí, poder en 086 y posición en el 964).
4. Asegurándose que el ratón específico de la lente es lo suficientemente distante del cassette, fijar la barra de mordedura con la banda de la nariz en la cinta de.
   Nota: La distancia entre la lente y el casete puede ajustarse con el tornillo Z-traductor, situado en la parte posterior del objetivo. La venda de la nariz es una venda de elástico disponible en el mercado, y su tensión se debe ajustar dependiendo del tamaño del ratón.
5. Encender la fuente de alimentación (esquina inferior derecha de la cesta) y luego el ordenador.
6. Para poner en marcha el programa de imagen, haga doble clic en el acceso directo correspondiente en la pantalla.
   Nota: Esto depende del tipo de lente; aquí, ratón Retina.
7. Crea un nuevo estudio clínico y agrega los protocolos deseados. De lo contrario, utilice el estudio clínico existente ni protocolos.
   1. Agregar un nuevo estudio eligiendo la " estudio NameŔ " IDŔ " especificaciones del brazo de tratamiento " (aquí, " Uncategorized "); y predefinidos " protocolos de exploración ", si existen.
8. Elegir un " forense " en la " estudio clínico " sección.
   Nota: para un nuevo " examinador ", ir a " Setup examinadores & médicos " para definir lo
Sección
9. Agregar un nuevo paciente en el examen de paciente por haga clic en agregar paciente, entrando en el " ID ", " nombre ", " Apellido ", " sexo ", y " fecha de nacimiento " (opcional).
   Nota: Hacer esto justo antes de probar cada ratón, si es más conveniente. Asegúrese de que el ID es no más de 10 caracteres. Para el ratón, el error refractivo de ambos ojos es 0 y la longitud axial es 23.0.
10. Haga clic en " examen agregar " y seleccione el deseado " protocolo " agregando " Preset analiza " de la lista, empezando con el ojo que se medirá en primer lugar (aquí, el ojo derecho), o mediante la personalización de las exploraciones de.
11. Para personalizar un análisis, utilizar un escaneo existente como una plantilla y editarla o crear desde cero a través de la " Añadir Custom Scan " opción. Después de agregar todas las exploraciones a la lista, definir un nuevo protocolo que usa la " Enter " nuevo nombre protocolo " opción (OS: oculus ojo siniestro, izquierdo; OD: oculus dexter, derecho de ojo).
    Nota: Aquí, el protocolo consiste en tres análisis: (i) una exploración radial, con un diámetro de 1.4 mm, desplazamientos horizontales y verticales de 0 mm, 1.000 líneas de A-exploraciones/B-scan, B 100, exploraciones y volumen, 1 marco/B-scan, 80 líneas de inactivo A exploraciones/B-scan, volumen 1; (ii) una exploración rectangular, con una longitud de 1,4 mm y ancho, ángulo de 0°, 0 mm desplazamientos horizontales y verticales, 1.000 líneas de A-exploraciones/B-scan, B-100 Scan, 1 marco/B-scan, 80 líneas de inactivo A exploraciones/B-scan, volumen 1; y (iii) un anular, con 0.4 mm mínimo y 0.6 mm diámetro máximo, desplazamientos horizontales y verticales de 0 mm, 1.000 líneas de A-exploraciones/B-scan, B-análisis/volumen 3, 48 Marcos/B-scan, 80 líneas de inactivo A exploraciones/B-scan, volumen 1.

2. Preparación de mouse

1. inmovilización y la dilatación del ojo
   1. por lo menos 15 min antes de adquisición de datos, instilar gotas de fenilefrina 10% en los ojos de ratón, retirar el exceso y tropicamida 0.5% gotas.
      Nota: La primera dilatación se puede hacer a la vez para todos los ratones que se probará en la sesión. Asegúrese de que los líquidos están a temperatura ambiente.
   2. Inmediatamente después induce anestesia general (paso 2.2), administrar 0,4% oxybuprocaine clorhidrato gotas, mantener en lugar de 3 s para anestesiar e inmovilizar los ojos. Luego, limpie las gotas y repetir la instilación de tropicamida fenilefrina y el 0.5% de 10% para comprobar que los ojos se dilatan bien.
      Nota: Asegúrese de que los líquidos están a temperatura ambiente y que el ratón no se traguen el oxybuprocaine.
2. Anestesia general
   1. preparar una solución anestésica de ketamina (20 mg/mL) y xilacina (1,17 mg/mL) en solución salina. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
   2. Unos 5 min antes de la prueba, inyectar por vía intraperitoneal 5-10 μl de la solución anestésica por 1 g de masa corporal, dependiendo de la edad y el tamaño del ratón.
      Nota: Jóvenes o ratones delgados necesidad menos anestesia, toma menos tiempo para anestesiar, pero también despertar más rápido. Aquí, 8 μl/g (160 mg/kg de ketamina, 9,33 mg/kg de xilacina).
   3. Opcionalmente lubricar los ojos con gotas viscosas o un gel oftálmico para evitar la sequedad corneal.

3. Posicionamiento de ratón

1. lubricar los ojos con ojos viscosos basados en glicol de gotas para proporcionar hidratación corneal.
   Nota: Si los ojos parecen secos durante el examen, vuelva a aplicar las gotas de ojo.
2. Envolver el ratón en una hoja de Gasa quirúrgica para mantener caliente.
3. Usando una mecha de esponja o un algodón, aplicar una fina capa de un gel oftálmico con hipromelosa 0,3% en cada ojo, para minimizar la refracción de la luz, evitar opacidad y segura hidratación corneal. Al hacerlo, mover las pestañas y los bigotes a un lado.
4. Coloque el ratón en el cassette, con el cabeza hacia adelante recta y señalando.
5. Suavemente Abra la abrazadera de la barra de mordedura y coloque la barra en la boca, use la banda de la nariz para asegurar la posición.
   Nota: Asegúrese de que la barra de mordedura está en el centro el cartucho de.
6. Lugar un algodón rodar debajo de la derecha (izquierda) si se está probando el ojo derecho (izquierdo).
7. Manteniendo la punta con el objetivo con clip en el objetivo específico de ratón, llevarlo hacia el ojo girando el tornillo Z-traductor izquierdo.
8. Por rotación y girar el cassette y girando la barra de mordedura y los tornillos X-traductor, ajuste la posición del ratón, el objetivo es tener la mirada ojo derecho directamente en la lente y así alinear los ejes ópticos de los ojos y la lente.
   Nota: Si el ratón es demasiado alta o demasiado baja, el tornillo Y traductor debe usarse primero.
9. Elegir la primera exploración en la " examen ", haga clic en " con el objetivo de empezar a " y hacer cualquier ajuste adicional manual para la proyección de imagen retiniana.
   1. Con el tornillo Z-traductor, mover la retina verticalmente en el panel de la izquierda ( figura 2, alineación Horizontal B-scan) y horizontalmente en la rpanel de abajo ( figura 2, la alineación Vertical de B-scan).
   2. Gire el cassette para el HNO en el panel de la derecha moviendo el HNO hacia arriba o hacia abajo. Use el tornillo de la barra de mordedura para enderezar la retina en el panel derecho. Girar el cassette para el HNO en el panel de la izquierda.
   3. Utilice el tornillo X-traductor a nivel de la retina en el panel izquierdo. Más teniendo en cuenta la función principal de cada modulador, ajustar la posición de la retina para centralizar el Hno.
      Nota: Utilice el tornillo Y traductor para mover el HNO arriba y abajo en el panel derecho, si es necesario. La posición puede ser refinada en cualquier momento entre exploraciones.

4. SD-OCT la proyección de imagen del HNO y Retina

1. una vez que contenido con los ajustes, haga clic en " instantánea de inicio " para empezar a escanear la SD-OCT.
   1. Si la proyección de una imagen 3D no es necesaria, desactive la opción OCU.
2. Guardar la exploración y el informe.
3. Continuar con el análisis siguiente.
4. Para el segundo ojo de la imagen, después de retraer el lente, gire el cartucho de forma y repetir pasos 3.6-4.3.

5. Terminación de adquisición

1. cuando es completa la adquisición, quitar el mouse del cassette, aplicar gel oftálmico con hipromelosa 0,3% para cada ojo y coloque el mouse sobre una placa de calefacción para arriba
2. Después de la última adquisición, cierre el programa y apague el ordenador y la máquina de OCT (botón de suministro de energía).
3. Limpiar el casete con desinfectante.

