Ответ слуховой ствола мозга и внешние клетки волос поклеточного патч зажим запись в послеродовой крыс

Резюме

Этот протокол описывает методы для записи слуховой мозга ответ от послеродового крыса щенков. Для изучения функционального развития внешних волосковых клеток, экспериментальная процедура поклеточного фиксации записи в изолированные внешние клетки волос описан шаг за шагом.

Аннотация

Внешние клетки волос является одним из двух типов Сензорные клетки волос в млекопитающих улитки. Они изменяют их длина ячейки с рецепторами потенциал, чтобы усилить слабые вибрации низкого уровня звукового сигнала. Морфология и электрофизиологические свойства внешних волосковых клеток (OHCs) развиваться в начале послеродового возраста. Созревание внешние клетки волос может способствовать развитию слуховой системы. Однако процесс развития OHCs не хорошо изучены. Это отчасти трудно измерить их функции электрофизиологических подход. С целью разработки простой способ решить эту проблему, здесь мы опишем пошаговое протокол для изучения функции OHCs в остро диссоциированных улитки от послеродового крыс. С помощью этого метода мы можем оценить улитковый ответ на стимулы чистый тон и изучить уровень выражения и функции Престин мотор белка в OHCs. Этот метод может также использоваться для изучения внутренние волосковые клетки (дивидедов).

Введение

Две различные функции улитковый Сензорные клетки волос крайне важны для млекопитающих слуха: mechanoelectric трансдукции (мет) и electromotility^1,2. По каналам MET расположен в пучок волосы, дивидедов (дивидедов) и OHCs конвертировать звуковые вибрации мембраны потенциальных изменений, а также электрические сигналы нейронов ганглия иннервируемые спираль. OHCs изменить длину их клетки с мембранного потенциала и усилить вибрации низкого уровня звука. Это действие называется electromotility является производным от Престин двигательные белки, расположенные в боковой стенке OHCs³.

У многих видов, включая грызунов функция слуха незрелых в раннем постнатальном эпохи^4,5. Не потенциал действия в ответ на звуковые сигналы могут быть обнаружены в аудиальном кортексе до^6,начала слушания⁷. Разработка морфологии и функция улитки широко изучена в мышь и песчанки, крыса^4,5,8. Mechanotransduction и electromotility клетки волос также разработал в начале жизни эпохи⁵.

Для того чтобы оценить чувствительность слуха крыс на послеродовой разных возрастов, мы разработали метод для слухового мозга ответ (ABR) запись в крыса щенков. Поклеточного фиксации это идеальная технология для расследования OHCs electrophysiologically. Однако по сравнению с фиксации в нейроны и другие клетки эпителия, низкий уровень уплотнения поклеточного ограниченное расследование electromotility изолированных OHCs.

Здесь мы описываем процедуры для расследования OHCs морфологически и electrophysiologically в остро диссоциированных улитки от послеродового крыс. Этот метод может быть изменен для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют развитие внутренней волосы клеток и функции.

протокол

Все экспериментальные протоколы с участием животных темы были утверждены Комитетом Этика животных Южной медицинского университета.

1. подготовить решения для экспериментов

1. Подготовьте анестетиков (см. Таблицу материалы): 1.5% Пентобарбитал натрия растворяют в ddH₂O.
2. Приготовляют раствор диссекции (см. Таблицу материалы): Растворите одну сумку Leiboviz в L-15 порошка в 1 Л с 1 M NaOH ddH₂O. Adjust pH 7,3. Отрегулируйте осмолярности до 300-330 мОсм, используя осмометре и 10 мм HEPES перед использованием.
3. Растворите 2 мг/мл коллагеназы IV (см. Таблицу материалы) в рассечение раствор, приготовленный на шаге 1.2.
4. Подготовка иммуноокрашивания решения (см. Таблицу материалы): распустить параформальдегида 4% в-фосфатный буфер (PBS).
   Предупреждение: Параформальдегида токсичен; надевайте соответствующую защиту.
5. Разбавьте агент проницаемость 0,3% в PBS. Развести 10% нормальной козьего сыворотки в PBS в блокирующем буфере. Разбавьте антитела Престин 1: 200, в блокирующем буфере. Разбавьте 1: 600 Alexa488-конъюгированных антител в блокирующем буфере. Разбавьте 1: 200 Изотиоцианаты B Фаллоидин-тетраметилродамина в PBS.
6. Подготовить внеклеточного решение (см. Таблицу материалы): подготовка среднего L-15 Leiboviz, как описано выше (шаг 1.2).
7. Подготовить внутриклеточных решение (см. Таблицу материалы).

2. ABR запись

Примечание: ABR записи ранее описаны подробно в наших предыдущих исследований⁹.

1. Анестезировать крысах Sprague-Dawley (SD) (1-14 день старого детенышей и 2 - месячного взрослых, обоих полов) с одной инъекции Пентобарбитал натрия 1,5% (22 мг/кг для щенков и 30 мг/кг для взрослых, внутрибрюшинного (и.п.)).
2. Место наркотизированных животного в Полиэтилен вспененный плесень обездвижить животное тело. Поместите животное на столе в комнате кулисный звук вибрации. Держите температуру тела животного на 37,5 ° C с грелку.
3. Протрите области головы с 70% (vol/vol) этанола. С помощью тонкой ножницы, сделать 1-2 мм разрез вентролатеральные внешних Пинна поместить электрод сравнения или землю. Подкожные иглы электрода (запись электрода) находится над черепа вершин (рис. 1A).
4. С помощью функции генератора, генерировать калиброванные тон очередей (1 ms падение/подъем, плато 3 мс) различных частот (2, 4, 8, 16, 24 и 32 кГц) и интенсивности (снизилась с 85 до 10 дБ SPL с шагом 5 дБ). Изменять частоту и амплитуду вручную или с помощью компьютера. Предоставлять звуковые раздражители через электростатический громкоговоритель, расположенный 10 см от сторону головы животного.
5. Фильтр (100-1000 Гц), усиливают и средний (256 раз) звук вызвал потенциал с помощью многофункциональных процессора получить abr. Следы ABR контролируется онлайн и хранятся для анализа в автономном режиме. Чтобы завершить запись с одного животного ABR около 40 минут.
   Примечание: Как правило, три-семь пиков (волны я волна VII) с задержкой менее 15 мс может быть определены (рис. 1B). ABR порог определяется как минимальный уровень звука в которой волна I и II могут быть обнаружены.
6. Усыпить перед животные просыпаются от анестезии (с внутрибрюшинной инъекции Пентобарбитал натрия 0,3 мл 1,5%).

3 рассечение орган из Корти (OC)

1. Анестезировать крыса щенков. Для крыс менее 6 дней (< P6), держать животное в 100 мм культуры блюдо и обложка блюдо со льдом на 10 мин. Для крыс > P6, анестезировать животное с одной инъекции Пентобарбитал натрия 1,5% (22 мг/кг, и.п.). Обезглавить потомства крыс после анестезии.
2. Стерилизуйте голову путем распыления с 70% этанола (vol/vol).
3. Откройте череп вдоль сагиттальной срединной линии с ножницами; Удаление мозга подвергать внутреннего уха.
4. Перенесите внутреннего уха в 35-мм Петри, заполнены с 3 мл ледяной L-15 (рис. 2A).
5. Под микроскопом рассечение использование тонкой щипцы для удаления костлявые капсула улитки (рис. 2B).
6. Берем OC и связанных с ними каннелюры vascularis (SV) от modiolus.
7. Путем проведения базальная часть SV пинцетом, отдельных OC от SV полностью путем раскрутки медленно от основания к вершине (рис. 2 c).
8. Равномерно вырежьте OC на три части с помощью тонкой ножницы (Рисунок 2D).

4. иммунофлюоресценции пятнать

1. С помощью кончика пипетки 200 мкл, передача сегментов OC (шаг 3,8) на стекло слайд и исправить с 100 мкл параформальдегида 4% для по крайней мере 4 ч при 4 ° C.
   Предупреждение: Параформальдегида токсичен; надевайте соответствующую защиту.
2. Вымойте ткань смещая параформальдегида с 100 мкл свежих PBS. Вымойте ткань три раза за 10 мин.
3. Инкубируйте ткани с 0,3% проницаемость агентом в PBS на 30 минут при комнатной температуре.
4. Отказаться от проницаемости агента в PBS и стирать ткани три раза с PBS.
5. Блок с 10% нормальной козьего сыворотки в PBS на 1 ч при комнатной температуре.
6. Проинкубируйте с анти Престин C-конечная антитела (1: 200) в блокировании решение для 2 ч при комнатной температуре или при температуре 4 ° C на ночь.
7. Вымойте три раза с PBS на 5 мин.
8. Проинкубируйте с Alexa488-конъюгированных вторичные антитела (1: 600) в блокирующие решение за 1 час при комнатной температуре в темноте.
9. Вымойте три раза с PBS для 5 мин в темноте.
10. Проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре в темноте с родамин Фаллоидин (1: 200).
11. Вымойте три раза с PBS для 5 мин в темноте.
12. Крепление на стекло слайд с монтажа средних (содержащие DAPI). Изображение с помощью конфокальной микроскопии с помощью 405 нм, 488 нм и 594 нм лазеры. Установить мощность лазера на 0,1-0,5 МВт и сканирования скорость на 0,5 кадр/сек.

5. фиксации записи изолированных OHCs

1. Использовать съемник пипетки и микро кузнец сделать патч пипетки с наконечник диаметром 2-3 мкм. обратно заполните пипетки с внутриклеточной решения. Как правило первоначальное сопротивление патч пипеткой был 2,5-3,5 MΩ в раствор для ванн.
2. С помощью кончика пипетки 200 мкл, передача кусок OC (от шага 3.8) в 35 мм Петри. Дайджест ткани с 100 мкл ферментативного пищеварения среды (коллагеназа IV, смотрите Таблицу материалы) за 5 мин при комнатной температуре.
3. Сместить среднего ферментативного пищеварения с 100 мкл L-15. Вырежьте ткань на мелкие кусочки с помощью микро скальпель изолировать волосковых клеток.
4. После нежной закупорить, передачи клетки в камеру домашнее небольшие пластиковые (диаметр ~ 1,5 см) заполнены раствором фермента бесплатная баня (~ 1,5 мл, смотрите Таблицу материалы).
5. Разместите камеру на сцене инвертированным микроскопом. Найти здоровый появляются одиночные OHCs.
6. Загрузите патч пипетку в главный этап 700B усилителя. Переместите пипетку патч тщательно, микроманипулятор и расположите его вокруг нижней части внешнего клетки волос (рис. 3A).
7. Зажим поклеточного патч OHC запечатывая боковой стенки клетки тела. Применить легкие всасывания до тех пор, пока разрыв мембраны клетки. Установите потенциальных холдинга на -70 mV. Клетки с доступа к сопротивлению, составлял от 10 до 17 MΩ и мембраны варьировались от 100 до 500 MΩ и считается успешным поклеточного конфигурации.
8. С помощью компьютерного управления, применяются гиперполяризирующий и расшатывания напряжения (длительность 250 мс и начиная от −140 до + 94 МВ в 13 MV) ячейку, чтобы выявить поклеточного течений.
9. Усиливают поклеточного течений, фильтр (угловой частоты 5 кГц) по 700B усилитель. Преобразуйте данные по 1440A конвертер и хранилище для анализа в автономном режиме.
10. Измерьте емкость мембраны OHCs протоколу две синусоиды напряжения стимул контролируется программное обеспечение зажим патч. Установите диапазон напряжения стимулировать от -140 до 110 МВ. Храните данные для анализа в автономном режиме.

Результаты

ABR можно собрать из наркотизированных крыс щенков старше послеродовой день 7 (P7) с использованием очередей чистый тон (Рисунок 1A). Как показано на рисунке 1B, ABR сигналов, полученных от крыс щенков, показали только три или четыре различных в...

Обсуждение

В крыс моложе 11 день без потенциал действия в ответ на звуковой стимуляции можно наблюдать в аудиальном кортексе^6,7. Таким образом послеродовой день 11 описывается как «слуха onset»¹⁰. Развитие слуха функции до начала слушания не было хорошо изуч?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	1.5% in water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
Collagenase IV	Sigma	C5138	2 mg/mL in L-15
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	PH 7.3
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4% in PBS
Triton X-100	Amresco	ZS-0694	0.3% in PBS
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	10000C	10% in PBS
prestin antibody	Santa Cruz	SC-22694	dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11055	dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	dil 1:200
DAPI	Solarbio	C0060	dil 1:20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
CsCl	Sigma	7647-17-8	140 mM
MgCl2	Sigma	7791-18-6	2 mM
EGTA	Sigma	67-42-5	10 mM
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Osmometer	Gonotec	OSMOMAT 3000 basic
Forcep	WPI	14095	Tweezers dumont
Micropipette puller	Sutter Instrument	MODLE-P97
Micro Forge	Narishigen	MF-830
Mini Operating System	Sutter Instrument	MP-285
MultiClamp	Axon	700B
Low-Noise Data Acquisition System	Axon	1440A
ES1 speaker	Tucker-Davis Technologies
TDT system 3	Tucker-Davis Technologies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
SigGenRP software	Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software	Tucker-Davis Technologies
jClamp	Scientific Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
SD rat	Experimental Animal Center of Southern Medical University