אימונוהיסטוכימיה כמותית של Microenvironment נייד בגידולים גליובלסטומה החולה

Summary

פרוטוקול זה פותח כדי לזהות כמותית מרכיבים microenvironment הגידול ב resioblastoma החולה resections באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית ו ImageJ.

Abstract

עם העניין הגובר של microenvironment הגידול, יצאנו לפתח שיטה כדי לקבוע במיוחד את רכיבי microenvironment בתוך דגימות החולה של glioblastoma, סרטן המוח הקטלני הפולשני ביותר. לא רק שיטות כמותיות מועילות לתיאור מדויק של רקמות חולים, הם יכולים גם לתרום פרוגנוזה מדויקת יותר, אבחון, ופיתוח של מערכות הנדסה רקמות תחליפים. ב glioblastoma, תאים גליה, כגון microglia ו astrocytes, היו מתואמים באופן בלתי תלוי עם פרוגנוזה גרועה על פי דירוג הפתולוג. עם זאת, מצבם של תאים אלה ורכיבי תא גליה אחרים לא תוארו באופן כמותי. זה יכול להיות קשה בשל תהליכים גדולים לסמן תאים אלה גליה. יתר על כן, רוב הניתוחים היסטולוגית להתמקד מדגם הרקמה הכוללת או רק בתוך חלק הארי של הגידול, בניגוד כימות שרטוט מבוסס על שנינות אזוריםהין הרקמה ההטרוגנית ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לזיהוי כמותי וניתוח של אוכלוסיות של תאים גליה בתוך בתפזורת הגידול באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולים glioblastoma. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה בגידולים הגידול המטופל ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. בעזרת טכניקות אלה אנו מסוגלים לתאר טוב יותר את התאים גליה ברחבי אזורים של microivironment הגידול glioma.

Introduction

Glioblastoma (GBM), סרטן השד הנפוץ ביותר וממאיר, מאופיין פלישה מפוזר מאוד מן הגידול העיקרי הראש לתוך parenchyma המוח בריא ^{1 , 2} . הפלישה המפוזרת הזו גורמת לגידול קשה במיוחד להתרחש באופן מלא, ותאי הסרטן הפולשים שנותרו לאחר הטיפול הם הסיבה השכיחה ביותר להישנות בלתי נמנעת ^{2 , 3 , 4} . בעבר, מצאנו מעכב את הפלישה לתאי גליומה מפוזר להיות מועיל מבחינה טיפולית ⁵ , אולם מעט ידוע על מנגנונים מורכבים התורמים פלישה GBM. הגידול microenvironment, או רקמות המקיפות את הסרטן, כבר מעורב בהתקדמות של גידולים במספר סוגי סרטן ^{6 , 7} . הגידול microivironment הגידול glioblastoma, בעמ 'ארטיקולרי, הוא יחסית מאופיין והוא מורכב במיוחד, חיבור של תאים גליה מרובים, כגון אסטרוציטים, microglia, ו oligodendrocytes, כמו גם מטריקס תאיים, גורמים מסיסים, גורמים ביו-פיזי. ניסיוני, astrocytes ו microglia הוצגו כדי להגביר את התקדמות glioma ו פלישה ^{8 , 9 , 10} , אבל את ההרכב של כל תאי גליה של microenvironment המוח האנושי אינו ידוע.

הראינו בעבר רכיבים microenvironmental יכול לחזות הישרדות המטופל על ידי כמותית ניתוח מרכיבי הסלולר של microivironment glioblastoma ושילוב הניתוחים שלנו לתוך מודל סיכונים יחסיים ¹¹ . כאן, אנו מתארים את שיטת ניתוח כמותי לזיהוי אוכלוסיות של תאים גליה בתוך הגידול בתפזורת באזורים הסמוכים של resections הגידול מחולה glioblastomaS. השתמשנו אימונוהיסטוכימיה chromogenic כדי לזהות את אוכלוסיות תאים גליה ו ImageJ לנתח את אחוז כיסוי של מכתים עבור כל האוכלוסייה גליה. הערכת אחוז כיסוי יוצר מדידה פשוטה לקביעת הבדלים מורפולוגיים של תאים, במיוחד אלה מושפעים אינטראקציות עם תאים סרטניים. מחקרים קודמים לכימות מכתים היסטופאתולוגיים משתמשים בכתמים סטנדרטיים כגון hematoxylin ו- eosin ¹² או Trichrome ¹³ של Masson, אשר אינם מנצלים את הספציפיות של מכתים אימונוהיסטוכימיים המבוססים על נוגדנים. השיטה שלנו פותחה כדי לכמת ישירות את אוכלוסיות גלייה בתוך resioblastoma החולה גידולים הגידול, אשר אנו שואפים להשתמש כדי להבהיר את microivironment glioblastoma מורכבים.

Protocol

פרוטוקול זה מזהה רכיבים סלולריים דגימות פרפין קבוע מוטבע (FFPE) מוטבע (FFPE), כפי אופייני לדגימות המטופלים קליניים. הטבעה פרפין מאפשר תחזוקה הטובה ביותר של מורפולוגיה הסלולר והרקמות, כמו גם יש אריכות ימים טובה יותר של חלקים. הדגימות המשמשות ניתוח זה היו לגשת דרך אוניברסיטת וירג 'יניה Biorepository ו מחקר רקמות מתקן. דגימות החולה נבחרו על ידי נוירופתולוג המבוסס על אבחנה סופית של גלובלסטומה (אסטרוציטומה, WHO דרגה IV), אשר סיימה את תהליך החזרת הגידול באוניברסיטה של ​​וירג'יניה בין השנים 2010 ו -2013, וזוהו לפני ניתוח זה ¹¹ .

1. FFPE דוגמה Deparaffinization ו התייבשות

הערה: חלק זה של הפרוטוקול הוא ספציפי דגימות FFPE. בעוד דגימות paraffin- מוטבע יכול להיות שימושי יותר עבור ניתוח זה בגלל שימור של תאים סלולריים ו- Tנושא מורפולוגיה, ניתוח זה יכול להיעשות גם עם חלקים קפואים. אם באמצעות מקטעים קפואים, חלק זה יכול להיות מושמט ולהמשיך ישירות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית.

1. בצע את שוטף הבא 5 דקות כל: Xylene, קסילן, אתנול 100%, אתנול 100%, אתנול 95%, אתנול 95%, אתנול 70%, מים deionized, מים deionized

2. אחזור אנטיגן

הערה: חלק זה של הפרוטוקול יש צורך לשבור גשרים מתילן נוצר במהלך קיבעון פורמלין של דגימות FFPE ולחשוף אתרי אנטיגן עבור נוגדנים לאגד.

1. לדלל טריס מבוסס גבוה pH אנטיגן מסיר פתרון על המלצה היצרן במים מזוקקים.
2. בצע אחזור אנטיגן בחום באמצעות מיקרוגל. צורות אחרות של אחזור בתיווך חום (כגון סיר לחץ, סיר אדים או מים רותחים) יספיקו גם הם.
   1. מוסיפים את פתרון מסיר מדולל לתוך מיקרוגל לא חתוםכְּלִי שַׁיִט. המקום שקופיות לתוך כלי. המקום שקופיות לתוך מיקרוגל.
   2. מרתיחים במשך 20 דקות בעוצמה גבוהה. לפקח על רמות נוזלים על אידוי, וכן לחדש עם מים מזוקקים לפי הצורך.
3. אפשר דגימות להתקרר פתרון עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.

3. אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית

1. מדגם רקמות מתאר עם עט הידרופובי כדי למזער נפח של ריאגנטים הדרושים כדי לכסות מדגם.
   הערה: הקפד לשמור על דגימות רקמות hydrated ולא נותנים להם להתייבש כמו זה ישפיע על יעילות מכתים.
2. פתרון pipet מספיק permeabilization (טריס שנאגרו מלוחים (TBS) + 0.01% Triton-X) כדי לכסות מדגם רקמות (בדרך כלל על 100-200 μL).
3. הסר וזורק פתרון וחזור על שלב 3.2.
4. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר עם פתרון חסימת (פתרון הסרום 2.5% + פתרון permeabilization).
5. דגירה דגימות לילה 4 מעלות צלסיוס עם נוגדנים ראשוניים בדילולב חסימת פתרון.
   הערה: כל נוגדנים ראשוניים המשמשים כאן הם מדולל ב 1: 200, אבל דילולים אופטימלי ניתן לקבוע באמצעות דילולים סדרתי החל עם המלצה היצרן. מידע מפורט על נוגדנים בשימוש בפרוטוקול זה פורסם בעבר ¹¹ .
6. זיהוי נוגדנים ראשוניים באמצעות חזרת peroxidase פולימדיאז מגיב המקביל עם החיה המארח העיקרי נוגדן, בעקבות פרוטוקול היצרנים.
7. פיפטה פתרון permeabilization מספיק כדי לכסות מדגם הרקמה ו דגירה במשך 5 דקות.
8. הסר וזורק פתרון וחזור על שלב 3.7.
9. דגירה שקופיות 0.3% H ₂ O ₂ ב 1x TBS במשך 15 דקות.
10. לפתח דגימות עם dixinobenzidine peroxidase (DAB) המצע עבור 2 - 10 דקות עד עוצמת הכתם הרצוי מושגת.
11. דגימות Counterstain לזהות גרעיני תאים, כגון עם hematoxylin, בעקבות פרוטוקול היצרן.
12. מייבשים דגימות עם 100%אתנול וקסילן.
13. הר דגימות לצמיתות עם התקשורת הרכבה.

4. אזורים של זיהוי אינטרסים

1. שקופיות תמונה תחת מיקרוסקופ brightfield מסוגל תמונות ברזולוציה גבוהה.
   הערה: השתמש ברכיבים סלולריים להדמיה ברזולוציה של 20x לפחות.
2. העבר מצלמה לאזורים ספציפיים של עניין בכל דגימות הרקמה.
3. שמור תמונות כקובצי TIFF לכימות.

5. ניתוח תמונה

1. פתח תמונות ב- ImageJ לכימות של כיסוי אחוזים.
2. השתמש תוסף צבע הסף כדי להסיר צבע סגול מן הגרעיני hematoxylin מוכתם.
3. המרת תמונה ל -8 סיביות.
4. הוסף סף ללא רקע כהה.
5. תהליך התמונה באמצעות אחד 17 טעון מראש מסננים סף ImageJ ( כלומר MaxEntropy) כך רק DAB מנות מוכתמות כלולים בסף.
   הערה: בחר את מסנן הסף האופטימלי מראש ש - minimizהכללה של מכתים רקע. זה יכול לסמוך על איכות מכתים וספציפיות של נוגדנים. השתמש באותו סף עבור כל משכפל טכני בתוך כל מדגם המטופל.
6. החלת סף.
7. מדוד את אזור האחוזים של התמונה הסופית.
8. ממוצע אזור כיסוי כיסוי עבור אזורים מרובים בתוך כל מדגם.

תוצאות

לצורך ניתוח זה, זוהו שני אזורים של אינטרסים בגידולים שלנו - הגידול העיקרי של הגידול והאזורים הסמוכים, המורכבים בעיקר מרקמות בריאות עם תאים סרטניים פולשים פולשים ( איור 1 א ' , 1 ב' ) - זוהו על ידי נוירופתולוג?...

Discussion

השיטה המוצעת כאן היא גישה כמותית לניתוח דגימות היסטולוגית מוכתמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית המסורתית. המתודולוגיה הנוכחית עבור סוג זה של ניתוח כולל פרוטוקולים מכתים דומים ואחריו לדירוג על ידי פתולוגים עצמאיים. שיטה זו היתה מהימנה, אולם עבור מספר יישומים, ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution	Vector Labs	H-3301
TBS
Triton-X	Amresco	9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1	abcam	ab56777
Anti-Iba1	abcam	ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1	abcam	ab53041
ImmPRESS anti-goat	Vector Labs	MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)	Vector Labs	MP-7500
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	216763
ImmPACT DAB substrate	Vector Labs	SK-4105
Hematoxylin counterstain	ThermoScientific	72404
Histochoice Mounting Media	Amresco	H157-475
Aperio Scanscope	Leica Biosystems
Image Scanscope	Leica Biosystems
Super HT PAP Pen	Research Products International	195506