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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Forniamo un protocollo generalizzato basato su una strategia di multimateriali microfluidici per un letto vascolare di microfibrous, dove un tipo di cellula secondaria potrebbe essere ulteriormente seminato nello spazio interstiziale di questa struttura di microfibrous per generare organoids e tessuti vascolarizzati di ingegneria.

Abstract

Vascularized del tessuto di ingegneria costruisce e organoids è stato storicamente impegnativo. Qui descriviamo un nuovo metodo basato su microfluidici multimateriali per generare un'impalcatura con interlacciamento idrogel microfibre di multistrato. Per raggiungere liscia multimateriali, contenente una formulazione bioink composito estrusa dal flusso di anima e la soluzione di reticolazione trasportato dal flusso di guaina, una testina di stampa per la microfluidica core-guaina è stato progettato e montato sulla bioprinter. Mescolando la gelatina methacryloyl (GelMA) con alginato, selezionare un polisaccaride che subisce la reticolazione istantanea ionico in presenza di ioni bivalenti, seguiti da un photocrosslinking secondario del componente GelMA di ottenere stabilizzazione permanente, un'impalcatura di microfibrous poteva essere ottenuta usando questa strategia multimateriali. D'importanza, le cellule endoteliali incapsulate all'interno delle microfibre bioprinted possono formare il lume-come le strutture che assomiglia al sistema vascolare nel corso di cultura per 16 giorni. L'impalcatura endotelizzati microfibrous può essere ulteriormente utilizzato come un letto vascolare per costruire un tessuto vascolarizzato attraverso successive semina del tipo cella secondaria nello spazio interstiziale delle microfibre. Microfluidica multimateriali fornisce una strategia generalizzata in conveniente ingegneria dei tessuti vascolarizzati in alta fedeltà.

Introduzione

Obiettivi ingegneria del tessuto per generare sostituti del tessuto funzionale che possono essere utilizzati per sostituire, ripristinare o aumentare quelli feriti o malati nel corpo umano1,2,3,4, spesso attraverso una combinazione di tipi di cella desiderata, molecole bioattive5,6e biomateriali7,8,9,10. Più recentemente, tecnologie di ingegneria del tessuto inoltre sono state sempre più adottate per generare in vitro del tessuto e dell'organo modelli che simulano le funzioni importanti delle loro controparti in vivo , per applicazioni quali lo sviluppo di farmaci, in sostituzione del convenzionale cella planare troppo semplificata culture11,12,13,14,15,16,17,18,19. In entrambe le situazioni, la capacità di ricapitolare la microarchitettura complesso e la struttura gerarchica dei tessuti umani è fondamentale per l'attivazione di funzionalità dei tessuti ingegnerizzati10, e in particolare, ci sono modi per integrare una rete vascolare nei tessuti ingegnerizzati sono della domanda poiché vascolarizzazione presenta una delle più grandi sfide per il campo20,21,22,23.

Ad oggi, una varietà di approcci sono stati sviluppati a questo proposito nel tentativo di costruire strutture di vaso sanguigno in costrutti di tessuto ingegnerizzato con vari gradi di successo8. Ad esempio, auto-assemblaggio delle cellule endoteliali che consente per la generazione di reti microvascolare24; consegna di fattori di crescita angiogenici induce neovascolarizzazione sostenuta25,26; uso di cellule progenitrici vascolari e periciti facilita la crescita delle cellule endoteliali e Assemblea24,27; progettazione di scaffold proprietà consente una modulazione precisa della vascolarizzazione28,29; e cella foglio tecnologia consente la manipolazione conveniente di stratificazione vascolare30. Tuttavia, queste strategie non conferire la possibilità di controllare la campitura spaziale del sistema vascolare, conducente spesso alla distribuzione casuale dei vasi sanguigni all'interno di un costrutto di tessuto ingegnerizzato e così limitata riproducibilità. Durante questi ultimi anni multimateriali sono emerso come una classe di tecnologie verso la soluzione di una tale sfida, grazie alla loro versatilità senza pari di modelli complessi tessuto ad alta fedeltà e riproducibilità di deposito in un modo automatico o semi-automatico31,32,33. Multimateriali sacrificale34,35,36,37,38, embedded multimateriali39,40,41e struttura cava multimateriali/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 hanno tutti dimostrato la fattibilità di generazione dei tessuti vascolari o vascularized.

In alternativa, una strategia di multimateriali microfluidici per fabbricare microfibrous ponteggi sono state recentemente sviluppate, dove un bioink ibrido composto di alginato e gelatina methacryloyl (GelMA) è stato consegnato attraverso il nucleo di una testina di stampa concentrico e una soluzione di cloruro di calcio (CaCl2) è stato trasportato attraverso il flusso di guaina esterna della testina di stampa54,55. La co-estrusione dei due flussi di permesso per reticolazione fisica immediata del componente alginato per consentire la formazione in microfibra, mentre photocrosslinking successivi assicurata stabilizzazione permanente dell'impalcatura multistrato microfibrous. Di nota, cellule endoteliali incapsulate all'interno delle microfibre di bioprinted sono state trovate a proliferare e migrare verso le periferie delle microfibre assumendo lumen-come le strutture che ha imitato il letto vascolare54,55. Questi bioprinted, endotelizzati letti vascolari potrebbero essere successivamente popolati con desiderato tipi di cella secondaria ulteriormente costruire tessuti vascolarizzati55. Questo protocollo fornisce così una procedura dettagliata di tale microfluidici multimateriali strategia attivata dal design ugello concentrici, che assicura conveniente fabbricazione di tessuti vascolarizzati per potenziali applicazioni in ingegneria tissutale e modellazione organoid.

Protocollo

I cardiomiociti neonatali del ratto utilizzati nel presente protocollo sono stati isolati dai ratti Sprague-Dawley 2-giorno-vecchio seguendo una procedura consolidata56 approvato dal comitato di utilizzo presso il Brigham and Women Hospital e istituzionali Animal Care.

1. strumentazione del Bioprinter

  1. Inserire un ago più piccolo (ad es., 27 G, 1 pollice) come il nucleo nel centro di un ago più grande (ad es., 18 G, ½ pollice) come la guaina per costruire il doppio strato, microfluidica concentrici della testina di stampa; Assicurarsi che l'ago di nucleo è che sporge leggermente (~ 1 mm) più lungo il guscio esterno (Figura 1A). L'allineamento viene in genere regolata manualmente, ma se necessari distanziali di dimensioni appropriate possono essere temporaneamente spiaccicati tra gli aghi interno/esterno sia sulla punta e ai lati del barilotto per assistere allineamento concentrico. Sigillare la giunzione delle canne con colla a resina epossidica e rimuovere i distanziali di allineamento dal lato di punta, quando applicabile.
  2. Inserire un altro ago (23G) nella canna dell'ago centrale in direzione inversa.  Quindi generare un foro lateralmente alla canna dell'ago esterno e inserire un connettore metallico delle corrispondenti dimensioni nel foro, seguito da chiusura con colla a resina epossidica.
  3. Collegare le insenature della testina di stampa ad una pompa di doppio canale siringa per l'iniezione del bioink e la soluzione di reticolazione, singolarmente, attraverso due tubi in PVC. Montare l'estrusore sulla testa di un bioprinter utilizzando un supporto di plastica fatto di poly(methyl methacrylate) (PMMA).
    Nota: Bioprinter selezione dipende dalla disponibilità. Nel nostro caso, abbiamo testato con successo questa installazione su diversi bioprinters disponibili in commercio. Tuttavia, qualsiasi bioprinter che dispone di un tavolino motorizzato di x-y-z dovrebbe, in linea di principio, abilitare l'integrazione di questa testina di stampa di microfluidica.

2. multimateriali il letto vascolare Microfibrous

  1. Rendere il bioink usando una miscela di alginato (4 w/v%, bassa viscosità), gelatina methacryloyl (GelMA, w/v% 1-2)57,58e fotoiniziatore Irgacure 2959 (0,2 - 0,5 wt.%) disciolto in 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] etano acido solfonico (tampone HEPES, pH 7.4) contenente 10 vol.% siero bovino fetale (FBS).
  2. Rendono una soluzione 0.3 M CaCl2 in tampone HEPES contenente 10 vol.% FBS come fluido vettore reticolazione.
  3. Immediatamente prima di multimateriali, dissociare le cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) dai palloni mediante trattamento di 0.05 w/v% tripsina per 5-10 min e risospendere le cellule in bioink ad una concentrazione di 5-10 × 106 cellule/mL. Pipettare lentamente da 5 a 10 volte la sospensione per garantire una distribuzione omogenea.
  4. Avviare l'iniezione del fluido bioink/reticolazione utilizzando una pompa a siringa a doppio canale alle stesse tariffe del flusso da 5 µ l/mL. I flussi possono correre continuamente per fino a 1 min fino a quando non si stabilizzano. Successivamente, avviare il movimento della testina di stampa controllando il bioprinter ad una velocità di deposizione di circa 4 mm/s (Figura 1B). Queste velocità possono bisogno di fine tuning con ogni nuova impostazione per garantire ottimale multimateriali. Il processo di multimateriali solitamente viene condotto a temperatura ambiente (21-25 ° C) ma questa temperatura può essere alterata. Il processo di multimateriali dovrebbe consentire veloce ionico gelificazione del componente alginato e deposizione di un ponteggio microfibrous (Figura 1B).
  5. Dopo il patibolo è bioprinted, è possibile raggiungere gelificazione chimica di ulteriore photocrosslinking il componente GelMA, a circa 5-10 mW/cm2 di luce UV (360-480 nm) per 20-30 s (Figura 1C).
  6. Seguito multimateriali e reticolazione, sciacquare delicatamente il patibolo con tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere l' eccesso di CaCl2. Cultura il patibolo HUVECs-carichi microfibrous nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali (EGM) in un incubatore a 37 ° C e 5 vol.% CO2 per fino a 16 giorni con il mezzo ha cambiato almeno ogni 2 giorni. Monitorare le morfologie di HUVECs sotto un microscopio durante il periodo di coltura.

3. costruire i tessuti vascolarizzati

  1. Una volta che il HUVECs sono migrati verso le periferie delle microfibre in patibolo per formare il lume-come le strutture (Figura 1D), recuperare il patibolo e inserirlo delicatamente sulla superficie di una superficie idrofoba (ad esempio, una lastra di polymethylsiloxane [PDMS]). Utilizzare un pezzo di carta da filtro sterile per rimuovere accuratamente tutti i media da spazio interstiziale dell'impalcatura con forza capillare.
  2. Immediatamente aggiungere una goccia (circa 20-40 µ l) di sospensione di un tipo di cellula secondaria (ad es., cardiomiociti) in mezzo ad una densità di 1-10 × 106 cellule/mL in cima l'impalcatura, che deve infiltrarsi l'intero spazio interstiziale dell'impalcatura (Figura 1E). Incubare tale configurazione in un'incubatrice (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95% di umidità relativa) per 0,5 - 2 h per consentire alle cellule di aderire sulle microfibre individuali. Monitorare la dimensione delle gocce durante il periodo che nessun notevole evaporazione sia rispettato.
  3. Lavare delicatamente i ponteggi agitando in un bagno di PBS per rimuovere eventuali cellule non aderenti e la cultura il costrutto in mezzo rilevante fino a formare il tessuto vascolarizzato desiderato.

Risultati

La strategia di multimateriali microfluidici consente per estrusione diretta multimateriali di ponteggi di microfibrous utilizzando bassa viscosità bioinks54,55. Come illustrato nella Figura 2A, un'impalcatura con una dimensione di 6 × 6 × 6 mm3 contenente > 30 strati di microfibre potrebbero essere bioprinted entro 10 min. La reticolazione immediata ionica del compo...

Discussione

Costruzione della testina di stampa co-axial rappresenta un passo fondamentale verso il successo microfluidici multimateriali per consentire per la consegna simultanea di entrambe le bioink dal nucleo e l'agente di reticolazione dalla guaina. Mentre in questo protocollo un testina di stampa di esempio è stato creato utilizzando un ago da 27G come il nucleo e un ago da 18G come la shell, può essere facilmente estesa ad una varietà di combinazioni con diverse dimensioni di aghi. Tuttavia, l'alterazione nelle dimensioni ...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono il National Cancer Institute della istituti nazionali di salute via indipendenza Award (K99CA201603).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Alginic acid sodium salt from brown algaeSigma-AldrichA0682BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skinSigma-AldrichG2500Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)Sigma-Aldrich41089698%
HEPES bufferSigma-AldrichH08871 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific10438026Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC5080BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered salineThermo Fisher Scientific10010023pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cellsAngio-ProteomiecAP-0001Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cellsAngio-ProteomiecAP-0001GFPGFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth mediumLonzaCC-3162EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific12430054High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kitEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGClear 0.5 kg Kit
UV curing lamp systemExcelitas TechnologiesOmniCure S2000Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

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