Optik Koherens tomografi: Fare retina Ganglion hücreleri Vivo içinde görüntüleme

Özet

Bu el yazması ile yüksek çözünürlüklü spektral etki alanı optik Koherens tomografi (SD-Ekim) fare retinanın vivo içinde görüntüleme için bir protokol açıklar. Retina ganglion hücrelerinin (RGC) peripapillary bölgede çeşitli tarama ve açıklanan yaklaşımlar miktarının üzerinde duruluyor.

Özet

Yapısal değişiklikler retina göz hastalıkları ortak belirtileri vardır. Optik Koherens tomografi (OCT) sağlar onların kimlik vivo içinde— hızlı, sürekli ve yüksek çözünürlükte. Bu iletişim kuralı fare retina OCT görüntülemede optik neuropathies (OPN) eğitim için güçlü bir araç olarak açıklar. OCT sistem ortak post mortem histolojik deneyleri Interferometry tabanlı, non-invaziv bir alternatiftir. Retina kalınlığı, retina incelme veya kalınlaşma gibi değişiklikleri, izleme imkanı sağlayan hızlı ve doğru bir değerlendirmesini sağlar. Biz Opa1^delTTAG fare çizgi örnekle görüntüleme işlemi ve analiz mevcut. İnceden inceye gözden geçirmek üç tür önerilen, iki miktar yöntemi ile: Standart ve ev yapımı Çap pergeli. İkinci Radyal taramalar sırasında peripapillary retina üzerinde kullanım için en iyisidir; daha kesin olarak, ince yapıları analiz etmek için tercih edilir. Burada açıklanan tüm yaklaşımlar retina ganglion hücrelerinin (RGC) için tasarlanmış ama diğer hücre popülasyonlarının kolayca uyarlanabilir. Sonuç olarak, OCT fare modeli fenotipleme etkilidir ve tedavi müdahaleler güvenilir değerlendirme için kullanılacak potansiyeline sahiptir.

Giriş

OCT retina yapıları¹optik sinir başı (ONH) de dahil olmak üzere, incelenmesi kolaylaştıran bir tanı aracıdır. Yıllar boyunca bu hastalık progresyon insanlar^2,3, hem de kemirgen^4,5güvenilir bir göstergesi haline gelmiştir. 2-µm Aksiyel çözünürlükte retina katmanları kesitsel görüntüler oluşturmak için Interferometry kullanır. Çoğunlukla RGC organları içeren ganglion hücre katmanı tarafından (un), takip RGC akson, içeren retina Sinir lifi Katmanı (RNFL), en içteki katmanıdır. Sonraki iç Pleksiform tabaka (IPL), RGC dendrites İki kutuplu, yatay ve amacrine hücre aksonlar buluştuğu olduğunu. Bunlar, yatay hücresi ile birlikte iç nükleer tabaka (INL) formu, ve onların çıkıntılar photoreceptor akson dış Pleksiform tabaka (OPL) içinde bağlantı. Bu photoreceptor hücre organları ile dış nükleer tabaka (yalnız), arkasından ve photoreceptor katmandan iç segment/dış kesimi olarak da adlandırılan dış sınırlayıcı membran tarafından (OLM), ayrılmış (IS / OS) katmanı. Son olarak, son gözlemlenebilir katmanlar halinde fare retina retina pigment epiteli (RPE) ve (C) koroid vardır. Yalnız RNFL normal farelerde ölçülecek çok ince; Böylece, RNFL/un analiz yerine tercih^4,5' tir. Başka bir olasılık ikinci IPL ek olarak içeren GC karmaşık katmanı, kalın ve böylece daha kolay hale OCT üzerinde ölçmek için⁴tarar. Sonuç olarak, OCT içinde OPNs gibi retina, patolojik durumunu içgörü sağlayabilir.

Alternatif olarak, fare retina kalınlığı genellikle post mortem Histoloji ile analiz edilir. Ancak, bu tekniği yüzler sınırlamalar doku koleksiyonu, fiksasyon, kesme, Boyama, montaj, vb dolayısıyla, ince kalınlık değişiklikler gibi bazı kusurları ile ilgili tespit edilemez. Son olarak, çünkü aynı fare, birkaç zaman sınanamıyor puan, hayvan sayısı büyük ölçüde artar, aksine OCT için çalışma. Sonuçta, yineleme için invasiveness olmayan, yüksek çözünürlüklü, olasılık, zaman zaman ve rahatlık-in kullanma OCT teknoloji izleme yapmak yönteminin seçimi retina hastalığı çalışmalarda.

