Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo para a imagem no vivo da retina do rato com a tomografia de coerência óptica de domínio espectral de alta resolução (SD-OCT). Centra-se em células ganglionares da retina (RGC) na região de peripapillary, com vários digitalização e quantificar as abordagens descritas.

Resumo

Mudanças estruturais na retina são manifestações comuns de doenças oftálmicas. Tomografia de coerência óptica (OCT) permite a sua identificação no vivo— rapidamente, repetidamente e em alta resolução. Este protocolo descreve imagens OCT na retina do rato como uma poderosa ferramenta para estudar a neuropatia óptica (OPN). O sistema OCT é uma alternativa não-invasiva, baseada em interferometria para comuns ensaios post-mortem histológica. Ele fornece uma avaliação rápida e precisa da espessura da retina, permitindo a possibilidade de controlar alterações, tais como afinamento da retina ou espessamento. Apresentamos o processo e a análise de imagem com o exemplo da linha de rato Opa1^delTTAG . Propõem-se três tipos de exames, com dois métodos de quantificação: pinças padrão e caseiras. O último é melhor para uso na retina peripapillary durante as varreduras radiais; sendo mais preciso, é preferível para a análise de estruturas mais finas. Todas as abordagens descritas aqui são projetadas para células ganglionares da retina (RGC), mas são facilmente adaptáveis para outras populações de células. Em conclusão, OCT é eficiente na fenotipagem de modelo de rato e tem potencial para ser usado para a avaliação confiável de intervenções terapêuticas.

Introdução

OCT é uma ferramenta de diagnóstico que facilita a análise das estruturas da retina¹, incluindo a cabeça do nervo ótico (HNO). Ao longo dos anos tornou-se um indicador confiável de progressão da doença em seres humanos^2,3, assim como em roedores^4,5. Ele usa interferometria para criar imagens transversais das camadas da retina em uma resolução axial de 2 µm. A camada mais interna é a retina da fibra do nervo camada (RNFL), contendo axônios RGC, que é seguida pela camada de células ganglionares (GCL), contendo principalmente RGC corpos. Em seguida é a camada plexiforme interna (IPL), onde se encontram dendrites RGC axônios de células bipolares, horizontais e amacrine. Estes, juntamente com células horizontais, formam a camada nuclear interna (INL), e suas saliências conectar com axônios fotoreceptoras na camada plexiforme externa (OPL). Isto é seguido por camada nuclear externa (ONL), com corpos de células fotorreceptoras e é separado da camada fotoreceptoras pela membrana limitante externa (Proteus), também chamada segmento segmento interior/exterior (IS / OS) camada. Finalmente, as últimas camadas observáveis na retina do rato são o epithelium retinal do pigment (RPE) e a coroide (C). O RNFL sozinho normalmente é fino demais para ser medido em ratos; assim, analisar o GCL/RNFL em vez disso é preferível^4,5. Outra possibilidade é a camada de complexo de GC, que contém o último além do IPL, tornando mais espesso e assim mesmo mais fácil medir na OCT verifica a⁴. Por conseguinte, OCT pode fornecer insights sobre o estado patológico da retina, tais como em OPNs.

Alternativamente, a espessura da retina do rato é frequentemente analisada com post-mortem de histologia. No entanto, esta técnica limitações de rostos relacionados com coleção de tecido, fixação, corte, coloração, montagem, etc. , portanto, alguns defeitos, tais como alterações de espessura sutil, não podem ser detectado. Finalmente, porque o mesmo mouse não pode ser testado no tempo vários pontos, o número de animais por estudar grandemente aumenta, ao contrário de TOC. Apesar de tudo, a não-invasividade, de alta resolução, possibilidade de repetição, monitoramento de tempo em tempo e facilidade de uso da tecnologia OCT fazem o método de escolha em estudos de doenças da retina.

