Количественная иммуногистохимия клеточного микроокружения при резекции глиобластомы пациента

Резюме

Этот протокол был разработан для количественного определения компонентов микроокружения опухоли при резекциях пациентов с глиобластомой с использованием хромогенной иммуногистохимии и ImageJ.

Аннотация

С ростом интереса к микроокружению опухоли мы приступили к разработке метода специфического определения компонентов микроокружения в образцах пациентов глиобластомы, самого смертоносного и самого инвазивного рака мозга. Не только количественные методы полезны для точного описания пораженных тканей, но также могут потенциально способствовать более точному прогнозу, диагностике и разработке систем и заменяемых тканей. В глиобластоме глиальные клетки, такие как микроглия и астроциты, независимо коррелируют с плохим прогнозом, основанным на классификации патологоанатомов. Однако состояние этих клеток и других компонентов глиальных клеток не было хорошо описано количественно. Это может быть затруднено из-за больших процессов, которые отмечают эти глиальные клетки. Кроме того, большинство гистологических анализов сосредоточено на общей выборке ткани или только в пределах основной массы опухоли, в отличие от определения количественных показателей на основе областейHin сильно гетерогенной ткани. Здесь мы описываем метод идентификации и количественного анализа популяций глиальных клеток в объемной опухолевой области и смежных областях резекции опухоли у пациентов с глиобластомой. Мы использовали хромогенную иммуногистохимию для идентификации популяций глиальных клеток в резекциях опухолей пациентов и ImageJ для анализа процентного покрытия окрашивания для каждой глиальной популяции. С помощью этих методов мы можем лучше описать глиальные клетки во всех областях микроокружения опухоли глиомы.

Введение

Глиобластома (ГБМ), наиболее распространенный и злокачественный рак головного мозга, характеризуется очень диффузной инвазией от основной опухолевой массы в окружающую здоровую паренхиму головного мозга ^{1 , 2} . Это диффузное вторжение делает опухоль особенно трудной для резекции полностью, а инвазивные раковые клетки, которые остаются после терапии, являются наиболее распространенной причиной неизбежного рецидива ^{2 , 3 , 4} . Ранее мы обнаружили, что ингибирование инвазии диффузной глиомы является терапевтически полезным ⁵ , однако мало известно о сложных механизмах, способствующих вторжению GBM. Микроокружение опухоли или ткань, окружающая рак, были вовлечены в прогрессирование опухолей при множественных раковых заболеваниях ^{6 , 7} . Микроокружение опухоли глиобластомы, pСуставная, относительно недостаточно охарактеризована и является уникальным комплексом, состоящим из множественных глиальных клеток, таких как астроциты, микроглия и олигодендроциты, а также внеклеточный матрикс, растворимые факторы и биофизические факторы. Экспериментально показано, что астроциты и микроглия увеличивают прогрессию глиомы и инвазию ^{8 , 9 , 10} , но состав всех глиальных клеток в нативной микросреде мозга человека неизвестен.

Ранее мы показали, что микроэкологические компоненты могут предсказать выживаемость пациентов путем количественного анализа клеточных компонентов микроокружности глиобластомы и включения нашего анализа в модель пропорциональных рисков ¹¹ . Здесь мы описываем метод количественного анализа для идентификации популяций глиальных клеток в объеме опухоли и смежных областях резекции опухоли от пациента глиобластомыs. Мы использовали хромогенную иммуногистохимию для идентификации популяций глиальных клеток и ImageJ для анализа процентного покрытия окрашивания для каждой глиальной популяции. Оценка процентного охвата создает простое измерение для определения морфологических различий клеток, особенно тех, которые затронуты взаимодействием с раковыми клетками. В предыдущих исследованиях для количественного определения гистопатологического окрашивания использовали стандартное окрашивание, такое как гематоксилин и эозин ^12, или трихром ¹³ Массон, которые не используют специфичность окрашивания иммуногистохимическим антителом на основе антител. Наш метод был разработан для непосредственного количественного определения популяций глиальных клеток в резекциях опухоли глиобластомы, которые мы стремимся использовать для выяснения сложной микроокружности глиобластомы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Этот протокол идентифицирует клеточные компоненты в образцах, прикрепленных к формалину, прикрепленным к парафину (FFPE), что характерно для образцов клинических пациентов с бандитом. Вставка парафинов позволяет наилучшим образом поддерживать морфологию клеток и тканей, а также улучшает долговечность секций. Образцы, используемые для этого анализа, были доступны через Биорезистор Университета Вирджинии и Исследовательский центр тканей. Образцы пациентов были отобраны невропатологом на основе окончательного диагноза глиобластомы (астроцитомы, IV степени ВОЗ), которые завершили резекцию опухолей в Университете Вирджинии в период с 2010 по 2013 год и были деидентифицированы до этого анализа ¹¹ .

1. Депарафинизация и регидратация образцов FFPE

ПРИМЕЧАНИЕ. Эта часть протокола относится к образцам FFPE. В то время как образцы, встроенные в парафин, могут быть более полезными для этого анализа из-за сохранения клеточного и tМорфологию выпуска, этот анализ также может быть выполнен с замороженными разделами. При использовании замороженных секций эту часть можно опустить и перейти непосредственно к хромогенной иммуногистохимии.

1. Выполните следующие промывки по 5 мин каждый: ксилол, ксилол, 100% этанол, 100% этанол, 95% этанол, 95% этанол, 70% этанол, деионизированная вода, деионизированная вода

2. Получение антигена

ПРИМЕЧАНИЕ. Эта часть протокола необходима для разрушения метиленовых мостиков, образующихся при фиксации формалином образцов FFPE, и выявления сайтов антигена для связывания антител.

1. Разбавьте раствор анти-антигена с высоким значением pH на основе Tris по рекомендации производителя в дистиллированной воде.
2. Выполните функцию опосредованного теплом антигена, используя микроволновую печь. Также достаточно было бы использовать другие формы опосредованного теплом поиска (такие как скороварка, растительный паром или кипящая вода).
   1. Добавьте разбавленный раствор для разоблачения в герметичную микроволновую печьсудно. Поместите слайды в сосуд. Поместите слайды в микроволновую печь.
   2. Кипятите в течение 20 мин при высокой мощности. Контролируйте уровни жидкости для испарения и по мере необходимости пополняйте дистиллированной водой.
3. Дайте образцам остыть в растворе в течение 1 часа при комнатной температуре.

3. Хромогенная иммуногистохимия

1. Проведите образец ткани с помощью гидрофобного пера, чтобы свести к минимуму объем реагентов, необходимых для покрытия образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Обязательно держите образцы тканей гидратированными и не дайте им высохнуть, так как это повлияет на эффективность окрашивания.
2. Раствор достаточного количества проницаемости для растворения (трис-буферный солевой раствор (TBS) + 0,01% Triton-X) для покрытия образца ткани (обычно около 100-200 мкл).
3. Удалите и отбросьте решение и повторите шаг 3.2.
4. Инкубируйте образцы при комнатной температуре с помощью блокирующего раствора (2,5% раствора лошадиной сыворотки + пермеабилизирующий раствор).
5. Инкубируйте образцы в течение ночи в 4 ºC с разведенными первичными антителамиВ блокирующем растворе.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Все первичные антитела, используемые здесь, разводят при 1: 200, но оптимальные разведения можно определить с помощью серийных разведений, начиная с рекомендации производителя. Подробная информация об антителах, используемых в этом протоколе, была ранее опубликована ¹¹ .
6. Обнаружение первичных антител с использованием реагента полимера пероксидазы хрена, соответствующего животному-хозяину первичного антитела, по протоколу производителя.
7. Пипет достаточно для решения проницаемости для покрытия образца ткани и инкубировать в течение 5 мин.
8. Удалите и отбросьте решение и повторите шаг 3.7.
9. Инкубировать слайды в 0,3% H ₂ O ₂ в 1x TBS в течение 15 мин.
10. Разработайте образцы с субстратом пероксидазы диаминобензидина (DAB) в течение 2-10 минут до достижения желаемой интенсивности пятен.
11. Противоположные образцы для идентификации ядер клеток, таких как гематоксилин, по протоколу производителя.
12. Образцы дегидрата со 100%Этанола и ксилола.
13. Постоянно монтируйте образцы с помощью монтажных сред.

4. Идентификация регионов

1. Изображения слайдов под яркой полевой микроскопией, способной к изображениям с высоким разрешением.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте изображения сотовых компонентов с разрешением не менее 20 раз.
2. Переместите камеру в определенные области, представляющие интерес, во всех образцах тканей.
3. Сохраняйте изображения как файлы TIFF для количественной оценки.

5. Анализ изображений

1. Открывайте изображения в ImageJ для количественного определения процентного охвата.
2. Используйте плагин Threshold Color, чтобы удалить фиолетовый цвет из окрашенных гематоксилином ядер.
3. Преобразование изображения в 8 бит.
4. Добавьте порог без темного фона.
5. Образ процесса с использованием одного из 17 предварительно загруженных пороговых фильтров ImageJ ( т.е. MaxEntropy), поэтому в порог включены только окрашенные в DAB части.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Выберите оптимальный предварительно загруженный пороговый фильтр, который минимизируетВключение фонового окрашивания. Это может зависеть от качества окрашивания и специфичности антител. Используйте один и тот же порог для всех технических повторений в каждом образце пациента.
6. Применить порог.
7. Измерьте процентную область порогового изображения.
8. Среднее процентное покрытие территории для нескольких регионов в каждом образце.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для этого анализа были выявлены две области интересов в наших опухолевых резекциях - первичной опухолевой массе и смежных областях, в основном состоящих из здоровой ткани с диффузными инвазивными раковыми клетками ( фиг. 1A , 1B ) - с помощью сотр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Предлагаемый нами метод представляет собой количественный подход к анализу гистологических образцов, окрашенных с использованием традиционной хромогенной иммуногистохимии. Текущая методология для такого типа анализа включает в себя аналогичные протоколы окрашивания, за которыми ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution	Vector Labs	H-3301
TBS
Triton-X	Amresco	9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1	abcam	ab56777
Anti-Iba1	abcam	ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1	abcam	ab53041
ImmPRESS anti-goat	Vector Labs	MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)	Vector Labs	MP-7500
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	216763
ImmPACT DAB substrate	Vector Labs	SK-4105
Hematoxylin counterstain	ThermoScientific	72404
Histochoice Mounting Media	Amresco	H157-475
Aperio Scanscope	Leica Biosystems
Image Scanscope	Leica Biosystems
Super HT PAP Pen	Research Products International	195506