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Resumo

Nós fornecemos um protocolo generalizado, baseado em uma estratégia de bioprinting microfluidic para engenharia uma cama vascular microfibrous, onde um tipo da pilha secundária poderia ser mais propagado para o espaço intersticial dessa estrutura microfibrous para gerar organoids e tecidos vascularizados.

Resumo

Engenharia de tecido vascularizado constrói e organoids tem sido historicamente desafiador. Aqui descrevemos um romance método baseado na microfluidic bioprinting para gerar um andaime com multicamadas entrelaçamento microfibras de hidrogel. Para alcançar o liso, bioprinting, uma cabeça de impressão do núcleo-bainha microfluidic contendo uma formulação bioink composto extrudada de fluxo do núcleo e a solução de reticulação levado pelo fluxo da bainha, foi projetada e montada sobre o bioprinter. Misturando a gelatina methacryloyl (GelMA) com alginato, selecione de um polissacarídeo que sofre instantânea reticulação iônica na presença de íons divalentes, seguidos por um photocrosslinking secundário do componente GelMA para conseguir a estabilização permanente, um andaime de microfibrous pode ser obtido usando esta estratégia bioprinting. Importante, as células endoteliais encapsuladas dentro as microfibras de bioprinted podem formar as lúmen-como estruturas assemelhando-se a vasculatura ao longo da cultura por 16 dias. O andaime microfibrous endotelializados pode ser mais usado como um leito vascular para construir um tecido vascularizado através de semeadura subsequentes do tipo celular secundária para o espaço intersticial das microfibras. Bioprinting microfluidic fornece uma estratégia generalizada em conveniente engenharia de tecidos vascularizados em alta fidelidade.

Introdução

Metas de engenharia de tecido para gerar substitutos de tecido funcional que podem ser usados para substituir, restaurar ou aumentar os feridos ou doentes no corpo humano1,2,3,4, muitas vezes através de uma combinação de tipos de células desejada e moléculas bioativas5,6biomateriais7,8,9,10. Mais recentemente, as tecnologias de engenharia de tecido também cada vez mais adoptaram para gerar em vitro tecidos e órgãos modelos que imitam as funções importantes de suas contrapartes na vivo , para aplicações tais como desenvolvimento de drogas, em substituição a célula planar simplificada convencional culturas11,12,13,14,15,16,17,18,19. Em ambas as situações, a capacidade de recapitular a microarquitetura complexa e estrutura hierárquica dos tecidos humanos é fundamental para ativar a funcionalidade dos tecidos projetados10, e em particular, maneiras de integrar uma rede vascular para os tecidos projetados são da demanda desde vascularização apresenta um dos maiores desafios ao campo21,20,22,23.

Até à data, uma variedade de abordagens têm sido desenvolvidas nesse sentido na tentativa de construir estruturas de vaso sanguíneo em construções de engenharia de tecidos, com vários graus de sucesso8. Por exemplo, auto-montagem de células endoteliais permite a geração de redes microvascular24; entrega de fatores de crescimento angiogênico induz neovascularização sustentado25,,26; uso de células progenitoras vascular e pericitos facilita o crescimento de células endoteliais e montagem24,27; projetar o andaime Propriedades permite a modulação precisa da vascularização28,,29; e tecnologia de células de folha permite a manipulação conveniente de camadas vasculares30. No entanto, estas estratégias não dotam a capacidade de controlar a padronização espacial da vasculatura, muitas vezes levando a distribuição aleatória dos vasos sanguíneos dentro de uma construção da engenharia de tecidos e, portanto, limitado a reprodutibilidade. Durante os últimos anos bioprinting tem emergido como uma classe de tecnologias para a solução de um grande desafio, devido a sua versatilidade incomparável de depositar os padrões de tecido complexo em alta fidelidade e reprodutibilidade em um modo automático ou semi-automático31,32,33capacitantes. Sacrificial bioprinting34,35,36,37,38, incorporado bioprinting39,40,41e estrutura oca bioprinting/biofabrication42,,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 tem tudo o que demonstrou a viabilidade de geração de tecidos vasculares ou vascularizados.

Como alternativa, uma estratégia de bioprinting microfluidic para fabricar andaimes microfibrous foram recentemente desenvolvidos, onde bioink um híbrido composto de alginato e gelatina methacryloyl (GelMA) foi entregue através do núcleo de uma cabeça de impressão concêntrica e uma solução de cloreto de cálcio (CaCl2) foi realizado o fluxo da bainha externa do cabeçote de impressão54,55. A co-extrusão dos dois fluxos permitidas reticulação física imediata do componente alginato para permitir formação de microfibra, enquanto photocrosslinking subsequente assegurada estabilização permanente do cadafalso multi camada microfibrous. Digno de nota, células endoteliais, encapsuladas nas microfibras de bioprinted foram encontradas a proliferar e migrar para as periferias das microfibras assumindo lúmen-como estruturas que imitava a cama vascular54,55. Estes bioprinted, camas vasculares endotelializadas poderiam ser posteriormente preenchidas com desejado tipos de células secundárias mais construir tecidos vascularizados55. Assim, este protocolo fornece um procedimento detalhado de uma estratégia deste tipo microfluidic bioprinting habilitado pelo design concêntrico do bocal, que garante a fabricação conveniente dos tecidos vascularizados para potenciais aplicações em engenharia de tecidos e modelagem de organoides.

Protocolo

Os rato neonatal cardiomyocytes utilizados neste protocolo foram isoladas de ratos Sprague-Dawley de 2 dias de idade seguindo um procedimento bem estabelecido56 aprovado pelo Comité de uso do hospital Brigham e feminino e cuidado institucional do Animal.

1. instrumentação da Bioprinter

  1. Inserir uma agulha menor (por exemplo, 27G, 1 polegada) como o núcleo do centro de uma agulha maior (por exemplo, 18g, ½ polegada) como a bainha para construir a camada dupla, concêntrico microfluidic cabeçote de impressão; Certifique-se que a agulha do núcleo está projetando-se ligeiramente (~ 1mm) mais do que o escudo exterior (Figura 1A). O alinhamento é geralmente ajustado manualmente, mas se necessário espaçadores de tamanhos apropriados podem ser temporalmente imprensados entre as agulhas interior/exterior em ambos a ponta e os lados de barril para auxiliar o alinhamento concêntrico. Selar a junção dos barris com cola epóxi e retire os espaçadores de alinhamento do lado de ponta, quando aplicável.
  2. Introduza outra agulha (23G) no cano da agulha central na direção inversa.  Em seguida, gerar um buraco do lado do barril da agulha exterior e inserir um conector de metal de tamanho de correspondência para o buraco, seguido de selagem com cola epóxi.
  3. Conecte as entradas do cabeçote de impressão para uma bomba de seringa de canal duplo para injeção do bioink e a solução de reticulação, individualmente, através de dois tubos de PVC. Monte a extrusora para a cabeça de um bioprinter usando um suporte de plástico feito de poly(methyl methacrylate) (PMMA).
    Nota: Bioprinter seleção depende de disponibilidade. No nosso caso, nós testamos com sucesso esta configuração em vários bioprinters comercialmente disponíveis. No entanto, qualquer bioprinter que apresenta uma fase de x-y-z motorizada deve, em princípio, permitem a integração deste cabeçote microfluidic.

2. Bioprinting a cama Vascular Microfibrous

  1. Fazer o bioink usando uma mistura de alginato (4 w/v%, baixa viscosidade), gelatina de57,methacryloyl (GelMA, w/v% 1-2)58e fotoiniciador Irgacure 2959 (0,2 - 0,5 wt.%) dissolvido em 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] etano sulfônico (HEPES buffer, pH 7,4) contendo 10 vol.% fetal soro bovino (FBS).
  2. Faça uma solução de 0,3 M CaCl2 em tampão HEPES contendo 10 vol.% FBS como o fluido portador de reticulação.
  3. Imediatamente antes de bioprinting, dissociar a veia umbilical humana células endoteliais (HUVECs) dos balões usando tratamento por 0.05 w/v% tripsina, por 5-10 min e ressuspender as células no bioink na concentração de 5-10 × 106 células/mL. Pipete a suspensão lentamente de 5 a 10 vezes para assegurar uma distribuição homogénea.
  4. Inicie a injeção de fluido bioink/reticulação usando uma bomba de seringa dual channel às mesmas taxas de fluxo de 5 µ l/mL. Os fluxos podem ser autorizados a executar continuamente para até 1 min até estabilizar. Posteriormente, inicie o movimento do cabeçote de impressão, controlando o bioprinter a uma velocidade de deposição de aproximadamente 4 mm/s (Figura 1B). Estas velocidades podem precisar bem sintonia com cada nova instalação para assegurar a bioprinting ideal. O processo de bioprinting é normalmente conduzido à temperatura (21-25 ° C), mas esta temperatura pode ser alterada. O processo de bioprinting deverá permitir rápido iônica gelificação do componente alginato e deposição de um andaime de microfibrous (Figura 1B).
  5. Após o andaime é bioprinted, alcançar a gelificação química por mais photocrosslinking o componente GelMA, em aproximadamente 5-10 mW/cm2 de luz UV (360-480 nm) para 20-30 s (Figura 1C).
  6. Após o bioprinting e reticulação, lave suavemente o andaime com tampão fosfato salino (PBS) para remover o excesso de CaCl2. O andaime microfibrous HX-carregado em células endoteliais crescimento médio (EGM) em uma incubadora a 37 ° C e 5 vol.% CO2 até 16 dias com meio de cultura mudou pelo menos a cada 2 dias. Monitore as morfologias do HX sob um microscópio durante o período de cultura.

3. construir os tecidos vascularizados

  1. Uma vez que o HX migraram para as periferias das microfibras no cadafalso para formar estruturas as lúmen (Figura 1D), recuperar o andaime e delicadamente, coloque-o sobre a superfície de uma superfície hidrofóbica (por exemplo, uma laje de polymethylsiloxane [PDMS]). Use um pedaço de papel de filtro estéril para remover cuidadosamente todo o meio do espaço intersticial de andaime com força capilar.
  2. Imediatamente adicione uma gota (aproximadamente 20-40 µ l) de suspensão de um tipo de célula secundária (por exemplo, cardiomyocytes) em meio a uma densidade de 1-10 × 106 células/mL no topo do andaime, que deve se infiltrar em todo o espaço intersticial de andaime (Figura 1E). Incube a essa configuração em uma incubadora (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95% de humidade relativa) para 0,5 - 2h para permitir que as células aderir para as microfibras individuais. Monitore o tamanho das gotas ao longo do período para garantir que nenhuma evaporação perceptível é observada.
  3. Lava delicadamente os andaimes por agitação em um banho de PBS para remover quaisquer células não-aderentes e cultura a construção no meio de relevante até o tecido vascularizado desejado é formado.

Resultados

A estratégia de bioprinting microfluidic permite a extrusão direta bioprinting de andaimes microfibrous usando baixa viscosidade bioinks54,55. Conforme ilustrado na Figura 2A, um andaime com um tamanho de 6 × 6 × 6 mm3 contendo > 30 camadas de microfibras poderiam ser bioprinted dentro de 10 min. A reticulação iônica imediata do componente alginato com CaCl2...

Discussão

Construção de cabeçote de impressão co-axial representa um passo crítico para sucesso microfluidic bioprinting para permitir a entrega simultânea de ambos o bioink do núcleo e o agente de reticulação da bainha. Enquanto no presente protocolo um cabeçote de exemplo foi criado usando uma agulha 27G como o núcleo e uma agulha de 18G como o shell, que seja facilmente estendido para uma variedade de combinações usando diferentes tamanhos de agulhas. No entanto, a alteração dos tamanhos de agulha, que resulta na...

Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o National Cancer Institute da institutos nacionais de saúde via a independência Award (K99CA201603).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Alginic acid sodium salt from brown algaeSigma-AldrichA0682BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skinSigma-AldrichG2500Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)Sigma-Aldrich41089698%
HEPES bufferSigma-AldrichH08871 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific10438026Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC5080BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered salineThermo Fisher Scientific10010023pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cellsAngio-ProteomiecAP-0001Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cellsAngio-ProteomiecAP-0001GFPGFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth mediumLonzaCC-3162EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific12430054High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kitEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGClear 0.5 kg Kit
UV curing lamp systemExcelitas TechnologiesOmniCure S2000Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

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