Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um die auditory Brainstem Antwort vom postnatalen Ratte Welpen aufnehmen. Um die funktionelle Entwicklung des äußeren Haarzellen zu untersuchen, ist das experimentelle Verfahren der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme in isolierten äußeren Haarzellen Schritt für Schritt beschrieben.

Zusammenfassung

Die äußeren Haarzellen ist eines der zwei Arten von sensorischen Haarzellen in der Säugetier-Cochlea. Sie verändern ihre Zelle Länge mit dem Rezeptor potential um die schwache Vibration der Low-Level-akustisches Signal zu verstärken. Die Morphologie und elektrophysiologische Eigentum der äußeren Haarzellen (OHCs) im frühen postnatalen Alter zu entwickeln. Die Reifung der äußeren Haarzellen kann zur Entwicklung des auditorischen Systems. OHCs Entwicklungsprozess ist jedoch nicht gut untersucht. Dies ist zum Teil wegen der Schwierigkeit, ihre Funktion an eine elektrophysiologische Ansatz zu messen. Mit dem Ziel der Entwicklung einer einfachen Methode zur Lösung des obigen Problems, beschreiben wir hier eine Schritt für Schritt Protokoll, um die Funktion des OHCs in akut dissoziierten Cochlea von postnatale Ratten zu untersuchen. Mit dieser Methode können wir bewerten die Cochlea-Reaktion auf reinen Ton Reize und untersuchen die Ausdruck Ebene und die Funktion der motorischen Protein Prestin in OHCs. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die inneren Haarzellen (IHC) zu untersuchen.

Einleitung

Zwei unterschiedliche Funktionen von Cochlea-sensorischen Haarzellen sind für Säugetiere hören: Mechanoelectric Transduktion (MET) und Electromotility^1,2. Durch MET-Kanäle in das Haarbündel, IHC (IHC) und OHCs konvertieren Klangschwingung Membran potenzielle Veränderungen sowie die elektrischen Signale der innervierten Spirale Ganglion Neuronen gelegen. OHCs ihre Zelle Länge mit dem Membranpotential ändern und die Schwingung des Low-Level-Sound zu verstärken. Diese Tätigkeit als Electromotility bezeichnet wird durch den motor Protein Prestin befindet sich in der Seitenwand des OHCs³abgeleitet.

In vielen Arten, einschließlich der Nagetiere ist die Anhörung Funktion unreif in frühen postnatalen Epoche^4,5. Kein Aktionspotential in Reaktion auf akustische Signale konnte im auditorischen Kortex vor der mündlichen Verhandlung Anfang^6,7nachgewiesen werden. Entwicklung der Morphologie und Funktion der Cochlea ist weit verbreitet in Maus, Rennmaus und Ratte^4,5,8untersucht worden. Der mechanotransduktion und Electromotility der Haarzellen entstehen auch in den frühen Leben Epoche⁵.

Um die Hörfähigkeit Empfindlichkeit von Ratten in verschiedenen Altersstufen postnatale zu bewerten, haben wir eine Methode für auditory Brainstem Response (ABR) Aufnahme in Ratte Welpen entwickelt. Ganze Zelle Patch-Clamp ist eine ideale Technologie um die OHCs Elektrophysiologisch untersuchen. Allerdings begrenzt die niedrige Rate der gesamten Zelle Versiegelung im Vergleich mit der Patch-Clamp in Neuronen und anderen epithelialen Zellen durchgeführt, die Untersuchung der Electromotility der isolierten OHCs.

Hier beschreiben wir ein Verfahren um die OHCs morphologisch und Elektrophysiologisch in akut dissoziierten Cochlea von postnatale Ratten zu untersuchen. Diese Methode kann geändert werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die inneren Haarzellen Entwicklung und Funktion regulieren.

Protokoll

Alle experimentelle Protokolle mit tierischen Probanden stimmten mit der Tier-Ethik-Kommission der Southern Medical University.

1. bereiten Sie Lösungen für Experimente

1. Vorbereiten die Narkose (siehe Tabelle der Materialien): 1,5 % Pentobarbital-Natrium aufgelöst in DdH₂O.
2. Bereiten Sie die Dissektion-Lösung (siehe Tabelle der Materialien): ein Beutel Leibovizs L-15 Pulver in 1 L des DdH₂O. Adjust pH-Wert 7.3 mit 1 M NaOH zu lösen. Passen Sie Osmolarität, 300-330 mOsm mithilfe einer XR und 10 mM HEPES vor Gebrauch an.
3. 2 mg/mL Kollagenase IV auflösen (siehe Tabelle der Materialien) in Dissektion Lösung in Schritt 1.2 vorbereitet.
4. Bereiten Sie die Immunostaining Lösungen (siehe Tabelle der Materialien): lösen Sie die 4 % Paraformaldehyd in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; angemessenen Schutz zu tragen.
5. Verdünnen Sie 0,3 % Durchlässigkeit Agent in PBS. Verdünnen Sie die 10 % normalem ziegenserum mit PBS-Puffer als die blocking-Puffer. Verdünnen Sie die Prestin Antikörper 1: 200 in blocking-Puffer. Verdünnen Sie die Alexa488-konjugierten Antikörper 1:600 in blocking-Puffer. Verdünnen Sie Phalloidin-Tetramethylrhodamine B erfolgt 1: 200 mit PBS-Puffer.
6. Bereiten Sie die extrazelluläre Lösung (siehe Tabelle der Materialien): Vorbereiten der Leiboviz L-15 Medium wie beschrieben (Schritt 1.2).
7. Bereiten Sie die intrazelluläre Lösung (siehe Tabelle der Materialien).

(2) ABR Aufnahme

Hinweis: ABR Aufnahme wurde zuvor ausführlich in unseren vorherigen Studie⁹beschrieben.

1. Sprague-Dawley (SD) Ratten (1-14 Tage alten Welpen und 2 - Monate alte Erwachsene beiderlei Geschlechts) mit einer einzigen Injektion von 1,5 % Natrium-Pentobarbital (22 mg/kg für Welpen und 30 mg/kg für Erwachsene, intraperitoneal (i.p.)) zu betäuben.
2. Legen Sie das narkotisierten Tier in eine Form von Polyethylen-Schaum, Körper des Tieres zu immobilisieren. Legen Sie das Tier auf eine Anti-Vibrations-Tisch in einem Raum Klang-Dämpfung. Halten Sie das Tier Körpertemperatur bei 37,5 ° C mit einem Heizkissen.
3. Wischen Sie den Kopfbereich mit Ethanol 70 % (Vol/Vol). Mithilfe einer feinen Schere machen Sie einen 1-2 mm Einschnitt ventrolateralen zu der externen Pinna, die Referenzelektrode oder Boden zu platzieren. Ein Subdermale Nadelelektrode (Aufnahme Elektrode) befindet sich über den Schädel Scheitelpunkt (Abbildung 1A).
4. Der Funktionsgenerator mit kalibrierten Ton platzt (1 ms steigen/fallen, 3 ms Plateau) verschiedener Frequenzen erzeugen (2, 4, 8, 16, 24 und 32 kHz) und Intensitäten (verringerte sich von 85 auf 10 dB SPL in Schritt 5 dB). Variieren Sie die Frequenz und Amplitude manuell oder mit Hilfe eines Computers. Liefern Sie Ton Reize durch eine elektrostatische Lautsprecher 10 cm entfernt in Richtung zum Kopf des Tieres gelegen.
5. (100-1.000 Hz) zu filtern, zu verstärken und durchschnittlich (256 mal) den Wirtschaftsteilnehmern Klangpotential mit einem Multi-Funktions-Prozessor, das ABR bekommen. Die ABR-Spuren wird überwacht, Online- und offline-Analyse gespeichert. Es dauert ca. 40 min, um die Aufnahme von einem Tier ABR abzuschließen.
   Hinweis: In der Regel drei bis sieben Gipfel (ich Welle auf Welle VII) mit Latenzen identifiziert weniger als 15 ms werden kann (Abbildung 1 b). Die ABR-Schwelle ist definiert als die minimale Lautstärke auf dem Wave I und II nachgewiesen werden konnte.
6. Bevor die Tiere wach aus der Narkose (mit einer intraperitonealen Injektion von 0,3 mL 1,5 % Natrium Pentobarbital) einschläfern.

(3) das Organ von Corti (OC)-Dissektion

1. Ratte Welpen zu betäuben. Für Ratten weniger als 6 Tage alt (< P6), halten Sie das Tier in der Kulturschale 100 mm und bedecken Sie die Schüssel mit Eis für 10 Minuten. Für Ratten > P6, Betäuben Sie das Tier mit einer einzigen Injektion von 1,5 % Natrium-Pentobarbital (22 mg/kg, i.p.). Enthaupten Sie die Ratte Welpen nach der Narkose.
2. Sterilisieren Sie den Kopf durch Besprühen mit 70 % Ethanol (Vol/Vol).
3. Öffnen Sie den Schädel entlang der sagittalen Mittellinie mit einer Schere; Entfernen Sie das Gehirn, die das Innenohr aussetzen.
4. Transfer im Innenohr in einer 35-mm-Petrischale gefüllt mit 3 mL eiskaltes L-15 (Abbildung 2A).
5. Verwenden Sie unter dem Mikroskop Dissektion feine Zange um die knöchernen Kapsel der Cochlea (Abb. 2 b) zu entfernen.
6. Packen Sie das OK und die damit verbundenen Stria Vascularis (SV) aus den Modiolus.
7. Durch halten der basale Teil des SV mit der Pinzette, trennen die OC vom SV völlig entspannen langsam von Basis-zu-Spitze (Abbildung 2).
8. Schneiden Sie die OC gleichmäßig mit feinen Schere (Abb. 2D) in drei Stücke.

4. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Mithilfe einer 200 µL PIPETTENSPITZE die Segmente von OC (Schritt 3,8) auf einen Objektträger übertragen und fixieren mit 100 µL 4 % Paraformaldehyd für mindestens 4 Stunden bei 4 ° C.
   Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; angemessenen Schutz zu tragen.
2. Waschen Sie das Gewebe durch Verschieben der Paraformaldehyd mit 100 µL frische PBS. Waschen Sie das Gewebe drei Mal für 10 Minuten.
3. Inkubieren Sie das Gewebe mit 0,3 % Durchlässigkeit Agent mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur.
4. Den Durchlässigkeit Agent mit PBS-Puffer zu verwerfen und das Gewebe dreimal mit PBS waschen.
5. Block mit 10 % normalem ziegenserum mit PBS-Puffer für 1 h bei Raumtemperatur.
6. Inkubieren Sie mit Anti-Prestin-C-Terminus Antikörper (1: 200) in blocking-Lösung für 2 h bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht.
7. Waschen Sie für 5 min dreimal mit PBS.
8. Mit Alexa488-konjugierten Sekundärantikörper (1:600) in blockierende Lösung für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
9. Waschen Sie für 5 min in der Dunkelheit dreimal mit PBS.
10. 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Rhodamin-Phalloidin (1: 200) inkubieren.
11. Waschen Sie für 5 min in der Dunkelheit dreimal mit PBS.
12. Auf einem Objektträger mit Eindeckmedium (mit DAPI) montieren. Bild mit konfokalen Mikroskopie mit 405 nm, 488 nm und 594 nm Laser. Legen Sie die Laserleistung bei 0,1-0,5 mW und der Scan bei 0,5 Frame/s Geschwindigkeit.

5. Patch Clamp Aufnahme von isolierten OHCs

1. Verwenden Sie die Pipette Puller und Mikro-Fälscher zu Patch Pipetten mit einem Tipp-Durchmesser ca. 2-3 µm. Rücken-Füllung der Pipetten mit intrazellulären Lösung. In der Regel wurde der anfängliche Widerstand der Patch Pipette 2,5-3,5 MΩ in Bad-Lösung.
2. Übertragen Sie durch die Verwendung einer PIPETTENSPITZE 200 µL ein Stück von der OC (aus Schritt 3,8) in ein 35 mm Petrischale. Das Gewebe mit 100 µL der enzymatischen Verdauung Medium zu verdauen (Kollagenase IV, siehe Tabelle der Materialien) für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Die enzymatische Verdauung Medium mit 100 µL der L-15 zu verdrängen. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Mikro Skalpell um zu isolieren, die Haarzellen in kleine Stücke.
4. Nach der sanften pipettieren, übertragen die Zellen in einer hausgemachten kleinen Kunststoff-Kammer (Durchmesser ~ 1,5 cm) gefüllt mit enzymfreien Bad-Lösung (~ 1,5 mL, siehe Tabelle der Materialien).
5. Platzieren Sie die Kammer auf der Bühne von einem inversen Mikroskop. Die gesund erscheinenden einsame OHCs zu finden.
6. Laden Sie die Patch-Pipette in den Kopf Bühne eines 700 b-Verstärkers. Bewegen Sie die Patch-Pipette vorsichtig mit einem Mikromanipulator und positionieren Sie es rund um die Unterseite der äußeren Haarzellen (Abb. 3A).
7. Ganze Zelle Patch Clamp OHC durch Versiegelung der seitlichen Wand der Zellkörper. Wenden Sie leichte Saugwirkung, bis die Zellmembran gebrochen ist. Festgesetzt im Betrieb möglichen-70 mV. Zellen mit Zugang reichte von 10 bis 17 MΩ und Membran Beständigkeit reichte von 100 bis 500 MΩ und gelten als eine erfolgreiche ganz-Zell Konfiguration.
8. Mit Computersteuerung, gelten hyperpolarizing und depolarisierende Spannung (250 ms Dauer und von −140 bis + 94 mV in 13 mV Schritten) in die Zelle ganz-Zell-Ströme zu entlocken.
9. Verstärken Sie die gesamte Zelle Ströme zu, Filtern Sie (Ecke Frequenz von 5 kHz) von einem 700 b-Verstärker. Konvertieren Sie die Daten durch eine 1440A-Konverter und ein Geschäft für offline-Analyse.
10. Messen Sie die Membran-Kapazität der OHCs mit einem zwei sinusförmige Spannung Stimulus-Protokoll durch eine Patch-Clamp-Software gesteuert. Legen Sie den Spannungsbereich stimulieren von-140 bis 110 mV. Speichern Sie die Daten für die offline-Analyse.

Ergebnisse

ABR kann von narkotisierten Ratte Welpen älter als postnatale 7.Tag (P7) mit reinen Ton platzt (Abbildung 1A) hervorgerufen werden. Wie in Abbildung 1 bgezeigt, erhielt die ABR-Wellenformen von Ratte Welpen zeigte nur drei bis vier unterschiedliche Wellen mit kleiner Amplitude. In der Regel bis zu sieben Gipfel in ABR Wellenformen adulter Tiere (Abbildung 1 b) beobachtet.

Diskussion

Bei Ratten jünger als 11. Tag konnte kein Aktionspotential in Reaktion auf klangstimulation im auditorischen Kortex^6,7beobachtet werden. Daher bezeichnet man als "Anhörung Ausbruch"¹⁰postnatale Tag 11. Die Entwicklung des Gehörs vor Beginn der mündlichen Verhandlung noch nicht gut untersucht wurde. Ähnliche Methode für Erwachsene ABR Aufnahme, wir zeigen, dass ABRs durch reinen Ton Burst Ratte Welpen jünger als P11 ausgelöst werden...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	1.5% in water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
Collagenase IV	Sigma	C5138	2 mg/mL in L-15
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	PH 7.3
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4% in PBS
Triton X-100	Amresco	ZS-0694	0.3% in PBS
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	10000C	10% in PBS
prestin antibody	Santa Cruz	SC-22694	dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11055	dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	dil 1:200
DAPI	Solarbio	C0060	dil 1:20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
CsCl	Sigma	7647-17-8	140 mM
MgCl2	Sigma	7791-18-6	2 mM
EGTA	Sigma	67-42-5	10 mM
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Osmometer	Gonotec	OSMOMAT 3000 basic
Forcep	WPI	14095	Tweezers dumont
Micropipette puller	Sutter Instrument	MODLE-P97
Micro Forge	Narishigen	MF-830
Mini Operating System	Sutter Instrument	MP-285
MultiClamp	Axon	700B
Low-Noise Data Acquisition System	Axon	1440A
ES1 speaker	Tucker-Davis Technologies
TDT system 3	Tucker-Davis Technologies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
SigGenRP software	Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software	Tucker-Davis Technologies
jClamp	Scientific Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
SD rat	Experimental Animal Center of Southern Medical University