Imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente

Resumo

Este protocolo foi desenvolvido para identificar quantitativamente os componentes do microambiente tumoral em resecções do paciente com glioblastoma usando imuno-histoquímica cromogênica e ImageJ.

Resumo

Com o crescente interesse no microambismo do tumor, buscamos desenvolver um método para determinar especificamente os componentes do microambiente dentro de amostras de pacientes com glioblastoma, o câncer cerebral mais mortal e invasivo. Não só os métodos quantitativos são benéficos para descrever com precisão os tecidos doentes, mas também podem contribuir para um prognóstico mais preciso, diagnóstico e desenvolvimento de sistemas e substituições de engenharia de tecidos. No glioblastoma, as células gliais, como a microglia e os astrócitos, foram correlacionadas de forma independente com um mau prognóstico com base na classificação de patologistas. No entanto, o estado dessas células e outros componentes das células gliais não foram bem descritos de forma quantitativa. Isso pode ser difícil devido aos grandes processos que marcam essas células gliais. Além disso, a maioria das análises histológicas se concentra na amostra de tecido geral ou apenas na maior parte do tumor, ao contrário de delinear as quantificações com base em regiõesSobre o tecido altamente heterogêneo. Aqui, descrevemos um método para identificar e analisar quantitativamente as populações de células gliais dentro do tumor a granel e regiões adjacentes de ressecções tumorais de pacientes com glioblastoma. Utilizamos imuno-histoquímica cromogênica para identificar as populações de células gliais em resecções tumorais do paciente e ImageJ para analisar a cobertura percentual de coloração para cada população glial. Com essas técnicas, podemos descrever melhor as células gliais em todas as regiões do microambiente do tumor de glioma.

Introdução

O glioblastoma (GBM), o câncer cerebral mais comum e maligno, é caracterizado por invasão altamente difusa do tumor primário para o parênquima ^{1 , 2 do} cérebro circundante. Essa invasão difusa torna o tumor particularmente difícil de ressecar completamente, e as células cancerígenas invasoras que permanecem pós-terapia são a razão mais comum para recorrência inevitável ^{2 , 3 , 4} . Anteriormente, achamos inibir a invasão de células de glioma difuso para ser terapeuticamente benéfico ⁵ , porém pouco se sabe sobre os mecanismos complexos que contribuem para a invasão GBM. O microambiente do tumor, ou tecido que envolve o câncer, tem sido implicado na progressão de tumores em cânceres múltiplos ^{6 , 7} . O microambiente tumoral do glioblastoma, em pArticular, é relativamente pouco caracterizada e é exclusivamente complexa, composta de células gliais múltiplas, como astrocitos, microglia e oligodendrócitos, bem como matriz extracelular, fatores solúveis e fatores biofísicos. Experimentalmente, os astrocitos e a microglia demonstraram aumentar a progressão do glioma e a invasão ^{8 , 9 , 10} , mas a composição de todas as células gliais no microambiente do cérebro humano nativo é desconhecida.

Nós anteriormente mostramos componentes microambientais que podem prever a sobrevivência do paciente analisando quantitativamente os componentes celulares do microambiente do glioblastoma e incorporando nossas análises em um modelo de riscos proporcionais ¹¹ . Aqui, descrevemos o método de análise quantitativa para identificar as populações de células gliais dentro do tumor a granel e regiões adjacentes de ressecções tumorais do paciente com glioblastomaS. Utilizamos imuno-histoquímica cromogênica para identificar as populações de células gliais e ImageJ para analisar a cobertura percentual de coloração para cada população glial. Avaliar a cobertura percentual cria uma medida simples para determinar as diferenças morfológicas das células, particularmente aquelas afetadas pelas interações com células cancerígenas. Estudos anteriores para quantificar a coloração histopatológica usam coloração padrão, como hematoxilina e eosina ¹² ou tricromo ^{13 de} Masson, que não aproveitam a especificidade da coloração imuno-histoquimica baseada em anticorpos. Nosso método foi desenvolvido para quantificar diretamente as populações gliais dentro das resecções tumorais do paciente com glioblastoma, que pretendemos usar para elucidar o microambiente do glioblastoma complexo.

Protocolo

Este protocolo identifica componentes celulares em amostras embutidas em parafina fixada em formalina (FFPE), como é típico para amostras de pacientes clínicas bancárias. A incorporação de parafina permite a melhor manutenção da morfologia celular e tecidual, além de ter uma melhor longevidade das seções. As amostras utilizadas para esta análise foram acessadas através da Universidade de Virginia Biorepository e Tissue Research Facility. As amostras de pacientes foram selecionadas por um neuropatologista com base em um diagnóstico definitivo de glioblastoma (astrocitoma, grau IV da OMS) que completaram ressecções tumorais na Universidade da Virgínia entre 2010 e 2013 e foram des-identificados antes dessa análise ¹¹ .

1. Desparaffinização e Reidratação de Amostras FFPE

NOTA: Esta parte do protocolo é específica para amostras FFPE. Embora as amostras embutidas em parafina possam ser mais úteis para esta análise, devido à preservação de células e tQuestão de morfologia, esta análise também pode ser feita com seções congeladas. Se estiver usando seções congeladas, esta porção pode ser omitida e proceder diretamente à imuno-histoquímica cromogênica.

1. Execute as seguintes lavagens por 5 minutos cada: Xileno, Xileno, 100% Etanol, 100% Etanol, 95% Etanol, 95% Etanol, 70% Etanol, Água desionizada, Água desionizada

2. Antigen Retrieval

NOTA: Esta porção do protocolo é necessária para quebrar pontes de metileno formadas durante a fixação de formalina de amostras de FFPE e expor sites de antígenos para anticorpos para se ligar.

1. Diluir a solução de desmascaramento de antigénio de alto pH com base em Tris na recomendação do fabricante em água destilada.
2. Execute a recuperação do antígeno mediada pelo calor usando um microondas. Outras formas de recuperação mediada pelo calor (como panela de pressão, vaporizador de vegetais ou água fervente) também seriam suficientes.
   1. Adicione a solução de desmascaramento diluída a um microondas não seladoembarcação. Coloque as lâminas na embarcação. Coloque as lâminas no microondas.
   2. Ferver durante 20 minutos com alta potência. Monitore os níveis de líquido para evaporação e reabasteça com água destilada conforme necessário.
3. Permitir que as amostras esfriem em solução durante 1 h à temperatura ambiente.

3. Imunohistoquímica cromogênica

1. Esboce uma amostra de tecido com uma caneta hidrofóbica para minimizar o volume de reagentes necessários para cobrir a amostra.
   NOTA: Certifique-se de manter as amostras de tecido hidratadas e não as deixe secar, pois isso afetará a eficácia da coloração.
2. Pipetar uma solução de permeabilização suficiente (solução salina tamponada com Tris (TBS) + Triton-X a 0,01% para cobrir a amostra de tecido (tipicamente cerca de 100 a 200 μL).
3. Remova e descarte a solução e repita o passo 3.2.
4. Incubar amostras à temperatura ambiente com solução de bloqueio (2,5% de soro de cavalo + solução de permeabilização).
5. Incubar amostras durante a noite em 4 ºC com anticorpos primários diluídosEm solução de bloqueio.
   NOTA: Todos os anticorpos primários utilizados aqui são diluídos a 1: 200, mas as diluições ideais podem ser determinadas usando diluições em série, começando com a recomendação do fabricante. Informações detalhadas sobre os anticorpos usados ​​neste protocolo foram previamente publicadas ¹¹ .
6. Detectar anticorpos primários usando um reagente de polímero de peroxidase de rábano correspondente ao animal hospedeiro do anticorpo primário, seguindo o protocolo do fabricante.
7. Pipetar solução de permeabilização suficiente para cobrir a amostra de tecido e incubar durante 5 min.
8. Remova e descarte a solução e repita a Etapa 3.7.
9. Incubar as lâminas em 0,3% de H ₂ O ₂ em 1x TBS durante 15 min.
10. Desenvolva amostras com um substrato de peroxidase diaminobenzidina (DAB) durante 2 a 10 min até atingir a intensidade de mancha desejada.
11. Contra-amostras para identificar núcleos celulares, como com hematoxilina, seguindo o protocolo do fabricante.
12. Desidratar amostras com 100%Etanol e xileno.
13. Monte amostras permanentemente com mídia de montagem.

4. Identificação das Regiões de Interesse

1. Lâminas de imagem sob microscópio de campo brilhante capaz de imagens de alta resolução.
   NOTA: use componentes celulares de imagem com uma resolução mínima de 20x.
2. Mova a câmera para regiões específicas de interesse em amostras de tecido.
3. Salve imagens como arquivos TIFF para quantificação.

5. Análise de imagem

1. Abra imagens no ImageJ para quantificar a cobertura percentual.
2. Use o plug-in Limite de cor para remover a cor roxa dos núcleos corados com hematoxilina.
3. Converta a imagem para 8 bits.
4. Adicione um limite sem fundo escuro.
5. Processe a imagem usando um dos 17 filtros de limiar ImageJ pré-carregados ( ou seja, MaxEntropy), de modo que apenas as porções coloridas DAB estão incluídas no limite.
   NOTA: Selecione o filtro de limite pré-carregado ótimo que minimizouÉ inclusão de coloração de fundo. Isso pode depender da qualidade da coloração e especificidade do anticorpo. Use o mesmo limite para todas as repetições técnicas dentro de cada amostra de paciente.
6. Aplicar limite.
7. Medir a área de porcentagem da imagem limite.
8. Cobertura de área percentual média para múltiplas regiões dentro de cada amostra.

Resultados

Para esta análise, duas regiões de interesses dentro de nossas ressecções tumorais - o tumor primário e as regiões adjacentes, principalmente composta de tecido saudável com células invadidas de câncer invasivo ( Figura 1A , 1B ) - foram identificadas por neuropatologistas colaboradores em hematóxilina e paciente com corante de eosina Amostras. Dentro de cada amostra de paciente, identificou-se a coloração positiva para astrocito...

Discussão

Nosso método aqui proposto é uma abordagem quantitativa para analisar amostras histológicas coradas usando imunohistoquímica cromogênica tradicional. A metodologia atual para este tipo de análise inclui protocolos de coloração semelhantes, seguidos pela classificação por patologistas independentes. Este método tem sido confiável, no entanto, para uma série de aplicações, é necessária uma compreensão mais precisa da maquiagem celular, como melhor compreensão da heterogeneidade associada aos tumores e r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution	Vector Labs	H-3301
TBS
Triton-X	Amresco	9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1	abcam	ab56777
Anti-Iba1	abcam	ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1	abcam	ab53041
ImmPRESS anti-goat	Vector Labs	MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)	Vector Labs	MP-7500
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	216763
ImmPACT DAB substrate	Vector Labs	SK-4105
Hematoxylin counterstain	ThermoScientific	72404
Histochoice Mounting Media	Amresco	H157-475
Aperio Scanscope	Leica Biosystems
Image Scanscope	Leica Biosystems
Super HT PAP Pen	Research Products International	195506