Respuesta auditiva del médula oblonga y la célula de pelo externa celulares parche abrazadera grabación en ratas postnatales

Resumen

Este protocolo describe métodos para registrar la respuesta auditiva del médula oblonga de crías de rata postnatal. Para examinar el desarrollo funcional de las células de pelo externas, el procedimiento experimental de la abrazadera del remiendo de célula entera en aisladas células de pelo externas se describe paso a paso.

Resumen

La célula de pelo externa es uno de los dos tipos de células de pelo sensoriales en la cóclea mamífera. Modificar la longitud de su celular con el receptor potencial para amplificar la vibración débil de señal de bajo nivel sonoro. La morfología y propiedades electrofisiológicas de las células ciliadas externas (CCE) se convierten en edad postnatal. La maduración de la célula de pelo externa puede contribuir al desarrollo del sistema auditivo. Sin embargo, el proceso de desarrollo de la CCE no se estudia bien. Esto es en parte debido a la dificultad para medir su función mediante un método electrofisiológico. Con el fin de desarrollar un método simple para solucionar el problema anterior, aquí se describe un protocolo paso a paso para estudiar la función del CCE en agudo disociado cóclea de ratas postnatales. Con este método, podemos evaluar la respuesta coclear al estímulo de tono puro y examinar el nivel de expresión y la función de la proteína motora prestin en CCE. Este método también puede utilizarse para investigar las células ciliadas internas (CCI).

Introducción

Dos funciones distintas de las células de pelo sensoriales cocleares son esenciales para mamíferos de audición: transducción de mechanoelectric (MET) y electromotilidad^1,2. Por MET canales en el paquete de cabello, ciliadas (CCI) y CCE convertir la vibración sonora en cambios de potencial de membrana, así como las señales eléctricas de las neuronas del ganglio espiral inervada. OHCs cambian su longitud de la célula con el potencial de membrana y amplifican la vibración del sonido de bajo nivel. Esta actividad denominada electromotilidad es derivada por la proteína motora prestin situado en la pared lateral del CCE³.

En muchas especies como roedores, la función auditiva es inmadura en la época postnatal temprana^4,5. Ningún potencial de acción en respuesta a señales de sonido podría ser detectado en la corteza auditiva antes de la audiencia Inicio^6,7. Desarrollo de la morfología y función de la cóclea ha sido ampliamente estudiadas en el ratón, jerbo y rata^4,5,8. La mecanotransducción y electromotilidad de las células de pelo también se desarrollan en la primera época de vida⁵.

Para evaluar la sensibilidad auditiva de ratas a diferentes edades postnatales, hemos desarrollado un método de respuesta auditiva del médula oblonga (ABR) en crías de rata. Abrazadera del remiendo de celulares es una tecnología ideal para investigar la CCE electrophysiologically. Sin embargo, en comparación con la abrazadera del remiendo en las neuronas y otras células epiteliales, la baja tasa de células completas sellado limitada la investigación de electromotilidad de CCE aislada.

Aquí describimos un procedimiento para investigar la CCE morfológicamente y electrophysiologically en agudo disociado cóclea de ratas postnatales. Este método puede ser modificado para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la función y el desarrollo de la célula de pelo interna.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales con sujetos animales fueron aprobados por el Comité de ética Animal de la Universidad de médica sur.

1. Preparar soluciones para experimentos

1. Preparar la anestesia (véase Tabla de materiales): 1,5% pentobarbital sódico disuelto en ddH₂O.
2. Preparar la solución de disección (véase Tabla de materiales): disolver una bolsa de polvo de L-15 de Leiboviz en 1 L de ddH₂O. Ajuste del pH a 7.3 con 1 M NaOH. Ajuste la osmolaridad a 300-330 mOsm mediante un osmómetro y 10 mM HEPES antes de su uso.
3. Disolver 2 mg/mL colagenasa IV (véase Tabla de materiales) en la solución de disección preparada en el paso 1.2.
4. Preparar las soluciones de inmunotinción (véase Tabla de materiales): disolver el paraformaldehído al 4% en tampón fosfato salino (PBS).
   PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada.
5. Diluir al agente de permeabilidad de 0.3% en PBS. Diluir el suero de cabra normal de 10% en PBS como el amortiguador de bloqueo. Diluir el anticuerpo de prestin 1: 200 en solución amortiguadora de bloqueo. Diluir el anticuerpo conjugado con Alexa488 1: 600 en solución amortiguadora de bloqueo. Diluir el Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isotiocianato 1: 200 en PBS.
6. Preparar la solución extracelular (véase Tabla de materiales): preparar medio de L-15 de Leiboviz como se describe anteriormente (paso 1.2).
7. Preparar la solución intracelular (véase Tabla de materiales).

2. grabación de ABR

Nota: Grabación de ABR se ha descrito previamente en detalle en nuestro anterior estudio⁹.

1. Anestesiar ratas Sprague Dawley (SD) (cachorros de 1-14 días y 2 meses de edad adultos, ambos sexos) con una sola inyección de pentobarbital de sodio 1.5% (22 mg/kg para crías y 30 mg/kg para los adultos, intraperitoneales (i.p.)).
2. Colocar el animal anestesiado en un molde de espuma de polietileno para inmovilizar el cuerpo del animal. Coloque el animal en una mesa antivibración en una sala de atenuación de sonido. Mantener la temperatura corporal del animal a 37,5 ° C con una almohadilla de calefacción.
3. Limpie el área de la cabeza con etanol al 70% (vol/vol). Utilizando unas tijeras finas, realizar una incisión de 1-2 mm ventrolateral en el pabellón auricular externo para colocar el electrodo de referencia o tierra. Un electrodo de aguja subdérmicos (electrodo de la grabación) está situado sobre el vértice del cráneo (figura 1A).
4. Utilizando el generador de funciones, generar explosiones de tono calibrado (1 ms de subida/bajada, meseta de 3 ms) de distintas frecuencias (2, 4, 8, 16, 24 y 32 kHz) e intensidades (se redujo de 85 a 10 dB SPL en el paso de 5 dB). Variar la frecuencia y amplitud manualmente o utilizando un ordenador. Entregan estímulos de sonido a través de un altavoz electrostático situado 10 cm a hacia la cabeza del animal.
5. Filtro (100-1.000 Hz), amplificar y promedio (256 veces) el potencial provocó sonido usando un procesador de múltiples funciones para conseguir el ABRs. Los rastros ABR se monitorea en línea y almacenados para análisis fuera de línea. Tarda unos 40 minutos para completar la grabación de un animal ABR.
   Nota: Generalmente, de tres a siete picos (onda onda VII) con latencias inferior a 15 ms puede ser identificado (figura 1B). El umbral ABR se define como el mínimo nivel sonoro en el que la onda I y II podríamos detectar.
6. Eutanasia antes los animales despiertos de la anestesia (con una inyección intraperitoneal de pentobarbital de sodio de 1.5% 0,3 mL).

3. la disección del órgano de Corti (OC)

1. Anestesiar crías de rata. Para las ratas menos de 6 días de edad (< P6), mantener al animal en una placa de cultivo de 100 mm y cubrir el plato con hielo durante 10 minutos. Para ratas > P6, anestesiar al animal con una sola inyección de pentobarbital de sodio 1.5% (22 mg/kg, i.p.). Decapita a las crías de rata después de la anestesia.
2. Esterilizar la cabeza rociando con etanol al 70% (vol/vol).
3. Abrir el cráneo a lo largo de la línea media sagital con tijeras; quitar el cerebro para exponer el oído interno.
4. De transferencia del oído interno en un plato de Petri de 35 mm con 3 mL de helado L-15 (figura 2A).
5. Bajo el microscopio de disección, usar pinzas finas para quitar la cápsula ósea de la cóclea (figura 2B).
6. Desenvuelva el OC y asociados estría vascular (SV) desde el modiolus.
7. Mediante la celebración de la porción basal de la SV con pinzas, separar el OC SV totalmente desenrollando lentamente desde la base al ápice (figura 2).
8. Trocear el OC uniformemente tres usando tijeras finas (Figura 2D).

4. tinción de inmunofluorescencia de

1. Utilizando una pipeta de 200 μL, transferencia de los segmentos de OC (paso 3.8) sobre un portaobjetos de vidrio y fijar con 100 μl de paraformaldehído al 4% durante al menos 4 h a 4 ° C.
   PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxica; usar protección adecuada.
2. Lavar el tejido por desplazar el paraformaldehido con 100 μl de PBS fresco. Lavar el tejido tres veces durante 10 minutos.
3. Incubar el tejido con el agente de permeabilidad de 0.3% en PBS durante 30 min a temperatura ambiente.
4. Desechar al agente de permeabilidad en PBS y lave el tejido tres veces con PBS.
5. Bloque con 10% de suero normal de cabra en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
6. Incubar con el anticuerpo anti-prestin-C-terminal (1: 200) en el bloqueo de solución por 2 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la noche.
7. Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos.
8. Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa488 (1: 600) en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
9. Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos en la oscuridad.
10. Incubar 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad con rodamina-phalloidin (1: 200).
11. Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos en la oscuridad.
12. Montar en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje (contiene DAPI). Imagen con microscopía confocal usando 405 nanómetro, 488 nanómetro y láseres de 594 nm. Ajustar la potencia del láser en 0.1-0.5 mW y la exploración de la velocidad en 0,5 fotogramas/s.

5. Patch clamp grabación de CCE aisladas

1. Utilizar el extractor de la pipeta y micro-falsificador para hacer parche pipetas con un diámetro de punta 2-3 μm. Back-fill las pipetas con solución intracelular. Generalmente, la resistencia inicial de pipeta patch fue 2.5-3.5 MΩ en la solución del baño.
2. Utilizando una pipeta de 200 μL, transferir un trozo de la OC (de paso 3.8) en una placa de Petri de 35 mm. Digerir el tejido con 100 μl de medio de digestión enzimática (colagenasa IV, véase Tabla de materiales) por 5 min a temperatura ambiente.
3. Desplazar el medio de la digestión enzimática con 100 μl de L-15. Cortar el tejido en pequeños trozos con un bisturí micro para aislar las células de pelo.
4. Después de su uso suave, transferir las células a una pequeña cámara de plástico casera (diámetro ~ 1,5 cm) llena de solución de baño enzima (~ 1,5 mL, ver Tabla de materiales).
5. Coloque la cámara sobre la platina de un microscopio invertido. Encontrar el CCE solitario sanos que aparecen.
6. Cargar la pipeta de parche en el escenario principal de un amplificador 700B. Mover con cuidado la pipeta patch un micromanipulador y colocarlo alrededor de la parte inferior de la célula de pelo externa (Figura 3A).
7. Abrazadera del remiendo de celulares la CCE sellando la pared lateral del cuerpo celular. Luz succione hasta que se rompe la membrana celular. Establecer la explotación potencial en -70 mV. Células con acceso varió de 10 a 17 MΩ resistenciaa la membrana oscilan entre 100 y 500 MΩ y se consideran una acertada configuración de celulares.
8. Utilizando control de computadora, aplique hiperpolarizantes y despolarizantes voltaje (250 ms de duración y hasta de −140 + 94 mV en 13 pasos de mV) a la celda para obtener celulares corrientes.
9. Amplificar las corrientes celulares, (frecuencia de 5 kHz) del filtro por un amplificador 700B. Convertir los datos de un conversor de 1440A y tienda para análisis fuera de línea.
10. Medir la capacitancia de la membrana de CCE usando un protocolo de estímulo dos sinusoidal voltaje controlado por un software de abrazadera del remiendo. Fijar la gama de voltaje de estimular de -140 a 110 mV. Almacenar los datos para el análisis fuera de línea.

Resultados

ABR puede sacado de rata anestesiados cachorros mayores de día postnatal 7 (P7) utilizando ráfagas de tono puro (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, las formas de onda ABR obtienen de crías de rata demostradas solamente tres o cuatro distintas ondas con amplitud pequeña. Generalmente, hasta siete picos se observaron en las formas de onda ABR de animales adultos (figura 1B).

Discusión

En las ratas más jóvenes que el día 11, no pudo observarse ningún potencial de acción en respuesta a la estimulación sonora en la corteza auditiva^6,7. Por lo tanto, día postnatal 11 se describe como "Inicio de la audiencia"¹⁰. El desarrollo de la función auditiva antes de inicio de la audiencia no fue estudiado bien todavía. El método similar para la grabación de ABR adultos, demostramos que abr podría ser provocada por ráfaga...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	1.5% in water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
Collagenase IV	Sigma	C5138	2 mg/mL in L-15
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	PH 7.3
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4% in PBS
Triton X-100	Amresco	ZS-0694	0.3% in PBS
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	10000C	10% in PBS
prestin antibody	Santa Cruz	SC-22694	dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11055	dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	dil 1:200
DAPI	Solarbio	C0060	dil 1:20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
CsCl	Sigma	7647-17-8	140 mM
MgCl2	Sigma	7791-18-6	2 mM
EGTA	Sigma	67-42-5	10 mM
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Osmometer	Gonotec	OSMOMAT 3000 basic
Forcep	WPI	14095	Tweezers dumont
Micropipette puller	Sutter Instrument	MODLE-P97
Micro Forge	Narishigen	MF-830
Mini Operating System	Sutter Instrument	MP-285
MultiClamp	Axon	700B
Low-Noise Data Acquisition System	Axon	1440A
ES1 speaker	Tucker-Davis Technologies
TDT system 3	Tucker-Davis Technologies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
SigGenRP software	Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software	Tucker-Davis Technologies
jClamp	Scientific Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
SD rat	Experimental Animal Center of Southern Medical University