Fare modelleri gen hataları tanımlamak ve moleküler mekanizmaları retinopathies⁶temel aydınlatmak için kullanılır. OPN bir Optik siniri önemli hasar ile retinopati (açık), yaklaşık 1.2 milyon RGC akson yapıldığı şeklidir. OPN ON odaklı veya görme alanı kaybı ve daha sonra körlük önde gelen diğer bozuklukları, doğuştan veya değil⁷, ikincil olabilir. RGC kaybı OPN karakteristik özellikleri vardır ve hasar, hangi insan Ekim RNFL ve^2,3inceltme un görülebilir. Bu arada, OPN Patofizyoloji hala kötü anlaşılmaktadır ve dolayısıyla fare retina test gerek kalır.

Bu el yazması görüntüleme ve retina tabakası kalınlığı, Opa1^delTTAG fare çizgi^8,9, baskın optik Atrofi (DOA)¹⁰modeli örneği kullanarak miktar açıklanmaktadır. RGC patofizyolojisi değerlendirmek için Radyal, dikdörtgen ve Anüler taramalar sayısal. Bu standart kaliperler OCT yazılım tarafından sağlanan veya bir açık kaynak görüntü işleme programı için geliştirilmiş bir ev yapımı makro ile yapıldı. Standart Çap pergeli işlemek zor ve kez daha kalın RNFL/un, daha kolay, tekrarlanabilir ve daha kesin ev yapımı Kumpasları iken. Makroyu otomatik olarak algılanan bir katman, 5 puan ve peripapillary bölgesinde ONH her iki tarafında sabit pozisyonlarda için bir ölçüm yapar. OCT tarama edinme retina konumlandırma RGCs odaklanarak belirtmek için açıklamak için sunulan Protokolü hedefidir.

Protokol

deneysel protokol Institut national de la santé tarafından kabul edildi et de la recherche médicale (INSERM; Montpellier, Fransa), Avrupa direktifleri ile tutarlıdır ve ARVO deyimiyle oftalmik araştırma hayvanlarda kullanım için uygundur. Etik Languedoc Roussillon nezaket içinde hayvan deneme (CEEALR; nuCEEA-LR-12123) sözleşme uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1. ekipman kurulumu ve öncesi görüntüleme hazırlık

Not: Burada, OCT spektral etki alanı (SD) oftalmik görüntüleme sistemi ( şekil 1A) kullanarak fare retina üzerinde gerçekleştirildi. SD-Ekim aparatı bir üs ve bir hayvan görüntüleme Dağı (AIM) olan bir kemirgen hizalama sahne (RAS) ( şekil 1B) oluşur. Bankası bilgisayar OCT motoru, SD-Ekim sonda ve fare özgü lens içerir. Sonda Z-çevirmen içerir amacı monte edilir. RAS fare ile X - ve Y-çevirmen, tablo sayesinde döndürülmüş ve swiveled, kaset konumlandırma ve burun bandı olan çıkarılabilir ısırık çubuk için kullanılır. İkincisi de bir açık kaynak görüntü işleme programı ile yapılabilir, ancak üreticisi tarafından sağlanan yazılımı toplama ve analizi OCT dosyaların için sağlar.

1. Sıkıca sonda AIM yerleştirin.
2. Fare özgü lens için sonda bağlayın.
3. Belirli objektifi (burada, 086 güç ve 964 konumunda) başvuru kol ayarlarını.
4. Yapma fare özel lens emin yeterince uzak kaset, burun bandı kaset üzerine olan ısırık çubuk eklemek.
   Not: Objektif ve kaset arasındaki mesafe amaç arka tarafında bulunan Z-çevirmen vida ile ayarlanabilir. Piyasada bulunan bir elastik bant burun grubudur ve onun gerginlik fare boyutuna bağlı olarak ayarlanması gereken.
5. Güç kaynağı (sağ alt köşesinde sepeti) ve sonra bilgisayarı açın.
Görüntüleme programını başlatmak için
6. çift tıklatın üstünde üstünde belgili tanımlık perde uygun kısa.
   Not: Bu objektif türüne bağlıdır; Burada, fare Retina.
7. Yeni bir klinik çalışma oluşturun ve istenen iletişim kuralları ekleyin. Aksi takdirde, mevcut klinik çalışma ve/veya iletişim kuralları kullanın.
   1. Seçerek yeni bir çalışma eklemek " eğitim NameŔ " IDŔ " tedavi kol özellikleri " (burada, " Uncategorized "); ve önceden tanımlanmış " protokolleri tarama ", varsa.
8. Seç bir " adli " içinde " klinik çalışmada " bölüm.
   Not: için yeni bir " sınav " gidin, " Kur sınav & doktorlar " onu tanımlamak için
9. Ekle yeni bir hasta hasta/sınav içinde bölüm yanında tıkırtı üstünde eklemek hasta; girme " numarası ", " adı ", " soyadı ", " seks ", ve " Doğum tarihi " (isteğe bağlı).
   Not: sadece her fare test etmeden önce daha uygun, bunu. Kimliği 10 karakter uzunluğunda olduğundan emin olun. Fare için her iki gözde için refraktif hata 0, Aksiyel uzunluğu 23.0.
10. Tıklayın " eklemek sınavı " ve istenen seçin " protokol " ekleyerek " önceden inceden inceye gözden geçirmek " listesi (burada, sağ gözü) ilk ölçülecektir göz ile başlayan veya taramalar özelleştirerek.
11. Bir tarama özelleştirmek için bir şablon olarak varolan bir tarama kullanmak ve düzenlemek veya sıfırdan oluşturmak " özel tarama Ekle " seçeneği. Tüm taramalar listesine ekledikten sonra yeni bir iletişim kuralını kullanarak tanımlamak " Enter " yeni iletişim kuralı adı " seçeneği (OS: yuvarlak pencere uğursuz, sol göz; OD: yuvarlak pencere dexter, değil göz).
    Not: Burada, protokol üç tarar içerir.: (i) bir Radyal inceden inceye gözden geçirmek, 1.4 mm çapında, 0 mm yatay ve düşey uzaklıklar, 1.000 satırlık A-taramalar/B-Tara, B-taramalar/hacim 100, 1 kare/B-Tara, etkin olmayan A-taramalar/B-tarama 80 satır ve 1 birim; (ii) bir dikdörtgen tarama, 1.4 mm Uzunluk ve genişlik, 0° açı, 0 mm yatay ve düşey uzaklıklar, A-taramalar/B-Tara, 100 B-inceden inceye gözden geçirmek, 1 kare/B-Tara, etkin olmayan A-taramalar/B-tarama 80 satır ve 1 birim 1.000 satırlık; ve (iii) bir annüler inceden inceye gözden geçirmek, 0,4 mm minimum ve 0,6 mm maksimum çapı, 0 mm yatay ve düşey uzaklıklar, A-taramalar/B-Tara, B-taramalar/Cilt 3, 48 çerçeveler/B-Tara, etkin olmayan A-taramalar/B-tarama 80 satır ve 1 birim 1.000 satırlık.

2. Fare hazırlık

1. göz dilatasyon ve immobilizasyon
   1. en az 15 dk önce veri toplama, fare gözlerinin içine % 10 phenylephrine göz damlası aşılamak, aşırı kaldırmak ve % 0.5 tropicamide göz damlası aşılamak.
      Not: İlk dilatasyon aynı anda oturum sırasında test tüm fareler için yapılabilir. Sıvı oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
   2. Hemen sonra ikna genel anestezi (Adım 2.2), %0,4 oxybuprocaine hidroklorid göz damlası, 3 için yerinde tutarak yönetmek anestezi ve gözleri hareketsiz için s. Daha sonra damla silin ve gözleri de genişlemiş tespit etmek için %10 phenylephrine ve % 0.5 tropicamide korumak yineleyin.
      Not: sıvıların oda sıcaklığında ve fare oxybuprocaine yutmak değil emin olun.
2. Genel anestezi
   1. ketamin (20 mg/mL) ve xylazine (1.17 mg/mL) anestezik bir çözüm salin hazır olun. En fazla 2 hafta 4 ° C'de mağaza.
   2. Test önce yaklaşık 5 dk intraperitoneally enjekte anestezik çözüm vücut kitle, yaş ve fare boyutunu bağlı olarak 1 gram başına 5-10 µL.
      Not: Genç ve/veya ince fareler ihtiyacı daha az anestezik, çekim daha az zaman anestezi, ama aynı zamanda daha hızlı uyandırmak için. Burada, 8 µL/g (160 mg/kg ketamin bas, xylazine 9.33 mg/kg).
   3. İsteğe bağlı olarak, yapışkan göz damlası veya kornea kuruluğu önlemek için oftalmik bir jel gözlerle yağlamak.

3. Fare konumlandırmasını

1. viskoz glikol tabanlı göz gözlerle damla kornea hidrasyon sağlamak için Lubricate.
   Not: gözleri sınav sırasında kuru görünüyorsa, göz damlası yeniden uygulamak.
2. Fare sabıkası sıcak tutmak için cerrahi gazlı bez sarın.
3. Bir sünger veya pamuk fitil kullanmak oftalmik bir jel ile % 0.3 mellose her gözün üzerine ince bir tabaka uygulanır, ışık kırılma en aza indirmek için kaçının opaklıklar ve güvenli kornea hidrasyon. Bunu yaparken de, kirpik ve bıyık çekil.
4. Fareyi kasete, kafa düz ve işaretleme ileri ile konumlandırma.
5. Yavaşça ısırık bar kelepçe açın ve bar ağzına yerleştirin; sabitleyin için burun bandı kullanın.
   Not: ısırık bar kaset ortasında olduğundan emin olun.
6. Bir pamuk rulo doğru () sol altında sağ (sol) gözü test yer.
7. Klip hedefleyen ucunu fare özgü lens üzerinde tutarak, bu doğru göz Z-çevirmen vida saat yönünün tersine çevirerek getir.
8. Döndürme ve kaset yedirdikten ve çevirerek ısırık bar ve X-çevirmen vidalar, önceden belirlenen farenin konumunu; sağ gözü göz doğrudan objektif ve böylece için için hedeftir gözleri ve objektifin optik eksenleri Hizala.
   Not: fare çok yüksek veya çok düşük ise, Y-çevirmen vida ilk kullanılmalıdır.
9. İlk taramada seçin " sınav ", tıklayın " başlatmak amaçlayan " ve retina görüntüleme için daha fazla el ile ayarlamaları yapın.
   1. Z-çevirmen vidayı kullanarak hareket retina dikey olarak sol panelindeki ( 2 rakam, yatay B-tarama hizalama) ve yatay olarak rsağ panel ( 2 rakam, dikey B-tarama hizalama).
   2. ONH yukarı veya aşağı hareket ettirerek doğru kapı aynası ortasında ONH getirmek için kaset döndürün. Isırık bar vidalı sağ panosunda retina düzeltmek için kullanın. ONH sol panelin ortasında konumlandırmak için kaset dönebilen.
   3. X-çevirmen vida sol panelde retina düzeyi için kullanın. Her modülatör büyük fonksiyonu göz önünde bulundurarak daha da retina ONH merkezileştirmek için konumunu ayarlamak.
      Not: gerekirse, ONH yukarı ve aşağı sağ panelde taşımak için Y-çevirmen vida kullanın. Pozisyon taramalar arasında herhangi bir zamanda rafine olabilir.

4. SD-Ekim Imaging Retina ve ONH

1. ayarlamaları ile içerik sonra tıklayın " başlatmak anlık görüntü " SD-Ekim Taramaya başlamak için.
   1. Bir 3D görüntüleme gerekli değilse, Öcü seçeneğinin işaretini kaldırın.
2. Tarama ve raporu kaydetmek.
3. Sonraki taramaları ile ilerle.
4. İkinci göz görüntü için objektif geri çeker sonra kaset buna göre ve adımları 3.6-4.3 tekrarlayın.

5. Satın alma tamamlama

1. ne zaman satın alma tamamlandıktan, kaset fareden kaldırmak, oftalmik jel ile % 0.3 mellose her göz için geçerlidir ve yukarı uyandırmak ısıtma yüzeyi üzerinde fareyi getirin
2. Son satın alma sonra yazılımı kapatın ve bilgisayarı veya OCT Makinası (güç kaynağı button) kapatma.
3. Dezenfektan ile kaset temiz.