Modelos de mouse são usados para identificar defeitos genéticos e elucidar os mecanismos moleculares subjacentes retinopatias⁶. OPN é uma forma de retinopatia com substanciais danos ao nervo óptico (no), que é composta de aproximadamente 1,2 milhões axônios RGC. OPN pode ser focado em ON ou pode ser secundário a outros transtornos, inatos ou não⁷, levando à perda do campo visual e, mais tarde, cegueira. Traços característicos do OPN são perda RGC e no dano, que pode ser observado em OCT humana como RNFL e GCL desbaste^2,3. Enquanto isso, a fisiopatologia do OPN é ainda mal compreendida, e, portanto, permanece a necessidade de testar as retinas do mouse.

Este manuscrito descreve a imagem e a quantificação da retina de espessura da camada, usando o exemplo do Opa1^delTTAG rato linha^8,9, um modelo de atrofia óptica dominante (DOA)¹⁰. Para avaliar a fisiopatologia RGC, radiais, anulares e retangulares exames foram quantificados. Isso foi feito com pinças padrão fornecidas pelo software OCT ou com uma macro caseira desenvolvido para um programa de processamento de imagem de código-fonte aberto. Os compassos de calibre padrão são difíceis de manipular e muitas vezes mais espessa que a RNFL/GCL, enquanto os calipers caseiros são fáceis de usar, reprodutível e mais precisos. A macro executa uma medição para uma camada automaticamente detectada, em 5 pontos e em posições fixas, nos dois lados do HNO na região peripapillary. O objetivo do protocolo apresentado é descrever a aquisição de varredura OCT para especificar o posicionamento da retina, com foco em RGCs.

Protocolo

o protocolo experimental foi aprovado pela Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, França), é consistente com as directivas europeias e está em conformidade com a instrução de ARVO para o uso de animais na investigação oftalmológica. Foi realizado no âmbito do acordo do Languedoc Roussillon cortesia de ética em Experimentação Animal (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).

1. instalação de equipamentos e preparação de pré-imagem

Nota: aqui, OCT realizou-se na retina do mouse usando o domínio espectral (SD) sistema de imagem oftálmica ( figura 1A). O aparelho SD-OCT consiste de uma base e um monte de imagens animal (AIM) com um palco de alinhamento de roedores (RAS) ( figura 1B). A base inclui o computador, o mecanismo da OCT, a sonda de SD-OCT e a lente do rato específico. A sonda é montada sobre o objectivo, que inclui o Z-tradutor. O RAS é usado para mouse posicionamento graças a tabela com o X - e Y-tradutor, a fita que pode ser girada e girada e o bar de mordida removível com a banda de nariz. O software fornecido pelo fabricante permite a aquisição e análise dos arquivos de OCT, embora este último também pode ser feito com um programa de processamento de imagem de código-fonte aberto.

1. Firmemente Coloque a sonda no objetivo.
2. a lente do rato específicos se conectem a sonda.
3. Ajustar as configurações de braço de referência para a lente específica (aqui, poder no 086 e posição no 964).
4. Certificar-se que o rato específico da lente é suficientemente distante a cassete, fixe a barra de mordida com a banda do nariz para a gaveta.
   Nota: A distância entre a lente e a fita pode ser ajustada com o parafuso de Z-tradutor, situado na parte traseira o objectivo. A banda de nariz é uma faixa elástica comercialmente disponível, e sua tensão deve ser ajustada dependendo do tamanho do mouse.
5. Ligar a fonte de alimentação (canto inferior direito da carreta) e, em seguida, o computador.
6. Para iniciar o programa de imagem, clique duas vezes no atalho apropriado na tela.
   Nota: Isto depende do tipo de lente; aqui, Mouse Retina.
7. Cria um novo estudo clínico e adicione os protocolos desejados. Caso contrário, use o estudo clínico existente e/ou protocolos.
   1. Adicionar um novo estudo, escolhendo o " estudar NameŔ " IDŔ " especificações do braço de tratamento " (aqui, " Uncategorized "); e predefinidos " digitalizar protocolos ", se eles existirem.
8. Escolher um " examinador " no " estudo clínico " seção.
   Nota: para uma nova " examinador ", vá para " Setup examinadores & médicos " para defini-la
9. Adicionar um novo paciente no paciente/exame seção clicando em Adicionar paciente; entrando a " ID ", " nome ", " sobrenome ", " sexo ", e " data de nascimento " (opcional).
   Nota: Fazer isso só antes de testar cada rato, se mais conveniente. Certifique-se de que o ID é não mais de 10 caracteres. Para o mouse, o erro refractivo para ambos os olhos é 0 e o comprimento axial é 23,0.
10. Clique no " adicionar o exame " e selecione o desejado " protocolo " adicionando " Preset Scans " da lista, começando com o olho que será avaliado primeiro (aqui, o olho direito), ou Personalizando os scans.
11. Para personalizar um scan, ou usar uma verificação existente como um modelo e editá-lo ou criá-lo do zero através da " adicionar verificação personalizada " opção. Depois de adicionar todos os exames para a lista, definir um novo protocolo usando o " Enter " novo nome de protocolo " opção (OS: oculus sinistra, esquerdo olho; OD: oculus dexter, certo olho).
    Nota: Aqui, o protocolo envolve três exames: (i) uma varredura radial, com um diâmetro de 1,4 mm, deslocamentos horizontal e vertical de 0 mm, 1.000 linhas de A-exames/B-scan, B-exames/volume 100, quadro 1/B-scan, 80 linhas de inativos A-exames/B-scan e 1 volume; (ii) uma varredura retangular, com um comprimento de 1,4 mm e largura, ângulo de 0°, 0-mm deslocamentos horizontais e verticais, 1.000 linhas de A-exames/B-scan, B 100-scans, quadro 1/B-scan, 80 linhas de inativos A-exames/B-scan e 1 volume; e (iii) um anular digitalização, com 0,4 mm mínimo e 0,6 mm de diâmetro máximo, deslocamentos horizontais e verticais de 0 mm, 1.000 linhas de A-exames/B-scan, B-exames/volume 3, 48 frames/B-scan, 80 linhas de inativos A-exames/B-scan e 1 volume.

2. Preparação de mouse

1. imobilização e dilatação dos olhos
   1. pelo menos 15 minutos antes da aquisição de dados, instilar o colírio de fenilefrina 10% para os olhos de rato, remover o excesso e instilar 0,5% tropicamida colírio.
      Nota: A primeira dilatação pode ser feita de uma só vez para todos os ratos que serão testados na sessão. Certifique-se que os líquidos à temperatura ambiente.
   2. Anestesia induzindo imediatamente após geral (passo 2.2), administrar 0,4% oxybuprocaine cloridrato colírio, mantendo-os no lugar por 3 s para anestesiar e imobilizar os olhos. Depois, limpe as gotas e repita a instilação de tropicamida fenilefrina e 0,5% de 10% para verificar que os olhos são bem dilatados.
      Nota: Certifique-se que os líquidos são em temperatura ambiente e que o mouse não engula o oxybuprocaine.
2. Anestesia geral
   1. preparar uma solução anestésica de cetamina (20 mg/mL) e xilazina (1,17 mg/mL) em solução salina. Loja a 4 ° C por um período máximo de 2 semanas.
   2. Aproximadamente 5 min antes do teste, intraperitonealmente injetar 5-10 µ l da solução anestésica por 1 g de massa corporal, dependendo da idade e tamanho do mouse.
      Nota: Jovens e/ou necessidade de ratos fina menos anestésico, levar menos tempo para anestesiar, mas também despertar mais rápido. Aqui, 8 µ l/g (160 mg/kg de cetamina, 9,33 mg/kg de xilazina).
   3. , Opcionalmente, lubrificar os olhos com colírios viscosos ou um gel oftálmico para evitar o ressecamento da córnea.

