Inmunohistoquímica Cuantitativa del Microambiente Celular en Resecciones de Glioblastoma Paciente

Resumen

Este protocolo fue desarrollado para identificar cuantitativamente los componentes del microambiente tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma usando inmunohistoquímica cromogénica e ImageJ.

Resumen

Con el creciente interés en el microambiente tumoral, nos propusimos desarrollar un método para determinar específicamente los componentes del microambiente dentro de muestras de pacientes de glioblastoma, el cáncer de cerebro más mortífero y más invasivo. No sólo son métodos cuantitativos beneficiosos para describir con precisión los tejidos enfermos, sino que también pueden contribuir a un pronóstico más preciso, el diagnóstico y el desarrollo de sistemas de ingeniería de tejidos y reemplazos. En el glioblastoma, las células gliales, tales como microglia y astrocitos, se han correlacionado independientemente con un mal pronóstico basado en la clasificación de patólogos. Sin embargo, el estado de estas células y otros componentes de las células gliales no ha sido bien descrito cuantitativamente. Esto puede ser difícil debido a los grandes procesos que marcan estas células gliales. Además, la mayoría de los análisis histológicos se centran en la muestra de tejido total o sólo dentro de la mayor parte del tumor, en lugar de delinear cuantificaciones basadas en regiones conHin el tejido altamente heterogéneo. Aquí, describimos un método para identificar y analizar cuantitativamente las poblaciones de células gliales dentro de la masa tumoral y regiones adyacentes de resecciones tumorales de pacientes con glioblastoma. Se utilizó inmunohistoquímica cromogénica para identificar las poblaciones de células gliales en resecciones tumorales de pacientes y ImageJ para analizar el porcentaje de cobertura de tinción para cada población glial. Con estas técnicas podemos describir mejor las células gliales a través de las regiones del microambiente tumoral glioma.

Introducción

El glioblastoma (GBM), el cáncer de cerebro más común y maligno, se caracteriza por una invasión altamente difusa desde el tumor primario al parénquima cerebral sano circundante ^{1 , 2} . Esta invasión difusa hace que el tumor sea particularmente difícil de resecar completamente, y las células cancerosas invasoras que permanecen después de la terapia es la razón más común para la recurrencia inevitable ^{2 , 3 , 4} . Anteriormente, se encontró inhibir la invasión difusa de células de glioma de ser terapéuticamente beneficioso [ ^5] , sin embargo poco se sabe sobre los complejos mecanismos que contribuyen a GBM invasión. El microambiente tumoral, o tejido que rodea el cáncer, ha sido implicado en la progresión de tumores en múltiples cánceres [ ^{6 , 7]} . El microambiente tumoral del glioblastoma, en pArticular, está relativamente sub-caracterizada y es singularmente compleja, compuesta de múltiples células gliales, tales como astrocitos, microglia y oligodendrocitos, así como matriz extracelular, factores solubles y factores biofísicos. Experimentalmente, se ha demostrado que los astrocitos y microglia aumentan la progresión e invasión de glioma ^{8 , 9 , 10} , pero se desconoce la composición de todas las células gliales en el microambiente humano nativo del cerebro.

Anteriormente hemos demostrado que los componentes microambientales pueden predecir la supervivencia de los pacientes mediante el análisis cuantitativo de los componentes celulares del glioblastoma microambiente e incorporar nuestros análisis en un modelo de riesgos proporcionales [ ^11] . En este sentido, describimos el método de análisis cuantitativo para identificar las poblaciones de células gliales dentro de la masa tumoral y regiones adyacentes de resecciones tumorales de pacientes con glioblastomaS Se utilizó inmunohistoquímica cromógena para identificar las poblaciones de células gliales y ImageJ para analizar el porcentaje de cobertura de tinción de cada población glial. La evaluación del porcentaje de cobertura crea una medición simple para determinar las diferencias morfológicas de las células, particularmente las afectadas por las interacciones con las células cancerosas. Los estudios previos para cuantificar la tinción histopatológica usan tinción estándar como la hematoxilina y la eosina ¹² o el tricromo ^{13 de} Masson, que no aprovechan la especificidad de la tinción inmunohistoquímica basada en anticuerpos. Nuestro método fue desarrollado para cuantificar directamente las poblaciones gliales dentro de las resecciones tumorales de pacientes con glioblastoma, que se pretende utilizar para elucidar el complejo microambiente glioblastoma.

Protocolo

Este protocolo identifica los componentes celulares en las muestras fijadas con formalina fijadas en parafina (FFPE), como es típico para las muestras clínicas bancadas. La inclusión de parafina permite el mejor mantenimiento de la morfología celular y de los tejidos, así como una mejor longevidad de las secciones. Las muestras utilizadas para este análisis se accedieron a través de la Universidad de Virginia Biorepository y Tissue Research Facility. Las muestras de pacientes fueron seleccionadas por un neuropatólogo basado en un diagnóstico definitivo de glioblastoma (astrocitoma, grado IV de la OMS) que había completado resecciones tumorales en la Universidad de Virginia entre 2010 y 2013, y fueron de-identificados antes de este análisis [ ^11] .

1. Desparafinación y Rehidratación de Muestras de FFPE

NOTA: Esta parte del protocolo es específica para las muestras de FFPE. Mientras que las muestras embebidas en parafina pueden ser más útiles para este análisis debido a la preservación de células y tMorfología de la cuestión, este análisis también se puede hacer con secciones congeladas. Si se utilizan secciones congeladas, esta porción puede omitirse y proceder directamente a la inmunohistoquímica cromogénica.

1. Realizar los siguientes lavados durante 5 min cada uno: Xileno, Xileno, Etanol al 100%, Etanol al 100%, Etanol al 95%, Etanol al 95%, Etanol al 70%, Agua desionizada, Agua desionizada

2. Recuperación de antígenos

NOTA: Esta parte del protocolo es necesaria para romper los puentes de metileno formados durante la fijación de formalina de las muestras de FFPE y exponer los sitios de antígeno para detectar anticuerpos.

1. Diluya la solución de desenmascaramiento del antígeno de alto pH basada en Tris en la recomendación del fabricante en agua destilada.
2. Realizar la recuperación de antígeno mediada por calor utilizando un microondas. Otras formas de recuperación mediada por calor (tales como olla a presión, vapor de verduras, o agua hirviendo) también serían suficientes.
   1. Añadir la solución de desenmascaramiento diluida en un recipiente no sellable para microondasbuque. Coloque los portaobjetos en el recipiente. Coloque los portaobjetos en el microondas.
   2. Hervir durante 20 min a alta potencia. Controle los niveles de líquido para la evaporación y rellene con agua destilada según sea necesario.
3. Dejar enfriar las muestras en solución durante 1 h a temperatura ambiente.

3. Inmunohistoquímica cromogénica

1. Esboce la muestra de tejido con una pluma hidrófoba para minimizar el volumen de reactivos necesarios para cubrir la muestra.
   NOTA: Asegúrese de mantener las muestras de tejido hidratadas y no deje que se sequen, ya que esto afectará la eficacia de la tinción.
2. Pipetar suficiente solución de permeabilización (solución salina tamponada con Tris (TBS) + Triton-X al 0,01%) para cubrir la muestra de tejido (típicamente alrededor de 100 - 200 μl).
3. Retire y deseche la solución y repita el paso 3.2.
4. Incubar las muestras a temperatura ambiente con solución de bloqueo (suero de caballo al 2,5% + solución de permeabilización).
5. Incubar las muestras durante la noche a 4 ºC con anticuerpos primarios diluidosEn la solución de bloqueo.
   NOTA: Todos los anticuerpos primarios usados ​​aquí se diluyen a 1: 200, pero las diluciones óptimas se pueden determinar usando diluciones en serie comenzando con la recomendación del fabricante. Información detallada sobre anticuerpos utilizados en este protocolo se publicó anteriormente [ ^11] .
6. Detectar los anticuerpos primarios utilizando un reactivo de polímero de peroxidasa de rábano picante correspondiente al animal huésped del anticuerpo primario, siguiendo el protocolo del fabricante.
7. Pipet suficiente solución de permeabilización para cubrir la muestra de tejido e incubar durante 5 min.
8. Retire y deseche la solución y repita el Paso 3.7.
9. Incubar los portaobjetos en H ₂ O _{2 al} 0,3% en 1x TBS durante 15 min.
10. Desarrollar muestras con un sustrato de peroxidasa diaminobenzidina (DAB) durante 2 - 10 min hasta que se alcance la intensidad de tinción deseada.
11. Contraste las muestras para identificar núcleos celulares, como con hematoxilina, siguiendo el protocolo del fabricante.
12. Deshidrate las muestras con 100%Etanol y xileno.
13. Monte las muestras permanentemente con medios de montaje.

4. Identificación de regiones de interés

1. La imagen se desliza bajo microscopía de campo claro capaz de imágenes de alta resolución.
   NOTA: Utilice componentes celulares de generación de imágenes con una resolución mínima de 20x.
2. Mueva la cámara a regiones específicas de interés a través de muestras de tejido.
3. Guardar imágenes como archivos TIFF para la cuantificación.

5. Análisis de imágenes

1. Abra imágenes en ImageJ para la cuantificación del porcentaje de cobertura.
2. Utilice el complemento Color Umbral para eliminar el color púrpura de los núcleos teñidos con hematoxilina.
3. Convierte la imagen a 8 bits.
4. Añadir umbral sin fondo oscuro.
5. Procese la imagen usando uno de los 17 filtros de umbral de ImageJ pre-cargado ( es decir, MaxEntropy) para que solo las partes teñidas de DAB se incluyan en el umbral.
   NOTA: Seleccione el filtro de umbral pre-cargado óptimo que minimizEs inclusión de tinción de fondo. Esto puede depender de la calidad de la tinción y la especificidad del anticuerpo. Utilice el mismo umbral para todas las réplicas técnicas dentro de cada muestra de paciente.
6. Aplicar umbral.
7. Medir el área de porcentaje de la imagen de umbral.
8. Porcentaje promedio de cobertura de área para múltiples regiones dentro de cada muestra.

Resultados

Para este análisis, se identificaron dos regiones de intereses dentro de nuestras resecciones tumorales - el tumor primario y las regiones adyacentes, principalmente compuestas de tejido sano con células difusas invasoras de cáncer ( Figura 1A , 1B ) - fueron identificadas por neuropatólogos colaboradores en hematoxilina y eosina Muestras. Dentro de cada muestra de pacientes, se identificó tinción positiva para astrocitos (

Discusión

Nuestro método propuesto aquí es un enfoque cuantitativo para analizar las muestras histológicas teñidas usando inmunohistoquímica cromogénica tradicional. La metodología actual para este tipo de análisis incluye protocolos de tinción similares seguidos de clasificación por patólogos independientes. Este método ha sido confiable, sin embargo, para una serie de aplicaciones, se requiere una comprensión más precisa del maquillaje celular, tal como una mejor comprensión de la heterogeneidad asociada con tumo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution	Vector Labs	H-3301
TBS
Triton-X	Amresco	9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1	abcam	ab56777
Anti-Iba1	abcam	ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1	abcam	ab53041
ImmPRESS anti-goat	Vector Labs	MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)	Vector Labs	MP-7500
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	216763
ImmPACT DAB substrate	Vector Labs	SK-4105
Hematoxylin counterstain	ThermoScientific	72404
Histochoice Mounting Media	Amresco	H157-475
Aperio Scanscope	Leica Biosystems
Image Scanscope	Leica Biosystems
Super HT PAP Pen	Research Products International	195506