6. Analiz

1. retina tabakası kalınlığı ölçümü için üretici tarafından sağlanan otomatik bölümleme yazılımı kullanın.
   1. Tıklayın " hasta ", istenen seçin " sınav " dan sonra liste ve tıkırtı üstünde " bir daha gözden geçirme sınav " seçenek.
   2. İstenen tarama klasör simgesini sağ tıklatarak istediğiniz OCT verileri OCT yazılım üzerine yüklemek.
   3. Hemen üzerinde B-Tara'yı tıklatın; Kumpasları Çap pergeli; ölçme 10 etkinleştirerek yapılandırmak ve onların adları, açılar ve renkleri girin.
   4. İstenen gövde üzerinde B tarama; sağ tıklatarak seçtiğiniz yer o buna göre ölçüm için retina üzerine.
      Not: Bu, birbirlerinden eşit uzaklıkta her tarafında 5 Çap pergeli ONH üzerinde ortalanmış taramalar için ayarlayın. Peripapillary analiz için kumpas çok ileri ONH yerleştirilmedi emin olun. Radyal taramak için OCT yazılım tarafından seçilen 10 fotoğraf oranı analiz. Sayıları bulunabilir " raporları " klasörü.
   5. Kaydetmek sonuçları analiz için bir elektronik tablo yazılım programında B Ultrasonda sağ tıklatıp'i tıklatarak " sağlamaları ".
      Not: Sonuçları tarama veri ile aynı klasörde bulunabilir.
2. Alternatif olarak, ev yapımı Kaliper makroyu kullanmak " Mr Retina aracı ", bir açık kaynak görüntü işleme programı için Gelişmiş (malzemeleri tablo görmek).
   1. Emin olun " Mr Retina aracı " ve " çokgen bölüm aracı değiştirmek " makroları etkin. Resim yükleyin. Ölçüm başlatmak için m düğmesini tıklayın.
      Not: Makroyu otomatik olarak bir 0.2 mm uzunluğundaki oluşturur kaset ONH her iki tarafında ölçme. Her kaset 5 ölçüm noktaları Kumpasları bu işlevi içerir. Yanal konumlarını değiştirilemez ve peripapilla Radyal taramaları için özelleştirilmiş. Kasetleri yatay konumunu RNFL/un kalınlığını ölçmek için önceden, ancak bunun yerine GC karmaşık katman ölçmek için kolayca değiştirilebilir. Tarama kalitesi kötüdür, yatay konumu ayarlanması gerekiyor veya resmi analizinden dışlanmaları gerekir.
   2. Yatay ayarlama için e butonuna tıklayın. Yeni açılan " ROI Yöneticisi " pencere, ilk kaset seçin.
   3. 'I tıklatın mavi çokgen düğmesini tıklatın ve resim ölçülen katman sınırları tıklayarak ilk kaset konumunu ayarlamak.
   İlk içinde seçerek
   4. tekrar için ikinci kaset " ROI Yöneticisi " pencere ve o zaman tıkırtı üstünde uygun imge. R çubuğunda yeniden ölçmek için. Sonuçlarda görüntülemek " ölçümleri " penceresi.
      Not: Sonuçları herhangi bir zamanda bir elektronik yazılım programı kopyalanabilir. Onlar doğru kaset (r), sol kaset (l) ve toplam için aşağıdaki değerleri içerir: Intden - entegre yoğunluk içinde kaset; : Alanı mm ² ölçü; Len: kasete mm içinde gövde uzunluğu; Anlamına: demek kaset içinde sinyal yoğunluğu; ve Std: sinyalin ortalama yoğunluğunun standart hata.
   5. Sonraki görüntü ile ilerle.
   6. Daha fazla analiz verileri bir elektronik yazılım programı.
      Not: katman ortalama kalınlığı bulmak için on Len değerler alır.

Sonuçlar

SD-Ekim teknoloji retina hayal ve histoloji için benzer, ancak daha hızlı kalınlığı analizi ve daha ayrıntılı (şekil 3) sağlar. Wildtype C57Bl/6 fare ile düz-se bile bir SD-Ekim tarama kalitesini sunulan (şekil 3A, sağ) iyi olarak retina enine kesit (şekil 3A, sol) bir görüntü değil, daha fazla katman (Örneğin, OLM) görüntüler. Ayrıca, bu sadece yaklaşık 40 gün v...

Tartışmalar

OCT sistemi, görüntüleme yöntemi, bir non-invaziv vivo içinde yüksek çözünürlüklü retina çapraz section gibi tarama sağlar. Böylece, başlıca avantajı insanlar fare modelleri için rutin olarak uygulanan protokoller aktarılması için harika bir fırsat ile detaylı analiz için potansiyel var.

Örneğin Opa1^delTTAG mutasyona uğramış fareler, SD-Ekim DOA patofizyolojisi⁹yeni keşifler için izin RNFL ve GC karmaşık tab...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA	-	Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	Protection against hypothermia
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Nose Band	-	-	Elastic band
Gauze pads 3" x 3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Mouse positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France	ROM001	General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0.9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hydration of eyes
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectant