Immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient

Résumé

Ce protocole a été développé pour identifier quantitativement les composants de micro-environnement de la tumeur dans les résections du patient au glioblastome utilisant l'immunohistochimie chromogène et ImageJ.

Résumé

Avec l'intérêt croissant pour le micro-environnement de la tumeur, nous nous sommes mis à développer une méthode pour déterminer spécifiquement les composants de micro-environnement dans les échantillons de patients de glioblastome, le cancer du cerveau le plus mortel et le plus invasif. Non seulement les méthodes quantitatives sont-elles bénéfiques pour décrire avec précision les tissus malades, mais peuvent également contribuer à un pronostic plus précis, au diagnostic et au développement de systèmes et de remplacements tissulaires. Dans le glioblastome, les cellules gliales, telles que la microglie et les astrocytes, ont été corrélées indépendamment avec un mauvais pronostic basé sur le classement des pathologistes. Cependant, l'état de ces cellules et d'autres composants des cellules gliales n'a pas été bien décrit de manière quantitative. Cela peut être difficile en raison des grands processus qui marquent ces cellules gliales. En outre, la plupart des analyses histologiques se concentrent sur l'échantillon de tissu global ou seulement dans la masse de la tumeur, par opposition à la délimitation de quantifications basées sur des régionsDans le tissu hautement hétérogène. Ici, nous décrivons une méthode pour identifier et analyser quantitativement les populations de cellules gliales dans la masse tumorale et les régions adjacentes de résections tumorales des patients atteints de glioblastome. Nous avons utilisé l'immunohistochimie chromogène pour identifier les populations de cellules gliales dans les résections tumorales des patients et ImageJ pour analyser la couverture en pourcentage de la coloration pour chaque population gliale. Avec ces techniques, nous sommes en mesure de mieux décrire les cellules gliales dans toutes les régions du micro-environnement de la tumeur du gliome.

Introduction

Le glioblastome (GBM), le cancer du cerveau le plus fréquent et le malin, se caractérise par une invasion très diffuse de la masse tumorale primaire dans le parenchyme ^{1 , 2 du} cerveau sain environnant. Cette invasion diffuse rend la tumeur particulièrement difficile à résister pleinement, et les cellules cancéreuses envahissantes qui restent post-thérapeutique sont la raison la plus fréquente pour la récurrence inévitable ^{2 , 3 , 4} . Auparavant, nous avons constaté que l'invasion de cellules de gliome diffus était bénéfique sur le plan thérapeutique ⁵ , mais on sait peu de choses sur les mécanismes complexes contribuant à l'invasion GBM. Le micro-environnement tumoral, ou le tissu entourant le cancer, a été impliqué dans la progression des tumeurs dans de multiples cancers ^{6 , 7} . Le micro-environnement de la tumeur du glioblastome, en pArticulaire, est relativement sous-caractéristique et est exclusivement complexe, composée de cellules gliales multiples, telles que les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes, ainsi que la matrice extracellulaire, les facteurs solubles et les facteurs biophysiques. D'une manière expérimentale, les astrocytes et la microglie ont montré une augmentation de la progression du gliome et de l'invasion ^{8 , 9 , 10} , mais la composition de toutes les cellules gliales dans le microenvironnement du cerveau humain natif est inconnue.

Nous avons déjà montré que les composants microenvironnaires peuvent prédire la survie du patient en analysant quantitativement les composants cellulaires du micro-environnement du glioblastome et en incorporant nos analyses dans un modèle de risques proportionnels ¹¹ . Ici, nous décrivons la méthode d'analyse quantitative pour identifier les populations de cellules gliales dans la masse tumorale et les régions adjacentes de résections tumorales du patient au glioblastomeS. Nous avons utilisé l'immunohistochimie chromogène pour identifier les populations de cellules gliales et ImageJ pour analyser la couverture en pourcentage de la coloration pour chaque population gliale. L'évaluation du pourcentage de couverture crée une mesure simple pour déterminer les différences morphologiques des cellules, en particulier celles affectées par les interactions avec les cellules cancéreuses. Des études antérieures pour quantifier la coloration histopathologique utilisent une coloration standard telle que l'hématoxyline et l'éosine ¹² ou le trichrome de Masson ¹³ , qui ne profitent pas de la spécificité de la coloration par immunohistochimie à base d'anticorps. Notre méthode a été développée pour quantifier directement les populations de gliales dans les résections de tumeur du patient liées au glioblastome, que nous visons à utiliser pour élucider le micro-environnement complexe du glioblastome.

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Protocole

Ce protocole identifie les composants cellulaires dans les échantillons intégrés à la paraffine fixée au formol (FFPE), comme c'est le cas pour les échantillons de patients cliniques bancés. L'encastrement de la paraffine permet le meilleur entretien de la morphologie cellulaire et tissulaire ainsi que la meilleure longévité des sections. Les échantillons utilisés pour cette analyse ont été consultés par l'intermédiaire de l'Université de Virginia Biorepository and Tissue Research Facility. Les échantillons de patients ont été sélectionnés par un neuropathologue sur la base d'un diagnostic définitif de glioblastome (astrocytome, grade IV de l'OMS) qui avaient terminé les résections tumorales à l'Université de Virginie entre 2010 et 2013 et ont été désidentifiés avant cette analyse ¹¹ .

1. Déparaffinisation et réhydratation des échantillons FFPE

REMARQUE: cette partie du protocole est spécifique aux échantillons FFPE. Alors que les échantillons intégrés à la paraffine peuvent être plus utiles pour cette analyse en raison de la préservation de la cellule et de la tProblème de morphologie, cette analyse peut également être effectuée avec des sections gelées. Si vous utilisez des sections congelées, cette partie peut être omise et procéder directement à l'immunohistochimie chromogène.

1. Effectuez les lavages suivants pendant 5 min chacun: Xylène, Xylène, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Éthanol, 70% Éthanol, Eau désionisée, Eau désionisée

2. Antigen Retrieval

REMARQUE: Cette partie du protocole est nécessaire pour casser les ponts méthylène formés lors de la fixation du formol des échantillons FFPE et exposer les sites antigéniques pour les anticorps qui se lient.

1. Diluer la solution de démasquage de l'antigène à pH élevé à base de Tris à la recommandation du fabricant dans l'eau distillée.
2. Effectuer une récupération d'antigène à médiation thermique à l'aide d'un micro-ondes. D'autres formes de récupération médiée par la chaleur (comme la cuisinière à pression, le vaporisateur végétal ou l'eau bouillante) suffiraient également.
   1. Ajouter la solution de démasquage diluée dans un micro-ondes non scellénavire. Placez les glissières dans le récipient. Placez les toboggans dans le micro-ondes.
   2. Faire bouillir pendant 20 min à haute puissance. Surveiller les niveaux de liquide pour l'évaporation, et reconstituer avec de l'eau distillée si nécessaire.
3. Autoriser les échantillons à refroidir en solution pendant 1 h à température ambiante.

3. Immunohistochimie chromogène

1. Décrire l'échantillon de tissu avec un stylo hydrophobe pour minimiser le volume de réactifs nécessaires pour couvrir l'échantillon.
   REMARQUE: Assurez-vous de garder les échantillons de tissus hydratés et ne les laissez pas sécher car cela affectera l'efficacité de la coloration.
2. Pipeter suffisamment de solution de perméabilisation (Tris-buffered saline (TBS) + 0,01% Triton-X) pour couvrir l'échantillon de tissu (typiquement environ 100 à 200 μL).
3. Supprimez et jetez la solution et répétez l'étape 3.2.
4. Incuber les échantillons à température ambiante avec une solution de blocage (2,5% de sérum de cheval + solution de perméabilisation).
5. Incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ºC avec des anticorps primaires diluésEn solution de blocage.
   NOTE: Tous les anticorps primaires utilisés ici sont dilués à 1: 200, mais des dilutions optimales peuvent être déterminées à l'aide de dilutions en série, en commençant par la recommandation du fabricant. Des informations détaillées sur les anticorps utilisés dans ce protocole ont déjà été publiées ¹¹ .
6. Détecter les anticorps primaires en utilisant un réactif polymère de peroxydase de raifort correspondant à l'animal hôte d'anticorps primaire, suivant le protocole du fabricant.
7. Pipeter suffisamment de solution de perméabilisation pour couvrir l'échantillon de tissu et incuber pendant 5 minutes.
8. Retirez et jetez la solution et répétez l'étape 3.7.
9. Incuber les diapositives dans 0,3% de H ₂ O ₂ dans 1x TBS pendant 15 min.
10. Développer des échantillons avec un substrat de peroxydase diaminobenzidine (DAB) pendant 2 à 10 min jusqu'à ce que l'intensité de tache souhaitée soit atteinte.
11. Contrôler les échantillons pour identifier les noyaux cellulaires, par exemple avec l'hématoxyline, selon le protocole du fabricant.
12. Déshydratez des échantillons avec 100%L'éthanol et le xylène.
13. Monter des échantillons en permanence avec des supports de montage.

4. Identification des régions d'intérêt

1. Diapositives d'images sous microscope à champ lumineux capable d'images haute résolution.
   REMARQUE: Utilisez les composants cellulaires d'imagerie à une résolution minimale de 20x.
2. Déplacez la caméra vers des régions d'intérêt spécifiques tout au long des échantillons de tissus.
3. Enregistrez les images en tant que fichiers TIFF pour la quantification.

5. Analyse d'image

1. Ouvrez les images dans ImageJ pour la quantification du pourcentage de couverture.
2. Utilisez le plug-in Threshold Color pour supprimer la couleur pourpre des noyaux colorés à l'hématoxyline.
3. Convertir l'image en 8 bits.
4. Ajouter un seuil sans arrière-plan sombre.
5. Traitez l'image en utilisant l'un des 17 filtres de seuil ImageJ pré-chargés ( c'est-à-dire MaxEntropy), de sorte que seulement les portions colorées DAB sont incluses dans le seuil.
   REMARQUE: sélectionnez le filtre de seuil préchargé optimal qui minimiseEs inclusion de la coloration d'arrière-plan. Cela peut dépendre de la qualité de la coloration et de la spécificité des anticorps. Utilisez le même seuil pour toutes les réplications techniques dans chaque échantillon de patient.
6. Appliquer le seuil.
7. Mesurez la superficie en pourcentage de l'image de seuil.
8. Coefficient de couverture en pourcentage moyen pour plusieurs régions dans chaque échantillon.

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Résultats

Pour cette analyse, deux régions d'intérêt dans nos résections tumorales - la masse tumorale primaire et les régions adjacentes, principalement composées de tissu sain avec des cellules cancéreuses envahissantes diffuses ( Figure 1A , 1B ) - ont été identifiées par des neuropathologues collaborateurs sur l'hématoxyline et le patient coloré à l'éosine Échantillons. Dans chaque échantillon de patient, on a identifi?...

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Discussion

Notre méthode proposée ici est une approche quantitative pour analyser des échantillons histologiques colorés en utilisant une immunohistochimie chromogène traditionnelle. La méthodologie actuelle pour ce type d'analyse comprend des protocoles de coloration similaires suivis d'un classement par des pathologistes indépendants. Cette méthode a été fiable, mais pour un certain nombre d'applications, une compréhension plus précise du maquillage cellulaire est nécessaire, comme une meilleure compréh...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Chemical	X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution	Vector Labs	H-3301
TBS
Triton-X	Amresco	9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1	abcam	ab56777
Anti-Iba1	abcam	ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1	abcam	ab53041
ImmPRESS anti-goat	Vector Labs	MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)	Vector Labs	MP-7500
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	216763
ImmPACT DAB substrate	Vector Labs	SK-4105
Hematoxylin counterstain	ThermoScientific	72404
Histochoice Mounting Media	Amresco	H157-475
Aperio Scanscope	Leica Biosystems
Image Scanscope	Leica Biosystems
Super HT PAP Pen	Research Products International	195506