Réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes Whole-cell Patch Clamp enregistrement chez le rat Postnatal

Résumé

Ce protocole décrit les méthodes pour enregistrer la réponse auditif du tronc cérébral de ratons postnatal. Pour examiner le développement fonctionnel des cellules ciliées externes, la procédure expérimentale de cellules entières patch clamp d’enregistrement en isolé les cellules ciliées externes est décrit étape par étape.

Résumé

Les cellules ciliées externes est l’un des deux types de sensorielle des cellules ciliées de la cochlée mammifères. Ils modifient leur longueur des cellules avec le récepteur potentiel pour amplifier la vibration faible du signal sonore à basse altitude. La morphologie et la propriété électrophysiologique des cellules ciliées externes (contaminants organohalogénés) se développent dans l’âge postnatal précoce. La maturation des cellules ciliées externes peut-être contribuer au développement du système auditif. Toutefois, le processus de développement de contaminants organohalogénés n’est pas bien étudié. C’est en partie à cause de la difficulté à mesurer leur fonction par une approche électrophysiologique. Dans le but de développer une méthode simple pour résoudre le problème ci-dessus, nous décrivons ici un protocole étape par étape pour étudier la fonction des contaminants organohalogénés cochlée aiguë dissociés des rats postnatals. Avec cette méthode, nous pouvons évaluer la cochléaire réponse à des stimuli de sons purs et examiner le niveau d’expression et la fonction de la protéine motrice de prestin en contaminants organohalogénés. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier les cellules ciliées internes (CSI).

Introduction

Deux fonctions distinctes de cellules de cheveux sensoriels cochléaires sont essentielles pour l’audience chez les mammifères : mechanoelectric transduction (MET) et electromotility^1,2. Par MET les canaux situés dans le faisceau de cheveux, CSI (CSI) et contaminants organohalogénés convertir les vibrations sonores des changements potentiels de membrane, ainsi que les signaux électriques des neurones du ganglion spiral innervés. Contaminants organohalogénés changent leur longueur avec le potentiel de membrane des cellules et amplifient la vibration du son à basse altitude. Cette activité appelée electromotility est dérivée de la protéine motrice prestin situé dans la paroi latérale des contaminants organohalogénés³.

Chez de nombreuses espèces, y compris les rongeurs, la fonction auditive est immature à l’époque postnatale précoce^4,5. Aucun potentiel d’action en réponse aux signaux sonores ne pourraient être détectée dans le cortex auditif avant l’audience début^6,7. Développement de la morphologie et le fonctionnement de la cochlée a été largement étudiées en souris, gerbille et rat^4,5,8. La mécanotransduction et electromotility des cellules ciliées sont également développées dans la première époque de vie⁵.

Afin d’évaluer la sensibilité auditive des rats à différents âges postnatals, nous avons développé une méthode de réaction auditif du tronc cérébral (PEATC) enregistrement chez les ratons. Cellule entière patch clamp d’est une technologie idéale pour enquêter sur les contaminants organohalogénés électrophysiologique. Toutefois, le faible taux de cellules entières d’étanchéité en comparaison avec le patch clamp de jouée dans les neurones et autres cellules épithéliales, limité l’enquête d’electromotility des contaminants organohalogénés isolés.

Ici, nous décrivons une procédure pour enquêter sur les contaminants organohalogénés morphologiquement et électrophysiologique dans la cochlée aiguë dissociée des rats postnatals. Cette méthode peut être modifiée afin d’étudier les mécanismes moléculaires qui régissent la fonction et le développement des cellules ciliées internes.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux avec des sujets animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale du Sud.

1. préparer des Solutions pour des expériences

1. Préparer l’anesthésique (voir Table des matières) : 1,5 % pentobarbital sodique dissous dans ddH₂O.
2. Préparer la solution de dissection (voir Table des matières) : dissoudre un sachet de poudre de L-15 de Leiboviz dans 1 L de ddH₂O. ajuster le pH à 7,3 avec 1 NaOH M. Ajuster l’osmolarité à 300-330 mOsm en utilisant un osmomètre et 10 mM HEPES avant utilisation.
3. Dissoudre 2 mg/mL collagénase IV (voir Table des matières) dans une solution de dissection préparée à l’étape 1.2.
4. Préparer les solutions d’immunomarquage (voir Table des matières) : dissoudre la paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter une protection appropriée.
5. Diluer l’agent de perméabilité de 0,3 % dans du PBS. Diluer le sérum de chèvre normal de 10 % dans du PBS comme le tampon de blocage. Diluer au 1 : 200 prestin anticorps dans un tampon bloquant. Diluer l’anticorps conjugué Alexa488 de 1:600 dans un tampon bloquant. Diluer la phalloïdine-tétraméthylrhodamine B isothiocyanate 1 : 200 en PBS.
6. Préparer la solution extracellulaire (voir Table des matières) : préparer le milieu de L-15 de la Leiboviz comme décrit ci-dessus (étape 1.2).
7. Préparer la solution intracellulaire (voir Table des matières).

2. ABR enregistrement

NOTE : Enregistrement ABR a été précédemment décrit en détail dans notre précédente étude⁹.

1. Anesthésier des rats Sprague Dawley (SD) (1 à 14 jours de vieux petits et adultes 2 - mois vieux, les deux sexes) avec une seule injection de 1,5 % sodium pentobarbital (22 mg/kg pour les petits et 30 mg/kg pour les adultes, intrapéritonéales (i.p.)).
2. Placez l’animal anesthésié dans un moule de mousse polyéthylène pour immobiliser le corps de l’animal. Placer l’animal dans une table anti-vibration dans une chambre forte atténuation sonore. Maintenir la température de corps de l’animal à 37,5 ° C, avec un coussin chauffant.
3. Essuyer la zone tête d’éthanol à 70 % (vol/vol). En utilisant des ciseaux, faire une incision de 1 à 2 mm ventro à l’externe pinna pour placer l’électrode de référence ou le sol. Une électrode à aiguille hypodermique (électrode d’enregistrement) est située sur le sommet du crâne (Figure 1 a).
4. En utilisant le générateur de fonctions, générer des rafales de ton calibré (montée/descente de 1 ms, 3 ms plateau) de diverses fréquences (2, 4, 8, 16, 24 et 32 kHz) et les intensités (a diminué de 85 à 10 dB SPL à l’étape 5 dB). Varier la fréquence et l’amplitude manuellement ou à l’aide d’un ordinateur. Livrer des stimuli sonores grâce à un haut-parleur électrostatique situé 10 cm loin vers la tête de l’animal.
5. Filtre (100-1 000 Hz), amplifier et moyenne (256 fois) le potentiel sonore ont incité, en utilisant un processeur multi-function pour obtenir l’abr. Les traces de l’ABR est contrôlé en ligne et stockées pour l’analyse hors ligne. Il faut environ 40 min, pour compléter l’ABR enregistrement à partir d’un animal.
   Remarque : En général, trois à sept sommets (j’ai vague à vague VII) avec des latences inférieures à 15 ms peut être identifié (Figure 1 b). Le seuil ABR est défini comme le niveau sonore minimal à laquelle vague I et II pourrait être détecté.
6. Euthanasier avant les animaux éveillés de l’anesthésie (avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium 0,3 mL 1,5 %).

3. la Dissection de l’organe de Corti (OC)

1. Anesthésier les ratons. Chez les rats âgés de moins de 6 jours (< P6), garder l’animal dans une boîte de Petri de 100 mm et couvrir le plat avec de la glace pendant 10 min. Pour les rats > P6, anesthésier l’animal avec une seule injection de 1,5 % le pentobarbital de sodium (22 mg/kg, i.p.). Décapiter les ratons après l’anesthésie.
2. Stérilisez la tête par pulvérisation d’éthanol à 70 % (vol/vol).
3. Ouvrir le crâne, le long de la ligne sagittale médiane avec des ciseaux ; enlever le cerveau afin d’exposer l’oreille interne.
4. Transférer l’oreille interne dans une boite de Petri 35 mm contenant 3 mL de L-15 glacée (Figure 2 a).
5. Sous le microscope à dissection, utiliser une pince fine pour retirer la capsule osseuse de la cochlée (Figure 2 b).
6. Déballer l’OC et associés strie vasculaire (SV) du modiolus.
7. En tenant la partie basale de la SV avec une pince, séparer l’OC de la SV complètement en déroulant lentement de base à l’apex (Figure 2).
8. Couper l’OC uniformément en trois morceaux à l’aide des ciseaux fins (Figure 2D).

4. immunofluorescence souillant

1. À l’aide d’une pointe de pipette 200 µL, transférer les segments d’OC (étape 3,8) sur une lame de verre et fixer avec 100 µL de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 4 h à 4 ° C.
   ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter une protection appropriée.
2. Laver le tissu en déplaçant la paraformaldéhyde avec 100 µL de PBS frais. Laver le tissu trois fois pendant 10 min.
3. Incuber le tissu avec agent de perméabilité de 0,3 % dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.
4. Jeter l’agent de perméabilité dans du PBS et laver le tissu trois fois avec du PBS.
5. Bloc avec 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
6. Incubez avec anticorps anti-prestin-C-terminale (1 : 200) en bloquant la solution pendant 2 h à température ambiante ou à 4 ° C durant la nuit.
7. Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min.
8. Incuber les anticorps secondaire conjugué Alexa488 (1:600) dans la solution de saturation pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
9. Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min dans le noir.
10. Incubez avec rhodamine-phalloïdine (1 : 200) pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
11. Laver trois fois avec du PBS pendant 5 min dans le noir.
12. Monter sur une lame de verre avec support de montage (contenant le DAPI). Image par microscopie confocale à l’aide de 405 nm, 488 nm et 594 nm lasers. La valeur de la puissance du laser à 0,1 à 0,5 mW et le scan vitesses à 0,5 frame/s.

5. Patch clamp enregistrement des contaminants organohalogénés isolé

1. Utiliser l’extracteur de pipette et micro-faussaire faire patch pipettes avec un diamètre de pointe, 2 à 3 µm. remblayer les pipettes avec solution intracellulaire. Habituellement, la résistance initiale de pipette de patch a été MΩ de 2,5 à 3,5 dans une solution de bain.
2. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 µL, transférer un morceau de l’OC (de l’étape 3,8) dans une boîte de Pétri de 35 mm. Digérer le tissu avec 100 µL de milieu de digestion enzymatique (collagénase IV, voir Table des matières) pendant 5 min à température ambiante.
3. Déplacer le milieu de digestion enzymatique avec 100 µL de L-15. Couper le tissu en petits morceaux à l’aide d’un scalpel micro pour isoler les cellules ciliées.
4. Après pipetage douce, transférer les cellules dans une petite chambre en plastique fait maison (diamètre ~ 1,5 cm) rempli de solution bain sans enzymes (~ 1,5 mL, voir Table des matières).
5. Placez la chambre sur la scène d’un microscope inversé. Trouver les contaminants organohalogénés solitaires apparemment en bonne santé.
6. Charger la pipette dans la scène en tête d’un amplificateur de 700 b. Déplacer la pipette avec soin par un micromanipulateur et positionnez-le autour du fond de la cellules ciliées externes (Figure 3 a).
7. Cellule entière patch clamp de la CPO en scellant la paroi latérale du corps cellulaire. Applique lumière d’aspiration jusqu'à ce que la membrane cellulaire est rompue. Définir l’exploitation potentielle à -70 mV. Avec accès résistance varie entre 10 et 17 MΩ et la résistance de la membrane des cellules allant de 100 à 500 MΩ et sont considérés comme une configuration réussie de la cellule entière.
8. À l’aide de la commande par ordinateur, appliquer hyperpolarisant et dépolarisantes tension (durée de 250 ms et allant de −140 à + 94 mV en 13 étapes mV) à la cellule pour susciter des courants de cellules entières.
9. Amplifier les courants de la cellule entière, filtrer (fréquence de coupure de 5 kHz) par un amplificateur de 700 b. Convertir les données par un convertisseur de 1440A et le magasin pour l’analyse hors ligne.
10. Mesurer la capacité de la membrane des contaminants organohalogénés en utilisant un protocole de stimulation de tension deux sinusoïdale contrôlé par un logiciel de patch clamp. Régler la gamme de tension de stimuler de -140 à 110 mV. Stocker les données pour l’analyse hors ligne.

Résultats

ABR peut être déclenché de rat anesthésié petits plus vieux que le jour après la naissance 7 (P7) à l’aide de salves de sons purs (Figure 1 a). Comme le montre la Figure 1 b, les formes d’onde ABR provenant de ratons ont montré seulement trois ou quatre de vagues distinctes avec petite amplitude. Habituellement, jusqu'à sept sommets ont été observées dans les formes d’onde ABR des animaux adultes (

Discussion

Chez les rats âgés de moins de jour 11, n’on observe aucun potentiel d’action en réponse à une stimulation sonore au cortex auditif^6,7. C’est pourquoi, jour après la naissance 11 est décrit comme « début de l’audience »¹⁰. Le développement d’une fonction d’audition avant le début de l’audience n’était pas bien étudié encore. En utilisant la méthode semblable pour l’enregistrement de ABR adulte, nous démo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	1.5% in water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
Collagenase IV	Sigma	C5138	2 mg/mL in L-15
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	PH 7.3
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4% in PBS
Triton X-100	Amresco	ZS-0694	0.3% in PBS
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	10000C	10% in PBS
prestin antibody	Santa Cruz	SC-22694	dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11055	dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	dil 1:200
DAPI	Solarbio	C0060	dil 1:20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
CsCl	Sigma	7647-17-8	140 mM
MgCl2	Sigma	7791-18-6	2 mM
EGTA	Sigma	67-42-5	10 mM
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Osmometer	Gonotec	OSMOMAT 3000 basic
Forcep	WPI	14095	Tweezers dumont
Micropipette puller	Sutter Instrument	MODLE-P97
Micro Forge	Narishigen	MF-830
Mini Operating System	Sutter Instrument	MP-285
MultiClamp	Axon	700B
Low-Noise Data Acquisition System	Axon	1440A
ES1 speaker	Tucker-Davis Technologies
TDT system 3	Tucker-Davis Technologies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
SigGenRP software	Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software	Tucker-Davis Technologies
jClamp	Scientific Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
SD rat	Experimental Animal Center of Southern Medical University