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Resumen

Proporcionamos un protocolo generalizado basado en una estrategia de bioprinting de microfluidos para la ingeniería de un lecho vascular de microfibra, donde un tipo de célula secundaria podría ser más sembrado en el espacio intersticial de esta estructura de microfibra para generar organoides y tejidos vascularizados.

Resumen

Ingeniería de tejido vascularizado construye y organitas ha sido históricamente difícil. Aquí describimos un nuevo método basado en bioprinting de microfluidos para generar un andamio con microfibras de hidrogel del entrelazamiento de múltiples capas. Lisa bioprinting, un cabezal de impresión de microfluídica de envoltura de la base que contiene una formulación de compuesto bioink sacada el flujo de base y la solución de reticulación por el flujo de la vaina, fue diseñado y montado en el bioprinter. Mediante la mezcla de gelatina methacryloyl (GelMA) con alginato, un polisacárido que se somete a reticulación iónica instantáneo en presencia de seleccionar iones divalentes, seguidos por un photocrosslinking secundario del componente GelMA para lograr la estabilización permanente, un andamio de microfibra podría obtenerse utilizando esta estrategia bioprinting. Lo importante, las células endoteliales encapsuladas dentro de las microfibras de bioprinted pueden formar el lumen-como las estructuras que se asemejan a la vasculatura en el curso de cultura durante 16 días. El andamio de microfibra endotelizados puede utilizarse más como un lecho vascular para la construcción de un tejido vascularizado a través de la siembra posterior del tipo de celular de secundaria en el espacio intersticial de las microfibras. Bioprinting de microfluidos ofrece una estrategia generalizada en conveniente ingeniería de los tejidos vascularizados en alta fidelidad.

Introducción

Objetivos de ingeniería de tejidos para generar sustitutos de tejido funcional que pueden utilizarse para cambiar, restaurar o aumentar los heridos o enfermos en el cuerpo humano1,2,3,4, a menudo a través de una combinación de tipos de la célula deseada, moléculas bioactivas5,6y biomateriales7,8,9,10. Más recientemente, tecnologías de ingeniería de tejidos también se han adoptado cada vez más para generar en vitro la modelos órganos y tejidos que imitan las funciones importantes de sus contrapartes en vivo , para aplicaciones tales como desarrollo de fármacos, en reemplazo de la convencional célula planar excesivamente simplificadas culturas11,12,13,14,15,16,17,18,19. En ambas situaciones, la capacidad para recapitular la compleja microarquitectura y la estructura jerárquica de los tejidos humanos es fundamental para permitir la funcionalidad de los tejidos ingeniería10, y en particular, formas de integrar una red vascular en los tejidos diseñados son de demanda ya que la vascularización presenta uno de los mayores desafíos para el campo20,21,22,23.

Hasta la fecha, una variedad de enfoques se han desarrollado a este respecto en un intento de construir las estructuras de los vasos sanguíneos en tejido ingeniería construcciones con diversos grados de éxito8. Por ejemplo, montaje propio de células endoteliales permite para la generación de redes microvasculares24; suministro de factores de crecimiento angiogénico induce neovascularización sostenido25,26; uso de células progenitoras vasculares y pericitos facilita el crecimiento de la célula endotelial y Asamblea24,27; diseño de propiedades de andamio permite modulación precisa de vascularización28,29; y tecnología de pilas de la hoja permite una conveniente manipulación de capas vasculares30. Sin embargo, estas estrategias no dotar de la capacidad de controlar el patrón espacial de la vasculatura, a menudo conduce a una distribución aleatoria de los vasos sanguíneos en un tejido Ingeniería construcción y reproducibilidad limitada. Durante los últimos años bioprinting ha surgido como una clase de permitir tecnologías hacia la solución de este reto, debido a su versatilidad inigualable de depositar patrones tejido complejo en alta fidelidad y reproducibilidad en una manera automatizada o semi-automatizada31,32,33. Sacrificio bioprinting34,35,36,37,38, embedded bioprinting39,40,41y estructura hueco bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 tienen todos demostraron la factibilidad de generar tejidos vasculares o vascularizados.

Como alternativa, una estrategia de bioprinting de microfluidos para fabricar andamios de microfibra se han desarrollado recientemente, donde bioink de un híbrido compuesto de alginato y gelatina methacryloyl (GelMA) fue entregado a través del núcleo de un cabezal de impresión concéntrico y una solución de cloruro de calcio (CaCl2) se llevó a través del flujo de la vaina externa de la cabeza de impresora54,55. La coextrusión de dos flujos permitidos para la reticulación física inmediata del componente de alginato para permitir la formación de microfibra, mientras que photocrosslinking posterior había garantizado permanente estabilización del andamio multi-capa de microfibra. De nota, se encontraron células endoteliales encapsuladas dentro de las microfibras de bioprinted proliferan y migran hacia la periferia de los microfibers asumiendo lumen-como las estructuras que mímico el lecho vascular54,55. Estos bioprinted, camas endotelizados de vasculares podrían equiparse posteriormente con deseado tipos de célula secundaria para construir aún más los tejidos vascularizados55. Así, este protocolo proporciona un procedimiento detallado de tal microfluídicos bioprinting estrategia permitido por el diseño del inyector concéntrico, que asegura conveniente fabricación de tejidos vascularizados para posibles aplicaciones en la ingeniería de tejidos y modelos organoide.

Protocolo

Los cardiomiocitos neonatales de rata usados en este protocolo fueron aislados de ratas Sprague-Dawley de 2 días de edad siguiendo un procedimiento bien establecido56 aprobado por el cuidado institucional de animales y uso en el Hospital Brigham y de mujeres.

1. instrumentación de la Bioprinter

  1. Inserte una aguja embotada más pequeñas (por ejemplo, 27 G, 1 pulgada) como el núcleo en el centro de una aguja más grande de Roma (p. ej., 18 G, 1/2 pulgada) como la envoltura para la construcción de la doble capa, cabeza de impresora de microfluidos concéntricos; Asegúrese de que la aguja de núcleo sobresale ligeramente (~ 1 mm) más largo que la cáscara externa (figura 1A). La alineación generalmente se ajusta manualmente, pero si necesarios separadores de tamaño adecuado pueden ser intercalados temporal entre las agujas interior/exterior en la punta y los lados del cañón para ayudar a la alineación concéntrica. Sellar a la Unión de los barriles con pegamento epoxi y quite a los espaciadores de la alineación de la punta lado cuando sea aplicable.
  2. Inserte otra aguja (23G) en el cañón de la aguja central en la dirección contraria.  Entonces generar un agujero en el lado de la barra de la aguja externa e inserte un conector metálico de coincidencia de tamaño en el agujero, seguido por sellar con pegamento epoxi.
  3. Conecte las entradas de la cabeza de impresora para una bomba de la jeringuilla de doble canal para la inyección de la bioink y la solución de reticulación, individualmente, a través de dos tubos de PVC. Monte el estirador en la cabeza de un bioprinter con un soporte plástico de poly(methyl methacrylate) (PMMA).
    Nota: La selección de Bioprinter depende de la disponibilidad. En nuestro caso, hemos probado con éxito este programa de instalación en varios bioprinters disponibles en el mercado. Sin embargo, cualquier bioprinter que cuenta con una etapa de x-y-z motorizada, en principio, permitiría la integración de esta cabeza de impresora de microfluidos.

2. Bioprinting el lecho Vascular de microfibra

  1. Hacer el bioink con una mezcla de alginato (4 w/v%, baja viscosidad), gelatina methacryloyl (GelMA, w/v% 1-2)57,58y fotoiniciador Irgacure 2959 (0.2 - 0.5 wt.%) disuelto en 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] etano sulfónico ácido (tampón HEPES, pH 7.4) que contienen 10 vol.% suero bovino fetal (FBS).
  2. Hacer una solución de 0,3 M de CaCl2 en tampón HEPES que contiene 10 vol.% FBS como líquido portador de reticulación.
  3. Inmediatamente antes de bioprinting, disociar células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs) de los frascos mediante tratamiento 0,05 w/v% tripsina durante 5-10 min y resuspender las células en el bioink en una concentración de 5-10 × 106 células/mL. Pipetear la suspensión lentamente de 5 a 10 veces para asegurar una distribución homogénea.
  4. Iniciar la inyección del fluido bioink/reticulación usando una bomba de la jeringuilla de doble canal en el mismo caudal de 5 μl/mL. Los flujos se pueden permitir ejecutar continuamente para hasta 1 minuto hasta que estabilice. Posteriormente, iniciar el movimiento de la cabeza de impresora mediante el control de la bioprinter a una velocidad de deposición de aproximadamente 4 mm/s (figura 1B). Estas velocidades pueden necesitar fina sintonía con cada nueva configuración para asegurar óptima bioprinting. El proceso de bioprinting se lleva a cabo generalmente a temperatura ambiente (21-25 ° C), pero esta temperatura puede ser alterada. El proceso bioprinting debe permitir gelificación iónica rápida del componente de alginato y la deposición de un andamio de microfibra (figura 1B).
  5. Después de que el andamio sea bioprinted, lograr gelificación química por más photocrosslinking el componente GelMA, en aproximadamente 5-10 mW/cm2 de luz ultravioleta (360-480 nm) para 20-30 s (figura 1C).
  6. Tras el bioprinting y reticulación, enjuague suavemente el andamio con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el exceso de CaCl2. Cultura el andamio cargado de HUVECs microfibra en medio de crecimiento celular endotelial (EGM) en una incubadora a 37 ° C y 5 vol.% CO2 hasta 16 días con medio cambiado al menos cada 2 días. Supervisar las morfologías de HUVECs bajo un microscopio durante el período de cultivo.

3. construcción de los tejidos vascularizados

  1. Una vez el HUVECs han emigrado a la periferia de las microfibras en el andamio para formar el lumen-como las estructuras (figura 1D), recuperar el andamio y Coloque suavemente en la superficie de una superficie (por ejemplo, una losa de polymethylsiloxane [PDMS]). Utilice un trozo de papel de filtro estéril para extraer cuidadosamente el medio desde el espacio intersticial del andamio con la fuerza capilar.
  2. Inmediatamente añada una gota (aproximadamente 20-40 μL) de suspensión de un tipo de célula secundaria (p. ej., cardiomiocitos) en medio a una densidad de 10 1 × 106 células/mL sobre el andamio, que debe infiltrarse en todo el espacio intersticial del andamio (figura 1E). Incubar dicha configuración en una incubadora (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95% de humedad relativa) de 0.5 - 2 h para permitir que las células se adhieran a los microfibers individuales. Controlar el tamaño de las gotas durante el período para asegurar que no hay evaporación sensible se observa.
  3. Lave suavemente los andamios por agitación en un baño de PBS para quitar cualquier células no adherente y la construcción de la cultura en medio relevante hasta que sea formado el tejido vascularizado deseado.

Resultados

La estrategia de bioprinting de microfluidos permite bioprinting de extrusión directa de andamios de microfibra con baja viscosidad bioinks54,55. Como se ilustra en la figura 2A, un andamio con un tamaño de 6 × 6 × 6 m m que contiene3 > 30 capas de microfibras puede bioprinted dentro de 10 minutos. La reticulación iónica inmediata del componente de alginato con Ca...

Discusión

Construcción de la cabeza de impresora co-axial representa un paso crítico para bioprinting éxito microfluídicos para permitir la entrega simultánea de ambos el bioink de la base y el agente de reticulación de la vaina. Mientras que en el presente Protocolo un cabezal de impresión de ejemplo se creó utilizando una aguja de 27G como la base y una aguja de 18G como la cáscara, puede ser fácilmente extendido a una variedad de combinaciones de diferentes tamaños de agujas. Sin embargo, la alteración en los tamañ...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Los autores reconocen el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud vía a concesión de la independencia (K99CA201603).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Alginic acid sodium salt from brown algaeSigma-AldrichA0682BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skinSigma-AldrichG2500Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)Sigma-Aldrich41089698%
HEPES bufferSigma-AldrichH08871 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific10438026Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC5080BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered salineThermo Fisher Scientific10010023pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cellsAngio-ProteomiecAP-0001Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cellsAngio-ProteomiecAP-0001GFPGFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth mediumLonzaCC-3162EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific12430054High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kitEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGClear 0.5 kg Kit
UV curing lamp systemExcelitas TechnologiesOmniCure S2000Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

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