Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente

Riepilogo

Questo protocollo è stato sviluppato per identificare quantitativamente i componenti del microambiente del tumore nelle resezioni dei pazienti con glioblastoma utilizzando immunohistochemistry cromogene e ImageJ.

Abstract

Con il crescente interesse per il microambiente del tumore, abbiamo deciso di sviluppare un metodo per determinare in modo specifico i componenti del microambiente nei campioni dei pazienti di glioblastoma, il cancro al cervello più letale e più invasivo. Non solo metodi quantitativi utili per descrivere in modo preciso i tessuti malati, possono anche contribuire alla prognosi, alla diagnosi e allo sviluppo di sistemi e sostituzioni sintetici. Nel glioblastoma, le cellule gliali, come microglia e astrociti, sono state correlate indipendentemente con una prognosi scadente basata sulla classificazione patologica. Tuttavia, lo stato di queste cellule e di altri componenti di cellule gliali non è stato ben descritto in modo quantitativo. Ciò può essere difficile a causa dei grandi processi che segnano queste cellule gliali. Inoltre, la maggior parte delle analisi istologiche si concentrano sul campione globale del tessuto o solo all'interno della maggior parte del tumore, al contrario di delineare quantificazioni basate sulle regioniIl tessuto molto eterogeneo. Qui descriviamo un metodo per identificare e analizzare quantitativamente le popolazioni delle cellule gliali all'interno della massa tumorale e delle regioni adiacenti di resezione tumorale da pazienti con glioblastoma. Abbiamo utilizzato immunohistochemistry cromogeno per identificare le popolazioni di cellule gliali nelle resections del tumore del paziente e ImageJ per analizzare la copertura percentuale di colorazione per ogni popolazione gliale. Con queste tecniche possiamo descrivere meglio le cellule gliali in tutte le regioni del microambiente tumorale degli amiomi.

Introduzione

Il glioblastoma (GBM), il cancro al cervello più comune e maligno, è caratterizzato da un'invasione altamente diffusa dalla massa tumorale primaria nel cervello sano, parenchima ^{1 , 2} . Questa invasione diffusa rende particolarmente difficile il respiro del tumore, e le cellule tumorali invasive che rimangono post-terapia sono il motivo più comune per la ricorrenza inevitabile ^{2 , 3 , 4} . In precedenza, abbiamo trovato inibendo l'invasione di cellule diffuse degli gliomi per essere terapeuticamente vantaggiosa ⁵ , tuttavia poco si sa circa i complessi meccanismi che contribuiscono all'invasione GBM. Il microambiente del tumore, o il tessuto che circonda il cancro, è stato implicato nella progressione dei tumori nei tumori multipli ^{6 , 7} . Il microambiente del tumore di glioblastoma, in pArticolare, è relativamente poco caratterizzato ed è univoco complesso, composto da cellule gliali multipli, come astrociti, microglia e oligodendrociti, così come matrice extracellulare, fattori solubili e fattori biofisici. Sperimentalmente, gli astrociti e la microglia sono stati dimostrati per aumentare la progressione dell'loma e l'invasione ^{8 , 9 , 10} , ma la composizione di tutte le cellule gliali nel cervello umano nativo microambiente è sconosciuta.

Abbiamo precedentemente mostrato che i componenti microambientali possono prevedere la sopravvivenza del paziente analizzando quantitativamente i componenti cellulari del microambiente glioblastoma e incorporando le nostre analisi in un modello di rischio proporzionale ¹¹ . Qui descriviamo il metodo di analisi quantitativa per identificare le popolazioni delle cellule gliali all'interno della massa tumorale e delle regioni adiacenti di resezione tumorale del paziente glioblastomaS. Abbiamo utilizzato immunohistochemistry cromogeno per identificare le popolazioni di cellule gliali e ImageJ per analizzare la copertura percentuale di colorazione per ogni popolazione gliale. La valutazione della percentuale di copertura crea una misurazione semplice per determinare le differenze morfologiche delle cellule, in particolare quelle colpite dalle interazioni con le cellule tumorali. Precedenti studi per la quantificazione della colorazione istopatologica usano la colorazione standard come l'ematoxilina e l'eosin ¹² o il tricromo ^{13 di} Masson, che non approfittano della specificità della colorazione immunohistochemica a base di anticorpi. Il nostro metodo è stato sviluppato per quantificare direttamente le popolazioni gliali nelle resezioni tumorali del paziente glioblastoma, che intendiamo utilizzare per chiarire il microambiente complesso di glioblastoma.

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Protocollo

Questo protocollo identifica i componenti cellulari in campioni embedded (FFPE) fissati in formalina, come è tipico per i campioni pazienti clinici bancati. L'incorporazione di paraffina consente la migliore manutenzione della morfologia cellulare e del tessuto, nonché la migliore longevità delle sezioni. I campioni utilizzati per questa analisi sono stati raggiunti attraverso l'Università di Virginia Biorepository e Tissue Research Facility. I campioni pazienti sono stati selezionati da un neuropatologo basato su una diagnosi definitiva di glioblastoma (astrocitoma, grado IV dell'OMS) che aveva completato resezione tumorale presso l'Università di Virginia tra il 2010 e il 2013 e sono stati identificati prima di questa analisi ¹¹ .

1. Depaffinazione e reidratazione del campione FFPE

NOTA: Questa parte del protocollo è specifica per i campioni FFPE. Mentre i campioni embedded con paraffina possono essere più utili per questa analisi a causa della conservazione cellulare e tEmettere morfologia, questa analisi può anche essere fatta con sezioni congelate. Se si usano sezioni congelate, questa parte può essere omessa e procedere direttamente all'immunohistochemistry cromogenico.

1. Eseguire le lavaggi seguenti per 5 min ciascuno: Xilene, Xilene, 100% etanolo, 100% etanolo, 95% etanolo, 95% etanolo, 70% etanolo, acqua deionizzata, acqua deionizzata

2. Recupero di antigeni

NOTA: Questa parte del protocollo è necessaria per rompere ponti di metilene formati durante la fissazione di formalina di campioni FFPE e di esporre siti antigene per gli anticorpi da legare.

1. Diluire la soluzione di antigene a pH elevato a base di Tris a raccomandazione del produttore in acqua distillata.
2. Eseguire il recupero di antigeni mediato dal calore utilizzando un forno a microonde. Basta anche altre forme di recupero a temperature termiche (come la pentola a pressione, il vapore vegetale o l'acqua bollente).
   1. Aggiungere la soluzione diluita a messa a punto in un microfono non sigillatonave. Posizionare le diapositive nella vasca. Posizionare le diapositive in forno a microonde.
   2. Bollite per 20 minuti ad alta potenza. Controllare i livelli liquidi per l'evaporazione e ricostituire con acqua distillata come necessario.
3. Lasciare raffreddare i campioni in soluzione per 1 ora a temperatura ambiente.

3. Immunohistochemistry cromogenico

1. Estrarre il campione di tessuto con una penna idrofoba per ridurre al minimo il volume di reagenti necessari per coprire il campione.
   NOTA: Assicurarsi di mantenere i campioni di tessuto idratati e non lasciarli asciugare, in quanto ciò influirà sull'efficacia della colorazione.
2. Pipettare la soluzione di permeabilizzazione sufficiente (soluzione salina a tampone Tris (TBS) + 0.01% Triton-X) per coprire il campione di tessuti (tipicamente circa 100 - 200 μL).
3. Rimuovere e scartare la soluzione e ripetere il passo 3.2.
4. Incubare i campioni a temperatura ambiente con soluzione di blocco (2,5% cavallo di cavallo + soluzione di permeabilizzazione).
5. Incubare i campioni durante la notte in 4 ° C con anticorpi primari diluitiNella soluzione di blocco.
   NOTA: Tutti gli anticorpi primari utilizzati qui sono diluiti a 1: 200, ma le diluizioni ottimali possono essere determinate usando diluizioni seriali a partire dalla raccomandazione del produttore. Informazioni dettagliate sugli anticorpi utilizzati in questo protocollo sono stati precedentemente pubblicati ¹¹ .
6. Rilevare gli anticorpi primari utilizzando un reattore di polimero perossidasi a base di rafano corrispondente all'animale primario di anticorpi, seguendo il protocollo del produttore.
7. Pipetta la soluzione permeabilizzazione sufficiente per coprire il campione di tessuto e incubare per 5 min.
8. Rimuovere e scartare la soluzione e ripetere il passo 3.7.
9. Incubare le diapositive in 0,3% di H ₂ O ₂ in 1x TBS per 15 minuti.
10. Sviluppare campioni con un substrato perossidasi diaminobenzidina (DAB) per 2 - 10 minuti fino a raggiungere la desiderata intensità della macchia.
11. Contrassegnare campioni per identificare nuclei cellulari, come ad esempio l'ematossilina, seguendo il protocollo del produttore.
12. Campioni di deidrato con 100%Etanolo e xilene.
13. Montare i campioni in modo permanente con i supporti di montaggio.

4. Identificazione delle regioni d'interesse

1. Slide di immagini sotto microscopia luminosa in grado di immagini ad alta risoluzione.
   NOTA: utilizzare i componenti cellulari di imaging con una risoluzione minima di 20x.
2. Spostare la fotocamera a determinate aree di interesse in tutti i campioni di tessuto.
3. Salvare le immagini come file TIFF per la quantificazione.

5. Analisi delle immagini

1. Apri le immagini in ImageJ per la quantificazione della copertura percentuale.
2. Utilizza il plugin di Threshold Color per rimuovere il colore viola dai nuclei colorati da ematossilina.
3. Convertire l'immagine a 8 bit.
4. Aggiungere soglia senza sfondo scuro.
5. Immagine di processo usando uno dei 17 filtri di soglia ImageJ preimpostati ( cioè MaxEntropy), quindi solo le porzioni macchiate DAB sono incluse nella soglia.
   NOTA: Selezionare il filtro soglia ottimale preimpostato che minimizzaInclusione della colorazione di fondo. Ciò può dipendere dalla qualità della colorazione e dalla specificità dell'anticorpo. Utilizzare la stessa soglia per tutte le repliche tecniche all'interno di ciascun campione del paziente.
6. Applica la soglia.
7. Misura l'area percentuale di immagine soglia.
8. Copertura area percentuale media per più regioni all'interno di ciascun campione.

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Risultati

Per questa analisi sono state identificate due regioni di interessi all'interno delle nostre rese tumorali - la massa tumorale primaria e le regioni adiacenti, composta principalmente da tessuti sani con cellule tumorali invasive diffuse ( Figura 1A , 1B ) - sono stati identificati collaborando neuropatologi con pazienti affetti da ematossilina ed eosina campioni. All'interno di ogni campione di pazienti è stata identificata una col...

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Discussione

Il nostro metodo proposto qui è un approccio quantitativo per l'analisi dei campioni istologici macchiati usando l'immunohistochemistry tradizionale cromogeno. La metodologia attuale per questo tipo di analisi comprende protocolli di colorazione similari seguiti da classificazione da patologi indipendenti. Questo metodo è stato affidabile, tuttavia per una serie di applicazioni è necessaria una comprensione più precisa del trucco cellulare, come una migliore comprensione dell'eterogeneità associata ai t...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution	Vector Labs	H-3301
TBS
Triton-X	Amresco	9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1	abcam	ab56777
Anti-Iba1	abcam	ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1	abcam	ab53041
ImmPRESS anti-goat	Vector Labs	MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)	Vector Labs	MP-7500
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	216763
ImmPACT DAB substrate	Vector Labs	SK-4105
Hematoxylin counterstain	ThermoScientific	72404
Histochoice Mounting Media	Amresco	H157-475
Aperio Scanscope	Leica Biosystems
Image Scanscope	Leica Biosystems
Super HT PAP Pen	Research Products International	195506