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要約

本稿では、高分解能のスペクトル領域光干渉断層法 (SD OCT) とマウス網膜の生体内イメージングのためのプロトコルについて説明します。それは網膜神経節細胞 (RGC) のいくつかのスキャンと説明方法を定量化、視神経乳頭周囲地域に焦点を当てください。

要約

網膜の構造変化は、眼疾患の一般的な症状です。光干渉断層計 (OCT)、識別可能生体内で-迅速、繰り返し、かつ高解像度で。このプロトコルでは、視神経症 (OPN) を研究するための強力なツールとしてマウス網膜における OCT イメージングについて説明します。OCT システムは共通の事後の組織学的アッセイに干渉法に基づく、非侵襲的代替です。それは網膜の間引きや肥厚などの変更を追跡する可能性を許可する網膜の厚さの迅速かつ正確な評価を提供します。Opa1delTTAGマウス線の例と画像の処理と解析を提案します。スキャンの 3 種類が提案されている、2 つの定量方法: 標準的な自家製のキャリパー。ラジアル スキャン中に視神経乳頭周囲網膜の上の使用に最適、後者は薄い構造の分析により正確であること、お勧めします。ここで説明したすべてのアプローチの網膜神経節細胞 (RGC) のデザインしますが、他の細胞集団に容易に適応可能であります。結論として、10 月マウス モデル表現型では効率よく、治療の信頼性評価に使用する可能性があります。

概要

OCT は、網膜構造1、視神経乳頭視神経などの検討を容易にする診断ツールです。長年にわたって齧歯動物4、5人間2,3病気の進行の信頼性の高い指標になりました。2 μ m の軸解像度の網膜の層の断面像を作成するのに干渉計を使用します。最も内側の層は、網膜神経線維層 (視神経) RGC 軸索を含む主 RGC 体を含む神経節細胞層 (GCL) が続いています。次に、RGC 樹状突起がバイポーラ、水平、およびアマクリン細胞の軸索を満たす内部網状層 (IPL) です。水平細胞と共に、これらは内部の核層 (INL) を形成し、その突起を結ぶ外網状層 (OPL) における視細胞軸索。これは光受容体細胞体による外核層 (ONL) が続き、内部セグメント/外側セグメントとも呼ばれる外境界膜 (OLM)、視細胞層から分離されている (は/OS) 層。最後に、マウス網膜における最後の観察可能な層が網膜色素上皮 (RPE)、脈絡膜 (C)。単独での視神経が薄すぎてマウスを用いての測定通常このように、視神経/GCL の分析代わりには望ましい4,5です。別の可能性は IPL に加えて後者を含む GC の複雑なレイヤー、やすく厚くそしてこうしても 10 月を測定する4をスキャンします。その結果、10 月は OPNs のように網膜の病理組織学的の状態に洞察力を提供できます。

また、マウス網膜の厚さはしばしば事後組織学と分析されます。ただし、組織の採取、固定、切断、染色、取付、等したがって、微妙な厚みの変化など、いくつかの欠陥に関するこのテクニック面の制限を検出できません。最後に、同じマウスはいくつかの時間にテストできませんのでポイントごとのペット数 OCT 用とは異なり大幅増加を研究します。すべてのすべてで、繰り返し非侵襲、高解像度、可能性、時間監視時間と OCT 技術の使いやすさで、選択の方法網膜疾患研究です。

マウス モデルは、遺伝子欠陥を識別するために、retinopathies6の分子機構を解明するために使用されます。OPN は、約 120 万 RGC 軸索から成っている、(に)、視神経に重大な障害と網膜症のフォームです。OPN は ON に集中することができます。 または他の疾患、先天性またはない7、二次視野欠損しその後、失明をリードすることができます。OPN の特性 RGC 損失、被害、見られるよう人間 OCT で視神経と GCL2,3を薄くなります。一方、OPN の病態はまだよく理解されていない、それゆえマウス網膜をテストする必要性のまま。

本稿では、イメージングと定量 Opa1delTTAGマウス線8、の9、支配的な視神経萎縮 (DOA)10のモデル例を用いた網膜層厚さをについて説明します。RGC の病態を評価するために、長方形、放射状、環状のスキャンは定量化されました。これは、10 月のソフトウェアによって提供される標準ノギスまたはオープン ソース画像処理プログラムの開発した自家製マクロで行われました。標準ノギスは、自家製キャリパーが使いやすい、再現、およびより正確なと操作が難しく、視神経/GCL より頻繁に厚い。マクロは、自動的に検出された層の 5 点と視神経乳頭地域の両側の固定位置の測定を実行します。提案するプロトコルの目的は、Rgc 焦点を網膜の位置を指定するのに OCT スキャン データ収集を記述するためです。

プロトコル

実験的プロトコルは Institut 国民 de の la の健康によって承認された et de la recherche médicale (Inserm;モンペリエ、フランス)、欧州指令と一貫した眼科研究における動物の使用の ARVO ステートメントに準拠しています。それは (CEEALR; nuCEEA LR 12123) 動物実験における倫理のラングドック ・ ルシヨン礼譲の契約の下で行われました

。

1。 機器の設定や事前イメージング準備

注: ここでは、10 月のスペクトル領域 (SD) 眼科用イメージング システム ( 図 1 a) を使用してマウスの網膜に行った。齧歯動物のアライメント ステージ (RAS) ( 図 1 b) ベースと動物イメージング マウント (AIM) の SD 10 月装置で構成されます。ベースには、コンピューター、10 月エンジン、SD 10 月プローブおよびマウス固有のレンズが含まれています。プローブは、Z-翻訳が含まれています AIM にマウントされます。RAS は、マウス テーブルと、X と Y-翻訳、おかげで回転でき、旋回、カセット位置決めと鼻バンドとリムーバブルかまバーに使用されます。後者もすることオープン ソース画像処理プログラムが取得および OCT ファイルの解析により、製造元が提供するソフトウェア

。
  1. しっかりと目的にプローブを配置します
    2. 。
  2. マウス固有レンズをプローブに接続します
    3. 。
  3. (ここで 086 でパワーと 964 の位置) の特定のレンズのための参照アーム設定を調整します
    4. 。
  4. マウス固有のレンズを確認してはカセットから十分に離れて、カセットに鼻バンドかまバーをアタッチします
    。 注: レンズとカセット間の距離は、目的の背面にある Z 翻訳ネジで調整できます。鼻バンドは市販のゴムバンドとマウスのサイズによってそのテンションを調整する必要があります
    5. 。
  5. 電源 (カートの右下隅) をクリックし、コンピューターをオンにします
    6. 。 イメージング プログラムを起動する
  6. を画面の適切なショートカットをダブルクリックします
    。 注: これはレンズの種類に依存します。ここでは、マウス網膜
    7. 。
  7. は新しい臨床研究を作成し、必要なプロトコルを追加します。そうでなければ、既存の臨床試験やプロトコルを使用します。
    1. を選択して新しい研究を追加、" 研究 NameŔ " IDŔ " 治療アーム仕様 " (ここでは、" 未分類 "); および定義済み " スキャン プロトコル "、存在する場合
      2. 。
  8. の選択、" 審査官 " で、" 臨床研究 " セクション
    。 注: の新しい " 審査官 " へ " セットアップ審査 & 医師 " を定義する
    9. 患者の追加をクリックして
  9. 患者/試験の新しい患者の追加セクション; を入力、" ID "、" 名前 "、" 氏 "、" セックス " と " 生年月日 " (省略可能).
    注: より便利な場合に各マウスをテスト直前にこれを行います。ID は半角 10 文字以内であることを確認します。マウスの両方の目の屈折異常は 0、軸の長さは 23.0 です
    10. 。
  10. をクリックして " 追加試験 " 希望と " プロトコル " を追加して " プリセット スキャン " リストから、最初に測定される目から始まる (ここでは、右目)、またはスキャンをカスタマイズすることで
    11. 。 スキャンをカスタマイズする
  11. かテンプレートとして既存のスキャンを使用し、それを編集から作成、" 追加カスタム スキャン " オプション。すべてのスキャンをリストに追加すると、定義する新しいプロトコルを使用して、" を入力してください " 新しいプロトコルの名前 " オプション (OS: オクルスの不吉な左目OD: オクルス デクスター、右目).
    注: ここでは、プロトコルを含む 3 つのスキャン: (i) ラジアル スキャン、直径 1.4 mm、0 mm 水平および垂直オフセット、1 ボリューム、アクティブでない A スキャン/B - スキャン、80 線 1 フレーム/B-スキャン 100 B-スキャン/ボリューム、A-スキャン/B-スキャンの 1,000 行(0 mm 水平および垂直オフセット、1 ボリューム、アクティブでない A スキャン/B - スキャン、80 線 1 フレーム/B-スキャン 100 B-スキャン、A-スキャン/B-スキャンの 1,000 行 0 ° の角度と幅 1.4 mm 長さ ii) 長方形スキャン0.4 mm と 0.6 mm の最小最大径、0 mm 水平および垂直オフセット、1 ボリューム、アクティブでない A スキャン/B - スキャン、80 線 48 フレーム/B-スキャン 3 B-スキャン/ボリューム、A-スキャン/B-スキャンの 1,000 行の (iii) 環状スキャンします
    12. 。

2。マウス作製

  1. 目拡張と固定化
    1. データ集録前に少なくとも 15 分マウスの目に 10% フェニレフリン点眼を植え付ける、過剰を削除および 0.5% トロピカミド点眼を植え付ける
      。 注: 最初の拡張は、セッションでテストされるすべてのマウスを一度に実行できます。液体は、部屋の温度を確認してください
      2. 。
    2. 直後の誘導全身麻酔 (手順 2.2) 管理 0.4 %oxybuprocaine 塩酸塩点眼液には、3 のための場所でそれらを維持麻酔し、目を固定します。その後、水滴を拭き取るし、の目は膨張もことを確認するために 10% フェニレフリンおよび 0.5% トロピカミド点眼を繰り返します
      。 メモ: 室温で液体があるし、マウスは、oxybuprocaine を飲み込むしないこと確認してください
      3. 。
  2. 全身麻酔
    1. 生理食塩水 (20 mg/mL) ケタミン ・ キシラジン (1.17 mg/mL) の麻酔液を準備します。2 週間の最大 4 ° C でストア
      2. 。
    2. 、テスト前に約 5 分腹腔内注入する麻酔液の体重、年齢およびマウスの大きさによって 1 g あたりの 5-10 μ L.
      注: 若いおよび/または薄いマウスの必要性の少ない麻酔、取る時間が短く、麻酔にも早く目を覚ます。ここでは、8 μ L/g (160 mg/kg のケタミン ・ キシラジンの 9.33 mg/kg).
    3. 必要に応じて、粘性の点眼や角膜の乾燥を避けるためにゲル状目薬で目を注油します
      4. 。

3。マウス位置決め

  1. 粘性グリコール ベースの目と目が角膜水和を提供する低下潤滑します
    。 注: 場合は、目に見える試験中に乾燥、再適用目薬します
    2. 。
  2. それは暖かく保つために手術用ガーゼのシートでマウスをラップします
    3. 。
  3. 、光の屈折を最小限に抑える、不透明度、およびセキュリティで保護された角膜水和を避けるため、それぞれの目に 0.3% ヒプロメル ロース、ゲル状目薬の薄層を適用スポンジや綿芯を使用しています。そうしながらまつげやひげを脇へ移動します
    4. 。
  4. ヘッド ストレートとポインティングへマウス ポインターをカセットにします
    5. 。
  5. 軽く一口バー クランプを開くと口の中にバーを配置; 鼻バンドを使用して、位置を確保します
    。 メモ: は、一口バーをカセットの真ん中にあることを確認します
    6. 。
  6. 右 (左) 目がテストされている場合、コットン ロール右 (左) 側の下の場所
    7. 。
  7. マウス固有のレンズにクリップオンを目指して先端を維持しながらそれをもたらす目に向けて Z 翻訳ネジを反時計回りに回してします
    8. 。
  8. かまバーと X 翻訳ネジがマウスの位置を設定して事前回転とカセットを旋回して回して;、目標は、右の目を見て直接レンズになり、目とレンズの光軸を合わせます
    。 注: 場合は、マウスが高すぎるか低すぎる、Y 翻訳ネジを使用します
    9. 。
  9. の最初のスキャンを選択、" 試験 " をクリックして " を目指して開始 "、眼底イメージングの手動調整と。
    1. ( 図 2 は、B-スキャンの水平配置) の左側のパネルで、水平方向 r に網膜を垂直に移動 Z 翻訳スクリューを使用しました。ight パネル ( 図 2 は、垂直 B スキャン配置).
    2. 回転、上下、視神経を移動して右側のパネルの真ん中に視神経をもたらすカセットです。右側のパネルで網膜をまっすぐに一口バーのネジを使用します。左側のパネルの真ん中に視神経の位置にカセットを回転します
      3. 。
    3. は、左側のパネルで網膜のレベルに X 翻訳ネジを使用します。各変調器の主要な機能を念頭、視神経を一元化する網膜の位置をさらに調整します
      。 注: は、必要に応じて、右側のパネルに、視神経を上下に移動するのに Y 翻訳ネジを使用します。位置は、スキャンの間に、洗練されるかもしれません
      4. 。

4。視神経と網膜の SD OCT イメージング

  1. 一度調整に満足してをクリックして " スナップショットの開始 " SD OCT スキャンを開始します。
    1. 3 D イメージングが必要ない場合 OCU オプションをオフにします
      2. 。
  2. スキャンとレポートを保存します
    3. 。
  3. 次のスキャンを続行します
    4. 。
  4. 2 番目の目をイメージするレンズを取り消し後、カセットをそれに応じて回すし、手順 3.6 4.3 を繰り返します
    5. 。

5。買収完了

  1. 買収が完了すると、カセットからマウスを削除、各目に 0.3% ヒプロメル ロース、ゲル状目薬を適用、覚まして加熱プレートの上にマウスを置く
  2. 最後の買収後ソフトウェアを閉じるし、コンピューターと 10 月マシン (電源ボタン) をオフします
    3. 。
  3. 消毒剤のカセットをきれいします
    4. 。

6。解析

  1. 網膜層厚さ測定の場合、製造元から提供される自動セグメンテーション ソフトウェアを使用します。
    1. をクリックして、" 患者 "、希望選択 " 試験 " から一覧表示、しをクリックして、" レビュー試験 " オプション
      2. 。
    2. 目的のスキャンでフォルダーのアイコンを右クリックし 10 月ソフトウェアに必要な 10 月データをロードします
      3. 。
    3. を右クリックして B スキャン; 測定ノギス; 10 までを有効にして、キャリパーを構成し、名前、角度、およびカラーを入力してください
      4. 。
    4. に応じて配置 B スキャンを右クリックして目的のキャリパーを選択する測定のため網膜に
      。 注: スキャンは、視神経を中心とした、それは、等距離互いのそれぞれの側に 5 キャリパーを設定します。乳頭解析、視神経から遠すぎてキャリパーが配置されていないことを確認してください。ラジアル スキャン分析 10 月ソフトウェアによって選ばれたスキャンごとの 10 の写真。自分の番号を見つけることが、" レポート " フォルダー
      5. 。
    5. B-スキャンを右クリックし、クリック、してスプレッドシート ソフトウェア プログラム解析結果を保存 " 結果を保存 ".
      注: 結果は、スキャン データと同じフォルダーで見つけることができます
      6. 。
  2. 自家製キャリパー マクロを使用または、" MRI 網膜ツール "、オープン ソース画像処理プログラムの開発 (材料の表を参照してください).
    1. を確認してください、" MRI 網膜ツール " と " 多角形断面ツールの変更 " マクロがアクティブ。イメージを読み込みます。測定を開始する [m] ボタンをクリックします
      。 注: マクロ自動的に作成の 1 つ 0.2 mm 長さ、視神経の両側にカセットを測定します。キャリパーとしてその関数の各カセットは、5 の測定ポイントを含まれています。横方向の位置は変更できません、ラジアル スキャンで peripapilla 用にカスタマイズします。視神経/GCL の厚さを測定するカセットの水平方向の位置はあらかじめ定義されて代わりに GC の複雑な層を測定する簡単に変更可能です。スキャン品質が悪いかどうか、水平方向の位置は、調整が必要または画像を解析から除外する必要があります
      2. 。
    2. 水平調整 e ボタンをクリックしてください。新しくオープンした " ROI マネージャー " ウィンドウ、最初のカセットを選択します
      3. 。
    3. 青のポリゴンをクリックしてボタンをクリックし、画像で測定したレイヤーの枠線をクリックして最初のカセットの位置を調整します
      4. 。 最初に選択して
    4. 2 番目の繰り返しカセット、" ROI マネージャー " ウィンドウし、適切な画像をクリックします。再測定して r ボタンをクリックします。結果を表示、" 測定 " ウィンドウ
      。 注: 結果は、いつでもスプレッドシート ソフトウェア プログラムにコピーすることがあります。右カセット (r)、左カセット (l)、および合計に次の値が含まれている: Intden - カセット; 内集積密度Mm 2 で、測定エリアMm で、カセット内でキャリパーの長さカセット内の信号の強さをわけStd: 標準誤差信号の平均強度
      5. 。
    5. 次の画像に進みます
      6. 。
    6. さらにスプレッドシート ソフトウェア プログラム内のデータを分析します
      。 注: 層の平均厚みを見つけよう 10 Len の値を取る
      7. 。

結果

SD 10 月技術により網膜を想像し、組織に匹敵するが、高速厚解析、詳細 (図 3)。野生型 c57bl/6 マウスにもかかわらず SD OCT スキャンの品質が表示 (図 3 a右) は網膜断面 (図 3 a、左) のイメージのそれと同じくらい良いではない、それは複数の層 (例えばOLM) を可視化します。さらに、数日または数?...

ディスカッション

非侵襲的体内イメージング法、OCT システムは、高解像度の網膜クロス section のようなスキャンを提供します。したがって、その主な利点は、その潜在的な日常的にマウスのモデルに人間に適用されるプロトコルを転置する素晴らしい機会の詳細な分析です。

Opa1delTTAG変異マウスの例、SD 10 月結果 DOA 病態9のさらなる探鉱の視神経、...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この仕事に支えられた連合国デ Aveugles 網膜フランス、モンペリエ大学 Inserm et Déficients Visuels (UNADEV)、協会症候群・ デ ・ ウルフラム、財団を注ぐラ凝った Médicale 財団・ ド ・ フランスと卓越性の研究室EpiGenMed プログラム。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Mice
Opa1delTTAG mouseInstitute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France-Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging SystemBioptigen, Leica Microsystems, Germany-Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System SoftwareBioptigen, Leica Microsystems, Germany-Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48vWayne Rasband, National Institutes of Health, USA-Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plateBioseb, FranceBIO-062Protection against hypothermia
NameCompanyCatalog NumberComments
Supplies
Nose Band--Elastic band
Gauze pads 3"x3"Curad, USACUR20434ERBProtection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicatorEssence of Beauty, CVS Health Corporation, USA-Gel application
Cotton TwistsCentraVet, FranceT.7979C.CSMouse positioning
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%Laboratoires Europhtha, Monaco-Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%Laboratoires Théa, France3397908Eye dilatation
Cebesine 0.4%Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France3192342Local anesthesia
Imalgene 1000Merial, France/CentraVet, FranceIMA004General anesthesia
RompunBayer Healthcare, Germany/CentraVet, FranceROM001General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0,9%Laboratoire Osalia, France 103697114Physiological serum
Systene UltraAlcon, Novartis, USA-Hydration of eyes
GenTeal'Alcon, Novartis, USA-Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29Laboratoires Anios, France59844Desinfectant

参考文献

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  5. Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
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