3. Posicionamento do mouse

1. lubrificar os olhos com olho viscoso à base de glicol cai para fornecer hidratação corneal.
   Nota: Se os olhos parecem secos durante o exame, re-aplicar o colírio.
2. Embrulhar o mouse em uma folha de gaze cirúrgica para mantê-lo quente.
3. Usando uma esponja ou algodão pavio, aplique uma camada fina de um gel oftálmico com 0,3% hypromellose em cada olho, para minimizar a refração de luz, evitar opacidades e segura hidratação da córnea. Enquanto isso, abram as pestanas e bigodes.
4. Posicione o mouse na gaveta, com a cabeça reta e aponta para a frente.
5. Abra o grampo de barra dentada suavemente e coloque a barra na boca; usar a banda de nariz para fixar a posição.
   Nota: Certifique-se que a barra de mordida é no meio da gaveta.
6. Lugar um algodão roll sob o lado direito (esquerdo), se o olho direito (esquerdo) está sendo testado.
7. , Mantendo a ponta visando com clip na lente do rato específico, trazê-lo para o olho girando o parafuso de Z-tradutor no sentido anti-horário.
8. Girando e girando a gaveta e girando a barra dentada e os parafusos de X-tradutor, pré-ajuste a posição do mouse; o objetivo é ter o olhar olho direito diretamente para a lente e, portanto, para alinhar os eixos óticos dos olhos e a lente.
   Nota: Se o mouse estiver muito alta ou muito baixa, o parafuso de Y-Tradutor deve ser usado de primeiro.
9. Escolher o primeiro scan no " exame ", clique no " começar com o objetivo " e fazer os ajustes manuais ainda mais para a imagem latente retinal.
   1. Utilizando o parafuso de Z-tradutor, mover a retina verticalmente no painel esquerdo ( Figura 2, Alinhamento Horizontal B-scan) e horizontalmente no rpainel de voo ( Figura 2, Alinhamento Vertical B-scan).
   2. Girar a fita para trazer o HNO no meio do painel direito movendo o HNO cima ou para baixo. Utilize o parafuso do bar de mordida para endireitar a retina no painel direito. Girar a fita para posicionar o HNO no meio do painel esquerdo.
   3. Usar o parafuso X-Tradutor ao nível da retina no painel esquerdo. Ainda mais tendo em conta a função principal de cada modulador, ajuste a posição da retina para centralizar o HNO.
      Nota: Utilize o parafuso de Y-Tradutor para mover o HNO acima e para baixo no painel direito, se necessário. A posição pode ser refinada em qualquer momento entre as varreduras.

4. SD-OCT de imagem da Retina e HNO

1. depois de conteúdo com os ajustes, clique no " começar instantâneo " para começar a varredura de SD-OCT.
   1. Se uma imagem em 3D não é necessária, desmarque a opção OCU.
2. Salvar o relatório e a verificação.
3. Prosseguir com os próximos exames.
4. Para o segundo olho de imagem, depois retraindo a lente, vire a fita em conformidade e repita etapas 3.6-4.3.

5. Conclusão da aquisição

1. quando a aquisição estiver concluída, remova o mouse o cassete, aplicar gel oftálmico com hypromellose 0,3% para cada olho e coloque o mouse sobre uma placa de aquecimento para cima de acordo
2. Após a última aquisição, feche o software e desligue o computador e a máquina de OCT (botão de alimentação power).
3. Limpar a gaveta com desinfetante.

6. Análise

1. para a medição de espessura de camada da retina, usar o software de segmentação automatizada fornecido pelo fabricante.
   1. Clique no " paciente ", escolher o desejado " exame " então lista e clique em sobre o " revisão exame " opção.
   2. Carregar os dados desejados da OCT para o software de OCT clicando no ícone de pasta na varredura desejada.
   3. Direita clique sobre o B-scan; configurar os compassos de calibre, permitindo até 10 medindo pinças; e inserir seus nomes, ângulos e cores.
   4. Escolher o compasso de calibre desejado clicando sobre o B-scan; colocá-lo em conformidade para a retina para medição.
      Nota: Para os exames, centrados sobre o HNO, conjunto 5 pinças em ambos os lados, equidistantes uns dos outros. Para a análise de peripapillary, certifique-se que o compasso de calibre é colocado não muito longe do HNO. Para fazer a varredura radial, analise 10 imagens por exame que foram escolhidas pelo software OCT. Seus números podem ser encontrados no " relatórios " pasta.
   5. Salvar os resultados para análise em um programa de software de planilha, clicando sobre o B-scan e clicando em " salvar resultados ".
      Nota: Os resultados podem ser encontrados na mesma pasta como a digitalização de dados.
2. Como alternativa, use a macro de maxila caseiro, " MRI Retina ferramenta ", desenvolvido por um programa de processamento de imagem de código-fonte aberto (ver a tabela de materiais).
   1. Certifique-se de que o " ferramenta de Retina MRI " e o " modificar o polígono seção ferramenta " macros são ativas. Carrega a imagem. Clique no botão para iniciar a medição de m.
      Nota: A macro cria automaticamente um 0,2 mm de comprimento medição gaveta em ambos os lados do HNO. Cada gaveta contém 5 pontos de medição que funcionam como pinças. Sua posição lateral é inalterável e personalizada para o peripapilla nos scans radiais. A posição horizontal das fitas é predefinida para medir a espessura RNFL/GCL, mas é facilmente modificável para medir a camada de complexo de GC em vez disso. Se a qualidade da digitalização é pobre, a posição horizontal precisa ser ajustada ou a imagem precisa ser excluídos da análise.
   2. Para ajuste horizontal, clique no botão e. No recém-inaugurado " ROI Manager " janela, escolha a primeira gaveta.
   3. Clique no polígono azul botão e ajustar a posição da primeira fita clicando nas fronteiras da camada medida na foto.
   4. Repetir pela segunda gaveta, primeiro escolhendo-a no " ROI Manager " janela e em seguida, clicando na imagem apropriada. Clique no botão r para medir novamente. Exibir os resultados na " medições " janela.
      Nota: Os resultados podem ser copiados para um programa de software de planilha eletrônica, a qualquer momento. Eles contêm os seguintes valores para a direita (r), gaveta esquerda (l) e gaveta total: Intden - densidade integrada dentro da gaveta; Área: área da medição, em mm ²; Len: comprimento da maxila dentro da gaveta, em mm; Quer dizer: quer dizer a intensidade do sinal dentro da gaveta; e Std: erro padrão da média intensidade do sinal.
   5. Prosseguir com a próxima imagem.
   6. Mais analisar os dados em um programa de software de planilha eletrônica.
      Nota: Para localizar a espessura média da camada, leve o Len de dez valores.

Resultados

A tecnologia SD-OCT permite imaginar da retina e análise de espessura que é comparável à histologia, mas é mais rápido e mais detalhadas (Figura 3). Tal como apresentado com camundongos C57Bl/6 de sua, mesmo que a qualidade de uma varredura de SD-OCT (Figura 3A, direito) não é tão bom quanto o de uma imagem de uma secção da retina (Figura 3A, à esquerda), visualiza mais camadas (por e...

Discussão

O sistema OCT, um não-invasivo na vivo por imagens método, fornece scans de cross-section-como retina de alta resolução. Assim, sua principal vantagem é o seu potencial para análise detalhada, com a maravilhosa oportunidade de transpor protocolos rotineiramente aplicados aos seres humanos a modelos de rato.

No exemplo de Opa1^delTTAG ratos mutantes, SD-OCT resultados mostraram um aumento de espessura de camada complexa de RNFL e GC, que permitiu maior explora?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA	-	Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	Protection against hypothermia
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Nose Band	-	-	Elastic band
Gauze pads 3"x3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Mouse positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France	ROM001	General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0,9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hydration of eyes
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectant