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  • Résumé
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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous fournissons un protocole généralisé basé sur une stratégie de bioprinting microfluidiques pour génie un lit vasculaire microfibreux, où un type de cellule secondaire pourrait être encore semé dans l’espace interstitiel de cette structure microfibreux pour générer des organoids et des tissus vascularisés.

Résumé

Ingénierie des tissus vascularisés construit et organoïdes a été historiquement difficile. Nous décrivons ici une méthode originale basée sur la microfluidique bioprinting pour générer un échafaudage avec multicouches entrelacement hydrogel microfibres. Pour atteindre lisse bioprinting, une tête d’impression de la microfluidique core-gaine contenant une formulation bioink composite expulsée, le débit de base et la solution de réticulation charrié par l’écoulement de la gaine, a été conçu et monté sur le bioprinter. Par le mélange de gélatine methacryloyl (Khalil) avec l’alginate, un polysaccharide qui subit une réticulation ionique instantanée en présence de sélectionner les ions divalents, suivies d’un psoralen secondaire du composant Khalil pour atteindre la stabilisation permanente, vous pouvez obtenir un échafaudage microfibreux utilisant cette stratégie bioprinting. Ce qui est important, les cellules endothéliales encapsulés à l’intérieur de la bioprinted microfibres peuvent former les structures lumen-like qui ressemble à la vascularisation au cours de la culture pendant 16 jours. L’échafaudage microfibreux endothelialized peut servir encore comme un lit vasculaire pour construire un tissu vascularisé par ensemencement subséquent du type cellulaire secondaire dans l’espace interstitiel de la microfibres. Microfluidique bioprinting fournit une stratégie généralisée en génie pratique des tissus vascularisés à haute fidélité.

Introduction

Cibles de génie tissulaire pour générer des substituts fonctionnels tissu peuvent être utilisés pour remplacer, restaurer ou augmenter ces blessés ou malades dans le corps humain1,2,3,4, souvent grâce à une combinaison de types de cellules désiré, molécules bioactives5,6et biomatériaux7,8,9,10. Plus récemment, technologies d’ingénierie tissulaire ont également été adoptées plus en plus pour produire in vitro des tissus et des organes des modèles qui imitent les fonctions importantes de leurs homologues en vivo , pour des applications telles que le développement de médicaments, en remplacement des classiques trop simplifiée cellule planaire cultures11,12,13,14,15,16,17,18,19. Dans les deux situations, la capacité de récapituler la microarchitecture complexe et la structure hiérarchique des tissus humains est essentielle dans activer la fonctionnalité de l' ingénierie des tissus10, et en particulier, des moyens d’intégrer un réseau vasculaire dans les tissus techniques sont demande car vascularisation présente l’un des plus grands défis au champ20,21,22,23.

A ce jour, diverses approches ont été développées à cet égard dans une tentative de construire des structures des vaisseaux sanguins dans les constructions de l’ingénierie tissulaire avec divers degrés de succès8. Par exemple, l’auto-assemblage des cellules endothéliales permettant pour génération de réseaux microvasculaires24; livraison des facteurs de croissance angiogéniques induit une néovascularisation soutenue25,26; l’utilisation de cellules progénitrices vasculaire et péricytes facilite la croissance des cellules endothéliales et Assemblée24,,27; conception d’échafaudage propriétés permet une modulation précise de la vascularisation28,29; et la technologie des cellules feuille permet pour une manipulation pratique de superposition vasculaire30. Néanmoins, ces stratégies ne pas doter la capacité de maîtriser la structuration spatiale du système vasculaire, ce qui entraîne souvent une distribution aléatoire des vaisseaux sanguins dans une construction d’ingénierie tissulaire et donc limite de reproductibilité. Au cours des dernières années bioprinting a émergé comme catégorie d’activation technologies vers la solution d’un tel défi, en raison de leur polyvalence inégalée du dépôt des motifs de tissus complexes à haute fidélité et de la reproductibilité dans une façon automatisée ou semi-automatisée31,32,33. Sacrificiel bioprinting34,35,36,37,38, embedded bioprinting39,40,41et structure creuse bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 ont tous démontré la faisabilité de produire des tissus vascularisés ou vasculaires.

Par ailleurs, une stratégie de bioprinting microfluidiques pour fabriquer microfibreux ont été récemment mis au point, où un bioink hybride composée de l’alginate et gélatine methacryloyl (Khalil) a été livré à travers le noyau d’une tête d’impression concentrique et une solution de chlorure de calcium (CaCl2) a été porté par le flux de la gaine externe de la tête d’impression54,,55. La coextrusion des deux flux autorisés pour une réticulation physique immédiate du composant l’alginate pour permettre la formation de microfibre, tandis que psoralen ultérieur assurée stabilisation permanente de l’échafaudage multicouche microfibreux. À noter, les cellules endothéliales encapsulés dans les microfibres bioprinted trouvées à proliférer et migrer vers les périphéries de la microfibres en supposant que les structures en lumen qui a imité le lit vasculaire54,55. Ces bioprinted, endothelialized lits vasculaires pourraient être ensuite remplis avec désiré types cellulaire secondaire pour construire davantage de tissus vascularisés55. Ce protocole prévoit donc une procédure détaillée d’une telle microfluidique bioprinting stratégie activée par la conception de la buse concentrique, qui assure la fabrication pratique des tissus vascularisés pour applications potentielles en génie tissulaire et organoïde modélisation.

Protocole

Les cardiomyocytes de rats néonatals utilisés dans le présent protocole ont été isolées des rats Sprague-Dawley âgés de 2 jours suivant une procédure bien établie de56 , approuvé par l’animalier institutionnel et le Comité de l’urbanisme à l’hôpital Brigham and de Women.

1. l’instrumentation de la Bioprinter

  1. Insérer une aiguille émoussée plus petite (p. ex., 27 G, 1 pouce) comme le noyau au centre d’une plus grande aiguille émoussée (p. ex., 18 G, ½ pouce) comme la gaine afin de construire la duel-couche, microfluidique concentriques tête d’impression ; s’assurer que l’aiguille centrale est légèrement bombée (~ 1 mm) plus long que la coque externe (Figure 1A). L’alignement est généralement réglé manuellement, mais si entretoises nécessaires de tailles appropriées peuvent être pris en sandwich dans le temps entre les aiguilles intérieure/extérieure à la pointe et les côtés de baril pour aider l’alignement concentrique. Sceller la jonction des barils avec de la colle époxy et retirez les entretoises d’alignement sur le côté de la pointe quand il y a lieu.
  2. Introduire une autre aiguille (23G) dans le canon de l’aiguille centrale dans le sens inverse.  Générer un trou sur le côté du canon de l’aiguille externe, puis insérez un connecteur métallique de faire correspondre la taille dans le trou, suivi d’étanchéité avec de la colle époxy.
  3. Raccorder les entrées de la tête d’impression à un pousse-seringue double canal pour l’injection de le bioink et la solution de réticulation, individuellement, par deux tubes de PVC. Monter l’extrudeuse sur la tête d’un bioprinter à l’aide d’un support en plastique fait de poly(methyl methacrylate) (PMMA).
    Remarque : Bioprinter sélection dépend de la disponibilité. Dans notre cas, nous avons testé avec succès cette configuration sur plusieurs bioprinters disponibles dans le commerce. Cependant, tout bioprinter qui dispose d’une platine motorisée de x-y-z devrait, en principe, activer l’intégration de cette tête d’impression de la microfluidique.

2. Bioprinting le lit vasculaire microfibreux

  1. Faire la bioink à l’aide d’un mélange d’alginate (4 w/v%, faible viscosité), gélatine methacryloyl (Khalil, w/v% 1-2)57,58et photo-initiateur 2959 Irgacure (0,2 - 0,5 wt.%) dissous dans 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] éthane sulfonique (un tampon HEPES, pH 7,4) contenant 10 vol.% bovine sérum fœtal (SVF).
  2. Préparer une solution de 0,3 M CaCl2 dans un tampon HEPES contenant 10 vol.% FBS comme le fluide porteur de réticulation.
  3. Immédiatement avant bioprinting, dissocier les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) de ces flacons à l’aide de traitement par la trypsine w/v% 0,05 pendant 5-10 min et remettre en suspension les cellules de la bioink à une concentration de 5-10 × 106 cellules/mL. Pipetter la suspension lentement de 5 à 10 fois pour assurer une répartition homogène.
  4. Commencer l’injection du liquide bioink/réticulation à l’aide d’une pompe à seringue double canal aux mêmes débits de 5 µL/mL. Les flux peuvent être autorisés à exécuter en continu jusqu'à 1 min jusqu'à ce qu’ils stabilisent. Par la suite, lancer le mouvement de la tête d’impression en contrôlant le bioprinter à une vitesse de dépôt d’environ 4 mm/s (Figure 1B). Ces vitesses peuvent besoin fine tuning avec chaque nouvelle configuration pour assurer bioprinting optimale. Le processus bioprinting est habituellement réalisé à température ambiante (21-25 ° C), mais cette température peut être modifiée. Le processus bioprinting devrait permettre gélification rapide ionique de la composante de l’alginate et le dépôt d’un échafaudage de microfibreux (Figure 1B).
  5. Une fois l’échafaudage bioprinted, atteindre gélification chimique par psoralen plu la composante de Khalil, à environ 5-10 mW/cm2 de lumière UV (360-480 nm) pour 20-30 s (Figure 1C).
  6. Suite aux bioprinting et réticulation, rincer doucement l’échafaud avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour enlever l’excès de CaCl2. L’échafaudage microfibreux HUVECs chargées en cellules endothéliales milieu de croissance (EGM) dans un incubateur à 37 ° C et 5 vol.% CO2 pendant 16 jours avec le milieu de la culture a changé au moins tous les 2 jours. Surveiller les morphologies des HUVECs sous un microscope au cours de la période de culture.

3. la construction des tissus vascularisés

  1. Une fois les HUVECs ont migré vers les périphéries de la microfibres à l’échafaud pour former les structures en lumen (Figure 1D), extraire l’échafaud et placez-le délicatement sur la surface d’une surface hydrophobe (p. ex., une dalle de polymethylsiloxane [PDMS]). Utilisez un morceau de papier de filtre stérile pour retirer soigneusement tout le milieu de l’espace interstitiel de l’échafaudage avec force capillaire.
  2. Immédiatement ajouter une goutte d’eau (environ 20-40 µL) de suspension d’un type de cellule secondaire (p. ex., les cardiomyocytes) dans un milieu à une densité de 1 à 10 × 106 cellules/mL au sommet de l’échafaudage, qui doit s’infiltrer dans l’espace interstitiel de l’échafaud (Figure 1E). Incuber une telle configuration dans un incubateur (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95 % d’humidité relative) pendant 0,5 - 2 h pour permettre à des cellules d’adhérer sur les microfibres individuels. Surveiller la taille des gouttelettes sur la période pour s’assurer qu’aucune évaporation notable n’est observée.
  3. Laver délicatement les échafaudages en secouant dans un bain de PBS pour enlever toute les cellules non adhérentes et la culture de la construction en milieu pertinente jusqu'à ce que le tissu vascularisé désiré est formé.

Résultats

La stratégie de bioprinting microfluidique permet bioprinting extrusion directe d’échafaudages de microfibreux à l’aide de faible viscosité bioinks54,,55. Comme illustré dans la Figure 2A, un échafaudage avec une taille de 6 × 6 × 6 mm contenant3 > 30 couches de microfibres peuvent être bioprinted moins de 10 min. La réticulation ionique immédiate du comp...

Discussion

Construction de la tête d’impression coaxiale représente une étape cruciale vers bioprinting microfluidique réussie pour permettre la livraison simultanée de deux le bioink de l’âme et l’agent de réticulation de la gaine. Alors que dans le présent protocole, une tête d’impression de l’exemple a été créé en utilisant une aiguille de 27G comme le noyau et une aiguille 18G comme la coquille, il peut être facilement prolongée à une variété de combinaisons en utilisant différentes tailles d’aigu...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent le National Cancer Institute du instituts nationaux de santé sentier au prix de l’indépendance (K99CA201603).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Alginic acid sodium salt from brown algaeSigma-AldrichA0682BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skinSigma-AldrichG2500Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)Sigma-Aldrich41089698%
HEPES bufferSigma-AldrichH08871 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific10438026Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC5080BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered salineThermo Fisher Scientific10010023pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cellsAngio-ProteomiecAP-0001Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cellsAngio-ProteomiecAP-0001GFPGFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth mediumLonzaCC-3162EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific12430054High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kitEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGClear 0.5 kg Kit
UV curing lamp systemExcelitas TechnologiesOmniCure S2000Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

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