6. Análisis

1. para la medición de espesor de la capa retiniana, utilice el software de segmentación automatizada proporcionado por el fabricante.
   1. Haga clic en el " paciente ", elija el deseado " examen " desde entonces la lista y haga clic en el " de examen " opción.
   2. Cargar los datos deseados de OCT en el software OCT haciendo clic derecho en el icono de la carpeta de exploración deseada.
   3. Derecho haga clic en el B-scan; configurar las pinzas permitiendo hasta 10 medición Calibradores; y escriba sus nombres, ángulos y colores.
   4. Elegir el calibre deseado haciendo un clic derecho en el B-scan; lugar por consiguiente a la retina para la medición de.
      Nota: Para el análisis centrados en el HNO, establecer 5 pinzas en cada lado de ella, equidistantes unos de otros. Para el análisis de pepipapilar, asegúrese de que la pinza no esté demasiado lejos del Hno. Para el escaneo radial, analizar 10 imágenes por exploración que fueron elegidos por el software de OCT. Su número puede encontrarse en la " informes " carpeta.
   5. Guardar los resultados para el análisis en un programa de hoja de cálculo haciendo clic en el B-scan y haga clic en " guardar los resultados de ".
      Nota: Los resultados pueden encontrarse en la misma carpeta como el análisis de datos.
2. Alternativamente, utilice la macro calibrador casero, " MRI Retina herramienta ", desarrollado para un programa de procesamiento de imágenes de código abierto (véase la tabla de materiales).
   1. Asegúrese de que el " MRI Retina herramienta " y la " modificar polígono sección herramienta " macros están activas. Cargar la imagen. Haga clic en el botón m para iniciar la medición.
      Nota: La macro crea automáticamente un 0,2 mm de longitud medición de cinta a ambos lados del Hno. Cada cassette contiene 5 puntos de medición que funcionan como pinzas. Su posición lateral es inmutable y modificado para requisitos particulares para la peripapilla en las exploraciones radiales. La posición horizontal de las cintas está predefinida para medir el grosor de la RNFL/GCL, pero es fácilmente modificable para medir la capa compleja de la GC en su lugar. Si la calidad del escaneo es pobre, la posición horizontal debe ajustarse o la imagen debe ser excluidos del análisis.
   2. Para ajuste horizontal, haga clic en el botón e. En el recién inaugurado " ROI Manager " ventana, elija el primer cassette.
   3. En el polígono azul, haga clic en el botón y ajuste la posición del primer cassette haciendo clic en los bordes de la capa, medido en la imagen.
   4. Repetir para el segundo cassette de primera elección en la " ROI Manager " ventana y luego haciendo clic en la imagen correspondiente. Haga clic en el botón r para volver a medir. Ver los resultados en la " medidas " ventana.
      Nota: Los resultados pueden copiarse a un programa de hoja de cálculo en cualquier momento. Contienen los siguientes valores para el total, cassette izquierdo (l) y derecha cassette (r): Intden - densidad integrado en el cartucho; : Área de la medición en mm ²; Len: longitud de la pinza en el cassette, en mm; Significa: significa la intensidad de la señal dentro de la cinta; y enfermedades de transmisión sexual: error estándar de la media intensidad de la señal de.
   5. Proceder con la siguiente imagen.
   6. Más analiza los datos en un programa de hoja de cálculo.
      Nota: Para encontrar el espesor promedio de la capa, tomar el Len de diez valores.

Resultados

La tecnología de la SD-OCT permite imaginar retiniana y análisis de espesor que es comparable a la histología, pero es más rápida y más detallada (figura 3). Tal como se presenta con los ratones de tipo salvaje C57Bl/6, aunque la calidad de una exploración de la SD-OCT (Figura 3A, derecha) no es tan buena como la de una imagen de sección retiniana (Figura 3A, izquierda), visualiza más capas ...

Discusión

El sistema OCT, un no-invasivo en vivo imagen método, proporciona alta resolución exploraciones de Cruz-section-como retinales. Por lo tanto, su principal ventaja es su potencial para un análisis detallado, con la maravillosa oportunidad de incorporar protocolos habitualmente aplicados a los seres humanos a modelos de ratón.

En el ejemplo de Opa1^delTTAG ratones mutantes, SD-OCT resultados mostraron un aumento de espesor de capa compleja de RNFL y GC, que permit...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA	-	Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	Protection against hypothermia
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Nose Band	-	-	Elastic band
Gauze pads 3"x3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Mouse positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France	ROM001	General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0,9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hydration of eyes
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectant