Оптическая когерентная томография: Визуализация мыши сетчатки ганглия клетки в естественных условиях

Резюме

Эта рукопись описывает протокол для изображений в vivo сетчатки мышь с разрешением спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Октябрь). Она фокусируется на клетки сетчатки ганглии (РЦ) в околососковой области с несколькими сканирование и количественного подходов, описанных.

Аннотация

Структурные изменения в сетчатке являются распространенными проявлениями офтальмологических заболеваний. Оптическая когерентная томография (Окт) позволяет их идентификации в естественных условиях— быстро, многократно и с высоким разрешением. Этот протокол описывает OCT изображения на сетчатке мыши как мощный инструмент для изучения оптической невропатии (OPN). Окт система является альтернативой общей посмертное гистологических анализов, на основе интерферометрии, неинвазивная. Она обеспечивает быстрые и точные оценки толщины сетчатки, позволяя возможность отслеживать изменения, такие как истончение сетчатки или утолщение. Мы представляем визуализации процесса и анализ на примере линии мыши^delTTAG Opa1. Предлагаются три типа сканирования, с двумя методами количественной оценки: стандартные и домашние суппортов. Последний лучше всего подходит для использования на сетчатке околососковой во время радиальных сканирования; будучи более точной, является предпочтительным для анализа тоньше структур. Все описанные здесь подходы предназначены для клеток сетчатки ганглии (РЦ), но легко адаптируется для других клеточных популяций. В заключение Окт эффективен в мыши модель фенотипа и имеет потенциал, чтобы быть использованы для надежной оценки терапевтических вмешательств.

Введение

OCT-это диагностический инструмент, который облегчает изучение сетчатки структуры¹, включая головку зрительного нерва (БЕЙКЕ). С годами он стал надежным показателем прогрессирования заболевания людей^2,3, а также в грызунов^4,5. Он использует интерферометрии для создания поперечных изображения слоев сетчатки осевой с разрешением 2 мкм. Внутренний слой является сетчатки слой нервных волокон (RNFL), содержащий RGC аксонов, который сопровождается слоя клеток ганглия (GCL), содержащие главным образом RGC органов. Далее идет внутренний сплетениевидный слой (IPL), где RGC дендритов встречаются биполярный, горизонтальные и Амакриновые аксоны ячейки. Это, вместе с горизонтальной клетки, формируют внутренний ядерный слой (INL), и их выступов соединиться с фоторецепторных аксоны в внешний сплетениевидный слой (ОБН). Это сопровождается ядерной слоя (ONL), с органами фоторецепторных клеток и отделена от фоторецепторных слоя внешней ограничивающим мембраны (OLM), также называемый внутренний сегмент/наружный сегмент (IS / OS) слоя. Наконец последний наблюдаемых слои в сетчатке мыши являются пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) и сосудистое (C). Только RNFL обычно слишком тонким, чтобы быть измерена в мышей; Таким образом вместо анализа RNFL GCL — предпочтительно^4,5. Другой возможностью является GC комплекс слой, который содержит последний дополнение к IPL, облегчая толще и таким образом даже для измерения на Окт сканирует⁴. Следовательно OCT может обеспечить понимание патологическое состояние сетчатки, такие как в OPNs.

Кроме того толщина сетчатки мыши часто анализируется с посмертной гистологии. Однако этот метод лица ограничения, касающиеся ткани коллекции, фиксации, резки, окрашивание, монтаж, и т.д. следовательно, некоторые дефекты, такие как толщина тонкие изменения, не может быть обнаружена. Наконец, поскольку и та же мышь не может быть протестирован в несколько раз указывает, количество животных каждого исследования значительно увеличивается, в отличие от для октября. Все в всех не инвазивность, с высоким разрешением, возможности для повторения, время мониторинга во времени и простота использования технологии OCT делают его методом выбора в исследования заболеваний сетчатки.

Мыши модели используются для выявления дефектов гена и прояснения молекулярных механизмов лежащие в основе ретинопатии⁶. OPN — это форма ретинопатии с существенный ущерб зрительного нерва (на), которая состоит из примерно 1,2 миллиона RGC аксоны. OPN может быть направлена на ON или может быть вторичным на другие заболевания, врожденные или не⁷, приводит к потере зрительного поля и позднее, слепота. Характерные черты OPN являются RGC потери и об ущербе, который может наблюдаться в человека OCT RNFL и GCL истончение^2,3. Тем временем патофизиологии OPN еще плохо поняты, и поэтому остается необходимость тестирования мыши сетчатки.

Эта рукопись описывает изображений и количественной оценки толщины слоя сетчатки, используя пример Opa1^delTTAG мыши линии^8,9, модель доминирующим атрофия зрительного нерва (DOA)¹⁰. Чтобы оценить RGC патофизиологии, радиальные, прямоугольные и кольцевой проверки были количественно. Это было сделано с стандартных суппортов, предоставляемый OCT программного обеспечения или с домашним макрос, разработанные для обработки изображений открытым исходным кодом программы. Стандартные калибры трудно манипулировать и часто толще, чем RNFL/GCL, в то время как домашние суппорта проста в использовании, воспроизводимые и более точным. Макрос выполняет измерения автоматически обнаруженных слоя, в 5 пунктах и на стационарных позициях, на обеих сторонах БЕЙКЕ в околососковой области. Цель представленных протокола является описание OCT сканирования приобретение для указания сетчатки позиционирования, с акцентом на РГК.

протокол

экспериментальный протокол был одобрен Institut национальный de la santé et de la recherche сообщала (Inserm; Монпелье, Франция), в соответствии с европейскими директивами и соответствует Арво заявление для использования животных в офтальмологических исследований. Она осуществляется по соглашению Лангедок Руссийон вежливости этики в животных экспериментов (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).

1. Установка оборудования и подготовка предварительной визуализации

Примечание: здесь, Окт была выполнена на мыши сетчатки с помощью спектральной области (SD) офтальмологический тепловизионные системы ( рис. 1A). SD-Окт аппарат состоит из базы и животных изображений горе (AIM) с грызунов выравнивание стадии (РАН) ( рис. 1B). База включает в себя компьютер, двигатель OCT, SD-Окт зонд и мыши конкретного объектива. Датчик монтируется на цель, которая включает в себя Z-переводчик. РАН используется для позиционирования благодаря таблицы с X - и Y-переводчик, кассету, которую можно поворачивать и поворачивается, мыши и съемный укус бар с группой нос. Программное обеспечение, предоставляемое изготовителем позволяет для приобретения и анализ файлов OCT, хотя последний также может быть сделано с открытым исходным кодом изображения обработки программой.

1. Твердо место в целью штырь.
2. Подключить мышь конкретного объектива зонда.
3. Руку ссылку настройки для конкретного объектива (здесь, мощность на 086 и позиции в 964).
4. Убедившись, что мыши конкретные объектив достаточно отдаленные от кассеты, приложите укус бар с группой нос на кассету.
   Примечание: Расстояние между линзой и кассета может быть скорректирована с Z-переводчик винт, задней цель. Группа нос является коммерчески доступных резинкой, и его напряжения должны быть скорректированы в зависимости от размера мыши.
5. Включите блок питания (правом нижнем углу корзины), а затем компьютер.
6. Для запуска программы обработки изображений, дважды щелкнуть соответствующий ярлык на экране.
   Примечание: Это зависит от типа объектива; здесь, мышь сетчатки.
7. Создать новые клинические исследования и добавьте желаемый протоколы. В противном случае, использовать существующие клинические исследования и/или протоколы.
   1. Добавить новое исследование, выбрав " исследования NameŔ " IDŔ " спецификации рукой лечения " (здесь, " рубрики "); и предопределенные " сканирования протоколы ", если они существуют.
8. Выберите " экзаменатор " в " клинические исследования " раздел.
   Примечание: для новой " экзаменатор ", перейдите " установки экзаменаторов & врачей " определить it.
9. Добавить новый пациент в экзамен пациента раздел, нажмите на добавить пациент; ввода " ID ", " имя ", " фамилия ", " секс ", и " Дата рождения " (опционально).
   Примечание: Для этого перед тестирование каждой мыши, если более удобным. Убедитесь, что идентификатор не более 10 символов. Для мыши, рефракционной ошибки для обоих глаз 0 и осевой длина 23,0.
10. Нажмите на " добавить экзамен " и выберите " протокол ", добавив " пресет сканирует " из списка, начиная с глаз, который будет оцениваться сначала (здесь, правый глаз), или путем настройки сканирования.
11. Для настройки сканирования, либо использовать существующий сканирования в качестве шаблона и изменить его или создание его с нуля путем " добавить настраиваемые сканирования " вариант. После добавления в список всех проверок, определить новый протокол с помощью " ввод " новое имя протокола " вариант (OS: oculus зловещий, левый глаз; ОД: oculus dexter, правый глаз).
    Примечание: Здесь, протокол включает в себя три сканов: (i) радиальные сканирование, с диаметром 1,4 мм, горизонтальное и вертикальное смещение 0 мм, 1000 линии А-сканов/B-скан, 100 Б-сканов/объем, 1 кадр/B-скан, 80 линий неактивных А-сканов/B-Scan, и 1 объем; (ii) прямоугольной сканирование, с 1.4-мм длины и ширины, угол 0°, горизонтальное и вертикальное смещение 0-мм, 1000 линии А-сканов/B-скан, 100 Б-сканов, 1 кадр/B-скан, 80 линий неактивных А-сканов/B-Scan, и 1 объем; и (iii) кольцевой сканирование, с 0,4 мм минимальный и 0,6 мм максимальный диаметр, горизонтальное и вертикальное смещение 0-мм, 1000 линии А-сканов/B-скан, 3 Б-сканов/объем, 48 кадров/B-скан, 80 линий неактивных А-сканов/B-Scan, и 1 объем.

2. Подготовка мыши

1. глаз дилатация и иммобилизации
   1. по крайней мере 15 минут до сбора данных, привить 10% фенилэфрина глазные капли в глаза мыши, удалить излишки и привить глазные капли 0,5% Тропикамид.
      Примечание: Первый дилатации может быть сделано сразу для всех мышей, которые будут проверяться в ходе сессии. Убедитесь, что жидкости при комнатной температуре.
   2. Сразу же после вызывающих общий наркоз (шаг 2.2), администрировать 0,4% oxybuprocaine гидрохлорид глазные капли, сохраняя их в место для 3 s анестезировать и иммобилизации глаза. После этого, вытирать капли и повторите внушение 10% фенилэфрина и 0,5% Тропикамид, чтобы убедиться, что глаза хорошо расширены.
      Примечание: Убедитесь, что жидкости при комнатной температуре и что мышь не глотать oxybuprocaine.
2. Наркоз
   1. подготовить анестезирующий раствор кетамин (20 мг/мл) и ксилазина (1,17 мг/мл) в солевой раствор. Хранить при 4 ° C для максимум 2 недели.
   2. Около 5 мин до начала испытания, внутрибрюшинно придать 5-10 мкл раствора анестетика на 1 г массы тела, в зависимости от возраста и размера мыши.
      Примечание: Молодые и/или тонкой мышей необходимость менее обезболивающий, взять меньше времени чтобы анестезировать, но также пробудить быстрее. Здесь, 8 мкл/g (160 мг/кг кетамина, 9,33 мг/кг Ксилазина).
   3. При необходимости смазывать глаза с вязкие глазные капли или глазной гель, чтобы избежать сухости роговицы.

3. Позиционирования мыши

1. смазывать глаза с вязкой на основе гликоля глаз капли предоставлять роговицы гидратации.
   Примечание: Если глаза, кажется сухим во время экзамена, повторно применять глазные капли.
2. Обертывание мыши в листе хирургических марлевых держать его теплым.
3. С помощью губки или хлопка фитиль, нанесите тонкий слой глазной гель с гипромеллоза 0,3% на каждый глаз, свести к минимуму преломление света, во избежание помутнения и безопасных роговицы гидратации. При этом, переместите ресницы и усы сторону.
4. Позиция мыши в кассету, с головой прямо и указывая вперед.
5. Осторожно откройте зажим бар укус и поместите панель в рот; используйте нос группы для обеспечения позиции.
   Примечание: Убедитесь, что панель укус в середине кассету.
6. Место, хлопок катиться под правой (левой) стороны, если тестируется правый глаз (слева).
7. При сохранении кончик клип направленный на мышь конкретного объектива, привести его к глазу, поворачивая против часовой стрелки винт Z-переводчик.
8. Вращения и поворота кассеты и, поворачивая укус бар и X-переводчик винты, предварительно задать положение мыши; цель должна иметь правый глаз смотреть прямо в объектив и, таким образом, чтобы выровнять оптических осей глаз и объектив.
   Примечание: Если мышь является слишком высокой или слишком низкой, винт Y-переводчик должен использоваться сначала.
9. Выбрать первая проверка в " экзамен ", нажмите на " начать направленный " и сделать любой дальнейшей ручной корректировки для сетчатки воображения.
   1. С помощью Z-переводчик винт, переместите сетчатки вертикально на левой панели ( Рисунок 2, выравнивание горизонтальных B-скан) и по горизонтали на rГруппа полета ( Рисунок 2, выравнивание вертикальной B-скан).
   2. Поворота кассеты довести БЕЙКЕ в середине правой панели, перемещая БЕЙКЕ вверх или вниз. Используйте винт бар укус выпрямить сетчатки на правой панели. Вертлюг кассетный позиционировать БЕЙКЕ в середине левой панели.
   3. Использовать винт X-переводчик для уровня сетчатки на левой панели. Принимая во внимание основные функции каждого модулятор, далее Отрегулируйте положение сетчатки для централизации БЕЙКЕ.
      Примечание: Используйте винт Y-переводчик для перемещения БЕЙКЕ вверх и вниз на правой панели, при необходимости. Позиция может быть изысканным в любое время между операциями сканирования.

4. SD-Окт Imaging БЕЙКЕ и сетчатки

1. после контента с коррективов, нажмите на " начать снимок " чтобы начать сканирование SD-Окт.
   1. Если 3D визуализации не требуется, снимите флажок с опции OCU.
2. Сохранить сканирования и отчет.
3. С следующего сканирования.
4. К изображению второй глаз, после втягивания объектива, поверните кассеты соответственно и повторите шаги 3.6-4.3.

5. Приобретение завершение

1. когда приобретение является полным, удалить мыши из кассеты, применять глазной гель с гипромеллоза 0,3% для каждого глаза и поместите курсор мыши на нагревательной пластинки просыпаться вверх
2. После последнего приобретения, закройте программное обеспечение и выключить компьютер и октября машина (кнопка блока питания).
3. Чистый кассету с протравителем.

6. Анализ

1. для измерения толщины слоя сетчатки, используйте программное обеспечение автоматической сегментации, предоставляемой производителем.
   1. Нажмите на " пациента ", выбрать желаемый " экзамен " от, то список и нажмите на " обзор экзамен " параметр.
   2. Загрузить желаемого OCT данные на программное обеспечение OCT, щелкнув правой кнопкой на значке папки в желаемой сканирования.
   3. Правой кнопкой мыши на B-скан; Настройка суппорта, позволяя до 10 измерения суппортов; и ввести их имена, углов и цвета.
   4. Выбор желаемого суппорта, щелкнув правой кнопкой на B-скан; место соответственно на сетчатку измерения.
      Примечание: Для сканирования, сосредоточены на БЕЙКЕ, установите 5 суппортов на каждой стороне его, равноотстоящих друг от друга. Для анализа околососковой убедитесь, что скоба находится не слишком далеко от БЕЙКЕ. Для радиальных сканирования, анализировать 10 фотографии за сканирования, которые были выбраны OCT программного обеспечения. Их число может быть найдена в " отчеты " папка.
   5. Сохранить результаты для анализа в программу электронных таблиц, щелкните правой кнопкой мыши на B-скан и нажав " сохранить результаты ".
      Примечание: Результаты можно найти в той же папке, что сканирования данных.
2. В качестве альтернативы, используйте макрос домашнее суппорта, " МРТ сетчатки инструмент ", разработанные в программе обработки изображений открытым исходным кодом (см. таблицу материалы).
   1. Убедитесь, что " МРТ сетчатки инструмент " и " изменить раздел многоугольник " макросы являются активными. Загрузите изображение. Нажмите на кнопку для начала измерения м.
      Примечание: Макрос автоматически создает один 0,2 мм Лонг измерения кассеты по обе стороны БЕЙКЕ. Каждая кассета содержит 5 точек измерения эту функцию как суппортов. Боковое положение является неизменяемым и настраивается для peripapilla в радиальных сканирует. Горизонтальное положение кассеты предопределен для измерения толщины RNFL/GCL, но это легко модифицируемые измерить GC комплекс слой вместо. Если качество сканирования бедных, горизонтальное положение необходимо скорректировать или изображение необходимо исключить из анализа.
   2. Для горизонтальной регулировки, нажмите на кнопку e. В недавно открытом " ROI менеджер " окно, выберите первый кассетный.
   3. Нажмите на синий многоугольника кнопку и отрегулировать положение первой кассеты, нажав на границах измеренных слоя на картинке.
   Кассета
   4. повторить для второго, первый, выбрав его в " ROI менеджер " окно и затем нажмите на соответствующее изображение. Нажмите на кнопку "r" для повторного измерения. Просмотр результатов в " измерения " окно.
      Примечание: Результаты могут быть скопированы в программу электронных таблиц программного обеспечения в любое время. Они содержат следующие значения для правой кассеты (r), левый кассеты (l) и всего: Intden - интегрированный плотности внутри кассеты; Площадь: области измерения, ² мм; Len: длина суппорта в пределах кассеты, в мм; Среднее: означает интенсивность сигнала в пределах кассеты; и Std: Стандартная ошибка средней интенсивности сигнала.
   5. С следующее изображение.
   6. Далее анализировать данные в программу электронных таблиц программного обеспечения.
      Примечание: Чтобы найти средняя толщина слоя, принять десять Len значения.

Результаты

SD-Окт технология позволяет сетчатки воображая и анализ толщины, что сопоставимо с гистологии, но быстрее и более подробные (рис. 3). Как представлены с мышей C57Bl/6 wildtype, хотя качество сканирования SD-Октябрь (рис. 3A, право) не так хорошо, как и ...

Обсуждение

Системе OCT, неинвазивная в vivo imaging метод, обеспечивает высоким разрешением сканирования сетчатки кросс-секторальная-как. Таким образом ее главным преимуществом является ее потенциал для детального анализа, прекрасная возможность транспонировать протоколы обычно применяется для ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA	-	Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	Protection against hypothermia
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Nose Band	-	-	Elastic band
Gauze pads 3"x3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Mouse positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France	ROM001	General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0,9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hydration of eyes
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectant