Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole pour l’imagerie in vivo de la rétine de souris avec tomographie à cohérence optique haute résolution de domaine spectral (SD-OCT). Il se concentre sur les cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) dans la région péripapillaire, avec plusieurs de numérisation et de quantifier les approches décrites.

Résumé

Des changements structurels dans la rétine sont des manifestations fréquentes de maladies ophtalmiques. Tomographie par cohérence optique (OCT) permet leur identification en vivo— rapidement, répétitive et en haute résolution. Ce protocole décrit l’imagerie OCT dans la rétine de souris comme un outil puissant pour étudier les neuropathies optiques (OPN). Le système OCT est une alternative non invasive, basée sur l’interférométrie à commune analyses histologiques post-mortem . Il fournit une évaluation rapide et précise de l’épaisseur rétinienne, prévoyant la possibilité de suivre les changements, tels que la rétine amincissement ou épaississement. Nous présentons le processus et l’analyse d’imagerie avec l’exemple de la lignée de souris^delTTAG Opa1. Trois types d’analyses sont proposées, avec deux méthodes de quantification : étriers standards et faits maison. Ce dernier est préférable pour une utilisation sur la rétine péripapillaire lors des balayages radiaux ; être plus précis, est préférable pour l’analyse des structures plus fines. Toutes les approches décrites ici sont conçues pour des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) mais sont facilement adaptables à d’autres populations cellulaires. En conclusion, l’OCT est efficace pour le phénotypage de modèle de souris et a le potentiel d’être utilisé pour l’évaluation fiable des interventions thérapeutiques.

Introduction

OCT est un outil de diagnostic qui facilite l’examen des structures rétiniennes¹, y compris la tête du nerf optique (ONH). Au fil des ans, il est devenu un indicateur fiable de la progression de la maladie chez les humains^2,3, ainsi que dans les rongeurs^4,5. Il utilise l’interférométrie pour créer des images en coupe transversale des couches de la rétiniens avec une résolution axiale de 2 µm. La couche la plus profonde est la fibres nerveuses rétiniennes de couche (CFNR), contenant des axones de la CJR, qui est suivie par la couche de cellules de ganglion (GCL), contenant pour la plupart des corps RGC. Ensuite est la couche plexiforme interne (IPL), confluent de dendrites RGC axones cellules bipolaires, horizontales et amacrines. Ceux-ci, ainsi que les cellules horizontales, forment la couche nucléaire interne (INL), et leurs saillies se connecter avec les axones des photorécepteurs dans la couche plexiforme externe (OPL). Ceci est suivi par la couche nucléaire externe (ONL), avec le corps des cellules photoréceptrices et est séparée de la couche des photorécepteurs de la membrane limitante externe (OLM), également appelée segment segment interne/externe (IS / OS) couche. Enfin, les dernières couches observables dans la rétine de souris sont l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) et la choroïde (C). La CFNR seul est normalement trop mince pour être mesurées chez la souris ; ainsi, analyser la CFNR/GCL est plutôt préférable de^4,5. Une autre possibilité est la couche complexe GC, qui contient en plus de l’IPL, rendant plus épais et donc encore plus facile à mesurer sur OCT scanne⁴. Par conséquent, OCT peut donnent un aperçu de l’état pathologique de la rétine, comme dans les foules.

Par ailleurs, l’épaisseur de la rétine de souris est souvent analysée avec histologie post-mortem . Cependant, cette technique visages limites de prélèvement tissulaire, fixation, coupe, coloration, montage, etc. donc, quelques défauts, tels que les changements subtils d’épaisseur, ne peuvent pas être détectés. Enfin, parce que la même souris ne peuvent pas être testée à temps plusieurs points, le nombre d’animaux par étude grandement augmente, à la différence pour OCT. Dans l’ensemble, la caractère non invasif, haute résolution, possibilité de répétition, suivi de temps en temps et facilité d’utilisation de la technologie OCT rendent la méthode de choix dans les études de la maladie de la rétine.

Modèles de souris sont utilisées pour identifier les défauts de gène et à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les rétinopathies⁶. OPN est une forme de rétinopathie avec d’importants dégâts au nerf optique (sur), qui est constitué des axones environ 1,2 millions de RGC. OPN peut se concentrer sur le ON ou peut être secondaire à d’autres troubles, innées ou pas⁷, conduisant à la perte du champ visuel et plus tard, la cécité. Les traits caractéristiques de l’OPN sont perte RGC et sur les dommages, qui peuvent être observés dans les PTOM humaine que CFNR et GCL amincissement^2,3. Pendant ce temps, la physiopathologie de l’OPN est encore mal comprise, et donc la nécessité de tester la rétine de souris reste.

Ce manuscrit décrit l’imagerie et la quantification de l’épaisseur de la couche rétinienne, à l’aide de l’exemple de la Opa1^delTTAG souris ligne^8,9, un modèle d’atrophie optique dominante (DOA)¹⁰. Pour évaluer la physiopathologie de la CJR, balayages radiaux, rectangulaires et annulaires ont été quantifiées. Cela a été fait avec étriers standards fournis par le logiciel OCT ou avec une macro maison mis au point un programme de traitement d’images open source. Les étriers standards sont difficiles à manipuler et souvent plus épais que la CFNR/GCL, tandis que les étriers de maison sont faciles à utiliser, reproductibles et plus précis. La macro effectue une mesure pour une couche automatiquement détectée, en 5 points et à des positions fixes, des deux côtés de l’ONH dans la région péripapillaire. Le protocole présenté vise à décrire l’acquisition scan OCT pour spécifier le positionnement rétinienne, en mettant l’accent sur les CGR.

Protocole

le protocole expérimental a été approuvé par l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm ; Montpellier, France), est conforme aux directives européennes et est conforme à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmologique. Elle a été menée en vertu de l’accord du Languedoc Roussillon courtoisie d’éthique en expérimentation animale (CEEALR ; nuCEEA-LR-12123).

1. matériel d’installation et préparation de l’imagerie pré

Remarque : ici, l’OCT a été réalisée sur la rétine de souris à l’aide du système d’imagerie ophtalmique domaine spectral (SD) ( Figure 1 a). L’appareil SD-OCT se compose d’une base et un montage d’imagerie animal (AIM), avec une étape de l’alignement de rongeurs (RAS) ( Figure 1 b). La base comprend l’ordinateur, le moteur de l’OCT, la sonde de SD-OCT et la lentille de souris spécifiques. La sonde est montée sur l’objectif, qui inclut le Z-traducteur. Le RAS est utilisé pour positionnement grâce à la table avec le X - et Y-traducteur, la cassette qui peut être pivotée et pivotée, la souris et la barre amovible morsure avec la muserolle. Le logiciel fourni par le fabricant permet l’acquisition et l’analyse des dossiers de l’OCT, bien que ce dernier peut également être fait avec un programme de traitement d’image libre.

1. Fermement de placer la sonde dans le but.
2. Connecter la lentille de souris spécifiques à la sonde.
3. Régler les bras référence à l’objectif spécifique (ici, le pouvoir au 086 et situation 964).
4. Faire en sorte que la souris spécifique objectif soit assez éloignée de la cassette, fixer la barre de morsure avec la muserolle sur la cassette.
   NOTE : La distance entre la lentille et la cassette peut être réglée avec la vis Z-traducteur, située à l’arrière de l’objectif. La muserolle est une bande élastique disponible dans le commerce, et sa tension doit être ajustée selon la taille de la souris.
5. Allumez l’alimentation (en bas à droite du chariot) et l’ordinateur.
6. Pour lancer le programme de formation image, double-cliquez sur le raccourci appropriées sur l’écran.
   Remarque : Cela dépend du type de lentille ; ici, la souris rétine.
7. Créer une nouvelle étude clinique et ajoute les protocoles souhaités. Sinon, utilisez l’étude clinique existante et/ou protocoles.
   1. Ajoute une nouvelle étude en choisissant la " étude NameŔ " IDŔ " spécifications de bras de traitement " (ici, " Uncategorized ") ; et prédéfinie " Scan des protocoles ", s’ils existent.
8. Choisir un " examinateur " dans la " étude clinique " section.
   Remarque : pour une nouvelle " examinateur ", allez dans " Setup examinateurs & médecins " de définir it.
9. Ajouter un nouveau Patient dans l’examen de Patient/section en cliquant sur Ajouter Patient ; entrant dans la " ID ", " nom ", " nom de famille ", " sexe ", et " date de naissance " (facultatif).
   Remarque : Le faire juste avant de tester chaque souris, si plus commode. Assurez-vous que l’ID n’est pas plu de 10 caractères. Pour la souris, l’erreur de réfraction pour les deux yeux est 0 et la longueur axiale 23,0.
10. Cliquez sur " ajouter examen " et sélectionner le " protocole " en ajoutant " Preset scanne " dans la liste, à partir de le œil qui se mesurera d’abord (ici, le œil droit), ou en personnalisant les scannes.
11. Pour personnaliser un balayage, utiliser une analyse de l’existante comme modèle et modifier ou créer de toutes pièces par le biais du " ajouter numérisation personnalisée " option. Après avoir ajouté tous les scans dans la liste, définir un nouveau protocole à l’aide de la " Enter " nouveau nom de protocole " option (OS : oculus sinister, gauche oeil ; OD : oculus dexter, juste le œil).
    NOTE : Ici, le protocole implique trois balayages : (i) une analyse radiale, avec un diamètre de 1,4 mm, décalages horizontaux et verticaux de 0 mm, 1 000 lignes de A-scans/B-scan, 100 B-scans/volume, 1 cadre/B-scan, 80 lignes d’inactif A-scans/B-scan et 1 volume ; (ii) un scan rectangulaire, avec une longueur de 1,4 mm et largeur, angle de 0°, 0 mm décalages horizontaux et verticaux, 1 000 lignes de A-scans/B-scan, 100 B-scans, 1 cadre/B-scan, 80 lignes d’inactif A-scans/B-scan et 1 volume ; et (iii) un annulaire scan, avec un diamètre maximal de 0,4 mm minimum et 0,6 mm, décalages horizontaux et verticaux de 0 mm, 1 000 lignes de 48 images/B-scan, 80 lignes d’inactif A-scans/B-scan et volume 1 A-scans/B-scan, 3 B-scans/volume,.

2. Préparation de souris

1. immobilisation et la dilatation de le œil
   1. au moins 15 min avant l’acquisition de données, instiller des gouttes phényléphrine 10 % dans les yeux de souris, enlevez le surplus et instiller les gouttes 0,5 % tropicamide.
      Remarque : La première dilatation peut s’effectuer en une seule fois pour toutes les souris qui seront testés dans la session. Assurez-vous que les liquides sont à température ambiante.
   2. Immédiatement après anesthésie générale induisant (étape 2.2), administrer 0,4 % oxybuprocaine chlorhydrate gouttes pour les yeux, garder en place pendant 3 s pour anesthésier et immobiliser les yeux. Ensuite, essuyez les gouttes et répétez l’instillation de tropicamide phényléphrine et 0,5 % de 10 % pour s’assurer que les yeux sont bien dilatées.
      NOTE : Assurez-vous que les liquides soient à température ambiante et que la souris ne pas avaler l’oxybuprocaine.
2. Anesthésie générale
   1. préparer une solution anesthésique de kétamine (20 mg/mL) et de xylazine (1,17 mg/mL) dans une solution saline. Conserver à 4 ° C pendant un maximum de 2 semaines.
   2. Environ 5 min avant l’essai, injecter par voie intrapéritonéale de 5 à 10 µL d’une solution anesthésique par 1 g de masse corporelle, selon l’âge et la taille de la souris.
      NOTE : Young et/ou souris mince besoin moins anesthésique, prendre moins de temps à anesthésier, mais également éveiller plus rapidement. Ici, 8 µL/g (160 mg/kg de kétamine, 9,33 mg/kg de xylazine).
   3. Éventuellement lubrifier les yeux avec des gouttes pour les yeux visqueux ou un gel ophtalmique pour éviter la sécheresse cornéenne.

3. Positionnement de la souris

1. lubrifier les yeux avec des yeux visqueux à base de glycol tombe à fournir hydratation cornéenne.
   Remarque : Si les yeux semblent secs pendant l’examen, ré-appliquer le collyre.
2. Envelopper la souris dans une feuille de gaze chirurgicale pour garder au chaud.
3. à l’aide d’une mèche de coton ou une éponge, appliquer une fine couche d’un gel ophtalmique avec 0,3 % hypromellose sur chaque œil, pour minimiser la réfraction de lumière, éviter les opacités et l’hydratation cornéenne sécurisée. Ce faisant, écarter les cils et les moustaches.
4. La position de la souris dans la cassette, avec la tête droite et pointage avant.
5. Doucement ouvrir la morsure bar pince et placez la barre dans la bouche ; utilisez la muserolle pour fixer la position.
   Remarque : Vérifiez que la barre de la morsure est au milieu de la cassette.
6. Place un coton rouler sous le côté droit (gauche) s’est mis à l’essai le œil droit (gauche).
7. Tout en gardant la pointe visée clipsable sur la lentille de souris spécifiques, apportez-le vers le œil en tournant la vis de Z-traducteur dans le sens antihoraire.
8. En tournant et pivotant de la cassette et en tournant la barre de la morsure et les vis de X-traducteur, réglé la position de la souris, le but est d’avoir le look oeil droit directement dans l’objectif et donc d’aligner les axes optiques des yeux et la lentille.
   Remarque : Si la souris est trop élevée ou trop basse, la vis Y-traducteur doit servir d’abord.
9. Choisir le premier scan dans le " examen ", cliquez sur " commencer visant " et faire des ajustements plus manuelles pour l’imagerie rétinienne.
   1. à l’aide de la vis de Z-traducteur, déplacer la rétine verticalement sur le panneau de gauche ( Figure 2, l’alignement Horizontal B-scan) et horizontalement sur le right panneau ( Figure 2, l’alignement Vertical B-scan).
   2. Tourner la cassette pour amener l’ONH au centre du panneau de droit en déplaçant l’ONH vers le haut ou vers le bas. Utiliser la vis de bar de morsure pour redresser la rétine sur le panneau de droite. Faire pivoter la cassette afin de positionner l’ONH au centre du panneau gauche.
   3. Utiliser la vis X-traducteur pour niveler la rétine sur le panneau de gauche. Gardant à l’esprit les principales fonctions de chaque modulateur, ajuster davantage la position de la rétine de centraliser l’ONH.
      Remarque : Utilisez la vis Y-traducteur à l’ONH monter et descendre sur le panneau de droite, si nécessaire. La position peut être raffinée à tout moment entre les balayages.

4. SD-OCT d’imagerie de l’ONH et la rétine

1. une fois content avec les réglages, cliquez sur " démarrage instantané " pour commencer la numérisation de SD-OCT.
   1. Si une imagerie 3D n’est pas nécessaire, décochez l’option OCU.
2. Enregistrer l’analyse et le rapport de.
3. Continuer avec les prochains scans.
4. Pour le deuxième œil de l’image, après le retrait de la lentille, mettez la cassette en conséquence et répétez les étapes 3,6 à 4,3.

5. Achèvement de l’acquisition

1. lorsque l’acquisition est terminée, retirez la souris de la cassette, appliquez le gel ophtalmique avec 0,3 % hypromellose à chaque œil et placez la souris sur une plaque chauffante à wake up.
2. Après la dernière acquisition, fermez le logiciel et éteignez l’ordinateur et la machine de l’OCT (bouton d’alimentation power).
3. Nettoyez la cassette avec désinfectant.

6. Analyse

1. pour la mesure de l’épaisseur de la couche rétinienne, utiliser le logiciel de segmentation automatique fourni par le fabricant.
   1. Cliquez sur le " Patient ", choisissez le désiré " examen " de la liste puis cliquez sur le " examen examen " option.
   2. Charger les données de OCT désirées sur le logiciel OCT en cliquant-droit sur l’icône de dossier dans la numérisation souhaitée.
   3. Clic droit sur le B-scan, configurer les étriers en permettant jusqu'à 10 mesure étriers ; et entrer leurs noms, les angles et les couleurs.
   4. Choisir le calibre désiré par un clic droit sur le B-scan ; Placez-le en conséquence sur la rétine pour mesure.
      Remarque : Pour les scans centrées sur l’ONH, définissez 5 étriers sur chaque côté de celui-ci, la même distance les uns des autres. Pour l’analyse péripapillaire, assurez-vous que l’étrier n’est pas placée trop loin de l’ONH. Pour la numérisation de la radiale, analyser les 10 photos par balayage qui ont été choisis par le logiciel d’OCT. Leur nombre se trouvent dans le " rapports " dossier.
   5. Enregistrer les résultats d’analyse dans un logiciel de feuille de calcul en cliquant à droite sur le B-scan en cliquant sur " enregistrer les résultats de ".
      Remarque : Les résultats se trouvent dans le même dossier que les données de scannage.
2. Vous pouvez également utiliser la macro maison étrier " MRI rétine outil ", développés pour un programme de traitement d’image open source (voir la Table des matières).
   1. S’assurer que le " outil de rétine MRI " et la " modifier l’outil Polygone Section " macros sont actifs. Charger l’image. Cliquez sur la touche m pour démarrer la mesure.
      Remarque : La macro crée automatiquement un 0,2 mm de long mesurant la cassette sur les deux côtés de l’ONH. Chaque cassette contient 5 points de mesure qui fonctionnent comme les étriers. Leur position latérale est immuable et est adaptée pour le peripapilla dans les scans radiales. La position horizontale des cassettes est prédéfinie pour mesurer l’épaisseur de la CFNR/GCL, mais il est facilement modifiable pour mesurer la couche complexe GC à la place. Si la qualité de numérisation est pauvre, la position horizontale doit être ajustée ou l’image doit être exclue de l’analyse.
   2. Pour le réglage horizontal, cliquez sur le bouton e. Dans le nouvellement ouvert " Gestionnaire de ROI " fenêtre, choisissez la première cassette.
   3. Cliquez sur le polygone bleu bouton et ajustez la position de la première cassette en cliquant sur les frontières de la couche déterminée dans l’image.
   4. Répétition pour la deuxième cassette de premier choix dans le " ROI Manager " fenêtre et puis en cliquant sur l’image appropriée. Cliquez sur le bouton r pour remesurer. Afficher les résultats dans les " mesures " fenêtre.
      Remarque : Les résultats peuvent être copiés vers un logiciel de feuille de calcul à tout moment. Ils contiennent les valeurs suivantes pour la cassette droite (r), cassette gauche (l) et au total : Intden - densité intégrée au sein de la cassette ; Zone : zone de la mesure en mm ² ; Len : longueur de la pince dans la cassette, en mm ; Moyenne : moyenne intensité du signal dans la cassette ; et Std : écart-type de l’intensité moyenne du signal de.
   5. Procéder à la prochaine image.
   6. Encore analyse les données dans un logiciel tableur.
      Remarque : Pour trouver l’épaisseur moyenne de la couche, prendre la Len dix valeurs.

Résultats

La technologie SD-OCT permet d’imaginer rétinienne et l’analyse d’épaisseur qui est comparable à l’histologie, mais est plus rapide et plus détaillée (Figure 3). Tel que présenté avec les souris C57Bl/6 type sauvage, même si la qualité d’une analyse de SD-OCT (Figure 3 a, droite) n’est pas aussi bonne que celle d’une image d’une coupe de rétine (Figure 3 a, à gauche), il vi...

Discussion

Le système de l’OCT, un non invasif en vivo méthode, d’imagerie fournit haute résolution scans rétiniens de cross-transversalement-comme. Ainsi, son principal avantage est la possibilité d’une analyse détaillée, avec l’occasion merveilleuse de transposer les protocoles couramment appliqués aux humains, aux modèles de souris.

Dans l’exemple de Opa1^delTTAG souris mutantes, SD-OCT résultats ont montré une augmentation de l’épaisseur de couche c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA	-	Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	Protection against hypothermia
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Nose Band	-	-	Elastic band
Gauze pads 3" x 3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Mouse positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France	ROM001	General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0.9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hydration of eyes
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectant