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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir bieten ein generalisiertes Protokoll basiert auf einer mikrofluidische Bioprinting Strategie für engineering-ein Microfibrous Kreislauf Bett, wo eine sekundäre Zelle Art weiter in den interstitiellen Raum dieser Microfibrous Struktur, vaskularisierte Gewebe und Organellen zu generieren ausgesät werden konnte.

Zusammenfassung

Vaskularisierte Gewebe-Engineering konstruiert und Organellen wurde historisch schwierig. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode basiert auf mikrofluidische Bioprinting um ein Gerüst mit mehrschichtigen interlacing Hydrogel Mikrofasern zu generieren. Um glatt zu erreichen war Bioprinting, ein Kern-Mantel mikrofluidischen Druckkopf enthält eine zusammengesetzte Bioink Formulierung aus den Kernfluss und die Vernetzung Lösung durchgeführt durch die Scheide-Fluss, extrudiert entworfen und auf die Bioprinter ausgestattet. Durch das Mischen Gelatine Methacryloyl (GelMA) mit Alginat, ein Polysaccharid, das momentane ionische Vernetzung in Anwesenheit von erfährt wählen Sie zweiwertige Ionen, gefolgt von einer sekundären Photocrosslinking der GelMA Komponente zur dauerhaften Stabilisierung zu erreichen, ein Microfibrous Gerüst konnte mit dieser Strategie der Bioprinting abgerufen werden. Wichtig ist, können die Endothelzellen gekapselt im Inneren der Bioprinted Mikrofasern die Lumen-ähnliche Strukturen wie das Gefäßsystem im Laufe der Kultur für 16 Tage bilden. Das endothelialized Microfibrous Gerüst kann als vaskuläre Bett weiterverwendet werden, um eine vaskularisierte Gewebe durch anschließende Aussaat des sekundären Zelltyps in den interstitiellen Raum der die Mikrofasern zu konstruieren. Mikrofluidische Bioprinting bietet eine allgemeine Strategie bequem Engineering vaskularisierte Gewebe bei High Fidelity.

Einleitung

Tissue engineering Ziele Funktionsgewebe Ersatzstoffe zu generieren, die verwendet werden können, um zu ersetzen, wiederherstellen oder ergänzen diese verletzten oder erkrankten in den menschlichen Körper1,2,3,4, oft durch eine Kombination der gewünschten Zelltypen, bioaktive Moleküle5,6und Biomaterialien7,8,9,10. Vor kurzem haben Gewebe-engineering-Technologien auch zunehmend angenommen, um in-vitro- Gewebe und Organ Modelle generieren, die wichtigen Funktionen von ihren Kollegen in Vivo für Anwendungen wie die Medikamentenentwicklung, Ersatz von konventionellen vereinfachenden planar Zelle Kulturen11,12,13,14,15,16,17,18,19zu imitieren. In beiden Situationen die Fähigkeit, komplexe Mikroarchitektur und hierarchische Struktur der menschlichen Gewebe rekapitulieren ist entscheidend in die Lage versetzen Funktionalität der technischen Gewebe10, und Möglichkeiten, um den technischen Geweben eine vaskuläre Netzwerk integrieren sind insbesondere der Nachfrage da Vaskularisierung eine der größten Herausforderungen auf dem Feld20,21,22,23 stellt.

Bis heute eine Vielzahl von Ansätzen wurden entwickelt in diesem Zusammenhang in einem Versuch, Blutgefäß Strukturen in veränderter Gewebe Konstrukte mit unterschiedlichem Erfolg8zu bauen. Beispielsweise können Selbstmontage von Endothelzellen zur Erzeugung von mikrovaskulären Netze24; Lieferung von angiogene Wachstumsfaktoren induziert nachhaltige Neovaskularisation25,26; Verwenden von vaskulären Vorläuferzellen und Perizyten erleichtert endothelial Zelle Wachstum und Montage24,27; Gestaltung von Gerüst Eigenschaften ermöglicht präzise Modulation der Vaskularisierung28,29; und Blatt-Zelltechnologie ermöglicht die bequeme Manipulation von vaskulären Schichtung30. Dennoch diese Strategien nicht die Fähigkeit zur Steuerung der räumlichen Strukturierung des Gefäßsystems, führt häufig zu zufälligen Verteilung der Blutgefäße innerhalb ein veränderter Gewebe Konstrukt und damit begrenzte Reproduzierbarkeit verleihen. In den letzten Jahren hat eine Klasse von Basistechnologien zur Lösung so eine Herausforderung, durch ihre unvergleichliche Vielseitigkeit der Hinterlegung komplexe Gewebe Muster am High Fidelity und Reproduzierbarkeit in eine automatisierte oder halbautomatisierte Weise31,32,33Bioprinting entwickelt. Opfer Bioprinting34,35,36,37,38, eingebettete Bioprinting39,40,41und hohlen Struktur Bioprinting/Biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 haben alle bewiesen die Machbarkeit Gefäß- oder vaskularisierte Gewebe zu erzeugen.

Alternativ eine mikrofluidischen Bioprinting Strategie, Microfibrous Gerüste zu fabrizieren vor kurzem entwickelt worden, wo ein Hybrid-Bioink bestehend aus Alginat und Gelatine Methacryloyl (GelMA) wurde durch den Kern einer konzentrischen Druckkopf und einen Kalzium-Chlorid (CaCl2) Lösung geliefert erfolgte durch den Außenmantel Fluss der Druckkopf54,55. Die Co-Extrusion der zwei Ströme durfte für sofortige physikalische Vernetzung der Alginat Komponente Mikrofaser Bildung zu ermöglichen, während spätere Photocrosslinking dauerhafte Stabilisierung der mehrschichtigen Microfibrous Gerüst gewährleistet. Der Hinweis fanden sich Endothelzellen gekapselt innerhalb der Bioprinted-Mikrofasern zu vermehren und migrieren zu den Peripherien der Mikrofasern vorausgesetzt Lumen-ähnliche Strukturen, die die vaskuläre Bett54,55nachgeahmt. Diese Bioprinted endothelialized vaskuläre Betten konnte anschließend gefüllt mit gewünschten weiterführenden Zelltypen, vaskularisierte Gewebe55weiter zu bauen. Dieses Protokoll bietet somit ein detailliertes Verfahren einer solchen mikrofluidische Bioprinting Strategie durch die konzentrische Düse Design, sorgt für bequeme Herstellung von vaskularisierte Gewebe für potenzielle Anwendungen in der Gewebetechnik und organoide Modellierung ermöglicht.

Protokoll

Der neonatalen Ratte Herzzellen in diesem Protokoll verwendeten wurden isoliert von 2 Tage alten Sprague-Dawley Ratten nach einem etablierten Verfahren56 durch die institutionelle Animal Care and Use Committee am Brigham and Women es Hospital genehmigt.

1. Instrumente der Bioprinter

  1. Legen Sie eine kleinere stumpfe Nadel (z.B., 27 G, 1 Zoll) als Kern in der Mitte einer größeren stumpfen Nadel (z.B., 18 G, ½ Zoll) als die Hülle, die Dual-Layer-, konzentrische mikrofluidischen Druckkopf zu konstruieren; Stellen Sie sicher, dass die Kern-Nadel leicht hervorstehenden ist (~ 1 mm) länger als die äußere Hülle (Abb. 1A). Die Ausrichtung ist in der Regel manuell eingestellt, aber können wenn notwendig Abstandhalter der richtige Größen zeitlich zwischen der inneren/äußeren Nadeln auf die Spitze und die Lauf-Seiten gerne konzentrische Ausrichtung eingeklemmt werden. Versiegeln der Kreuzung der Fässer mit Epoxy-Kleber und die Ausrichtung Abstandhalter aus der Spitze Seite ggf. entfernen.
  2. Setzen Sie eine andere Nadel (23G) in den Lauf der zentralen Nadel in umgekehrter Richtung.  Dann erzeugen ein Loch seitlich auf dem Lauf der äußere Nadel und legen Sie einen Metallstecker der passenden Größe in das Loch, gefolgt von Versiegelung mit Epoxy-Kleber.
  3. Verbinden Sie die Eingänge des Druckkopfes auf eine Zweikanal-Spritzenpumpe für die Injektion der Bioink und der Vernetzung-Lösung individuell, durch zwei PVC-Rohre. Montieren Sie den Extruder auf den Kopf des einen Bioprinter mit einer Kunststoff-Halter von Poly(methyl methacrylate) (PMMA) gemacht.
    Hinweis: Bioprinter Auswahl richtet sich nach Verfügbarkeit. In unserem Fall haben wir dieses Setup auf mehreren im Handel erhältlichen Bioprinters erfolgreich getestet. Jedoch sollte jede Bioprinter, die einem X-y-Z motorisierten Stadium verfügt über im Prinzip Integration von diesem mikrofluidischen Druckkopf machen.

(2) Bioprinting Microfibrous vaskulären Bettes

  1. Machen die Bioink mit einer Mischung aus Alginat (4 w/v%, niedrige Viskosität), Gelatine Methacryloyl (GelMA, 1-2 w/v%)57,58und Photoinitiator Irgacure 2959 (0,2 - 0,5 wt.%) aufgelöst in 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) Piperazin-1-Yl] Ethan Sulfonsäure (HEPES-Puffer, pH 7.4) mit 10 vol.% fetalen bovine Serum (FBS).
  2. Machen Sie eine Lösung von 0,3 M CaCl2 in HEPES-Puffer mit 10 vol.% FBS als Trägerflüssigkeit Vernetzung.
  3. Unmittelbar vor Bioprinting menschliche Nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) aus den Kolben mit Behandlung von 0,05 w/v% Trypsin für ca. 5-10 min zu distanzieren und Aufschwemmen der Zellen in der Bioink in einer Konzentration von 5-10 × 106 Zellen/mL. Pipette die Suspension langsam 5 bis 10 Mal um homogene Verteilung zu gewährleisten.
  4. Starten Sie die Injektion von Bioink/Vernetzung Flüssigkeit mit einem Zweikanal-Spritzenpumpe an die gleiche Volumenströme von 5 µL/mL. Die Ströme können dürfen kontinuierlich für bis zu 1 min laufen lassen, bis sie stabilisieren. Anschließend starten Sie die Bewegung des Druckkopfes durch die Kontrolle der Bioprinter Abscheidung Geschwindigkeiten von ca. 4 mm/s (Abbildung 1B). Diese Geschwindigkeiten können feine müssen tuning mit jeder neuen Setup, um optimale Bioprinting zu gewährleisten. Der Bioprinting-Prozess erfolgt in der Regel bei Raumtemperatur (21-25 ° C), aber diese Temperatur kann verändert werden. Der Bioprinting Prozess sollte schnell Ionischen Gelierung der Alginat-Komponente und Ablagerung von ein Microfibrous Gerüst (Abbildung 1B) ermöglichen.
  5. Nachdem das Gerüst Bioprinted ist, erreichen Sie chemische Gelierung durch weitere Photocrosslinking der GelMA Komponente, auf etwa 5 bis 10 mW/cm2 von UV-Licht (360-480 nm) für 20-30 s (Abbildung 1C).
  6. Spülen Sie nach der Bioprinting und Vernetzung sanft das Gerüst mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die überschüssige CaCl2zu entfernen. Kultur das Mediumwechsel beladenen Microfibrous Gerüst in Endothelzellen Wachstumsmedium (EGM) in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 vol.% CO2 für bis zu um 16 Tage mit Medium verändert mindestens alle 2 Tage. Überwachen Sie die Morphologien Mediumwechsel unter dem Mikroskop während der Kulturdauer.

3. bauen die vaskularisierte Gewebe

  1. Sobald die Mediumwechsel auf den Peripherien von Mikrofasern in das Gerüst, um die Lumen-ähnliche Strukturen (Abbildung 1-D) bilden migriert haben, rufen Sie das Gerüst und legen Sie sie vorsichtig auf die Oberfläche einer hydrophoben Oberfläche (z.B. eine Platte aus Polymethylsiloxane [PDMS]). Verwenden Sie ein Stück des sterilen Filterpapiers, entfernen Sie vorsichtig das Medium aus dem interstitiellen Raum des Gerüstes mit Kapillare Kraft.
  2. Sofort Tropfen Sie einen (ca. 20-40 µL) Aussetzung der sekundären Zelltyp (z.B. Herzzellen) im Medium bei einer Dichte von 1-10 × 106 Zellen/mL auf das Gerüst, das die gesamte Zwischenraum des Gerüstes (Abbildung 1E) infiltrieren sollte. Inkubieren Sie eine solche Konfiguration in einem Inkubator (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95 % Relative Luftfeuchtigkeit) für 0,5 - 2 h damit die Zellen auf die einzelnen Mikrofasern halten. Überwachen Sie die Tropfengröße im Zeitraum um sicherzustellen, dass keine spürbaren Verdunstung beobachtet wird.
  3. Vorsichtig Waschen der Gerüste durch Schütteln in einem PBS-Bad, nicht-anhaftende Zellen und Kultur das Konstrukt im jeweiligen Medium zu entfernen, bis das gewünschte vaskularisierte Gewebe gebildet wird.

Ergebnisse

Mikrofluidische Bioprinting Strategie ermöglicht Direktextrusion Bioprinting Microfibrous Gerüste mit dünnflüssigen Bioinks54,55. Wie in Abbildung 2A, ein Gerüst mit einer Größe von 6 × 6 × 6 mm mit3 > 30 Schichten aus Mikrofasern Bioprinted innerhalb von 10 min werden könnte. Die sofortige ionische Vernetzung der Alginat-Komponente mit CaCl2 erlaub...

Diskussion

Bau der co-axial Druckkopf ist einen entscheidender Schritt in Richtung erfolgreiche mikrofluidische Bioprinting, um gleichzeitige Lieferung sowohl die Bioink aus dem Kern und der Vernetzungsmittel aus der Scheide zu ermöglichen. Während in diesem Protokoll mit einer 27G Nadel als Kern und einer 18G-Nadel als Shell ein Beispiel Druckkopf erstellt wurde, kann es leicht zu einer Vielzahl von Kombinationen mit verschiedenen Größen der Nadeln verlängert werden. Die Veränderung in der Nadel-Größen, die Ergebnisse in d...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren erkennen des National Cancer Institute von der nationalen Institute der Gesundheit Weg zur Unabhängigkeit Award (K99CA201603).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Alginic acid sodium salt from brown algaeSigma-AldrichA0682BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skinSigma-AldrichG2500Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)Sigma-Aldrich41089698%
HEPES bufferSigma-AldrichH08871 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific10438026Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC5080BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered salineThermo Fisher Scientific10010023pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cellsAngio-ProteomiecAP-0001Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cellsAngio-ProteomiecAP-0001GFPGFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth mediumLonzaCC-3162EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific12430054High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kitEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGClear 0.5 kg Kit
UV curing lamp systemExcelitas TechnologiesOmniCure S2000Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

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