Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

Resumo

Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.

Resumo

A célula externa do cabelo é um dos dois tipos de células sensoriais ciliadas da cóclea mamíferos. Eles alteram seu comprimento de células com o receptor do potencial para amplificar a vibração fraca do sinal de som de baixo nível. A morfologia e a propriedade eletrofisiológica de células ciliadas exteriores (OHCs) desenvolvem na idade pós-natal. A maturação da célula exterior de cabelo pode contribuir para o desenvolvimento do sistema auditivo. No entanto, o processo de desenvolvimento de OHCs não é bem estudado. Isto é parcialmente devido à dificuldade de medir sua função por uma abordagem eletrofisiológica. Com o objetivo de desenvolver um método simples para resolver o problema acima, aqui descrevemos um protocolo passo a passo para estudar a função do OHCs na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Com este método, podemos avaliar a resposta coclear aos estímulos de Tom puro e examinar o nível de expressão e a função da proteína motor prestin em OHCs. Esse método também pode ser usado para investigar as células ciliadas interiores (IHCs).

Introdução

Duas funções distintas coclear células sensoriais são essenciais para a audição dos mamíferos: transdução de mechanoelectric (MET) e electromotility^1,2. Por canais MET localizados no pacote o cabelo, IHCs (IHCs) e OHCs converter som vibração em alterações do potencial de membrana, bem como os sinais elétricos dos neurônios do gânglio espiral inervado. OHCs alterar seu comprimento de células com o potencial de membrana e amplificam a vibração do som de baixo nível. Essa atividade denominada electromotility é derivada pelo motor proteína prestin localizado na parede lateral do OHCs³.

Em muitas espécies, incluindo roedores, a função auditiva é imatura na época início pós-natal^4,5. Sem potencial de ação em resposta a sinais sonoros pode ser detectado no córtex auditivo antes do início de audiência^6,7. Desenvolvimento da morfologia e função da cóclea tem sido amplamente estudadas em rato, rato e rato^4,5,8. O mechanotransduction e electromotility de células ciliadas são também desenvolvidos no início da época de vida⁵.

A fim de avaliar a sensibilidade auditiva de ratos em diferentes idades pós-natal, nós desenvolvemos um método para auditivo de tronco encefálico (ABR) gravação em filhotes. Braçadeira do remendo de célula inteira é uma tecnologia ideal para investigar os OHCs electrophysiologically. No entanto, em comparação com a braçadeira do remendo realizada em neurônios e outras células epiteliais, a baixa taxa de selagem da célula inteira limitado a investigação de electromotility de OHCs isoladas.

Aqui descrevemos um procedimento para investigar os OHCs morfologicamente e electrophysiologically na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Esse método pode ser modificado para estudar os mecanismos moleculares que regulam a função e desenvolvimento celular interna do cabelo.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da universidade médica do Sul.

1. prepare soluções para experimentos

1. Preparar o anestésico (ver Tabela de materiais): 1.5% pentobarbital de sódio dissolvido em ddH₂O.
2. Preparar a solução de dissecação (ver Tabela de materiais): dissolver um saco de pó de L-15 do Leiboviz em 1 L de DDQ₂O. ajuste de pH para 7,3 com 1 M de NaOH. Ajuste a osmolaridade para 300-330 mOsm usando um aparelhos e 10 mM HEPES antes do uso.
3. Dissolver 2 mg/mL colagenase IV (ver Tabela de materiais) em solução de dissecação, preparada na etapa 1.2.
4. Preparar as soluções de imunocoloração (ver Tabela de materiais): dissolver o paraformaldeído 4% em salina tamponada fosfato (PBS).
   Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; Use proteção adequada.
5. Dilua o agente de permeabilidade de 0,3% em PBS. Dilua o soro de cabra normal de 10% em PBS como o tampão de bloqueio. Dilua a 1: 200 prestin anticorpo em tampão de bloqueio. Dilua o anticorpo conjugado Alexa488 1:600 em tampão de bloqueio. Dilua a 1: 200 B faloidina-diversos isotiocianato em PBS.
6. Preparar a solução extracelular (ver Tabela de materiais): preparar o meio de L-15 a Leiboviz conforme descrito acima (etapa 1.2).
7. Preparar a solução intracelular (ver Tabela de materiais).

2. gravação ABR

Nota: Gravação ABR foi previamente descrita em detalhe no nosso anterior estudo⁹.

1. ANESTHETIZE ratos Sprague Dawley (SD) (filhotes de 1-14 dias de idade e adultos 2 - meses de idade, ambos os sexos) com uma única injeção de pentobarbital de sódio 1,5% (22 mg/kg para filhotes de cachorro e 30 mg/kg para adultos, intraperitoneal (i.p.)).
2. Coloque o animal anestesiado em um molde de espuma de polietileno para imobilizar o corpo do animal. Coloque o animal em uma mesa de antivibração em uma sala de som-atenuantes. Manter a temperatura do corpo do animal a 37,5 ° C, com uma almofada de aquecimento.
3. Limpe a área de cabeça com etanol a 70% (vol/vol). Usando uma tesoura bem, faça uma incisão de 1-2mm ventrolateral para o pavilhão auricular externo para colocar o eletrodo de referência ou o chão. Um eletrodo de agulha subdérmica (eletrodo de gravação) está localizado sobre o vértice do crânio (figura 1A).
4. Usando o gerador de função, gerar explosões de Tom calibrado (1 ms subida/descida, planalto 3 ms) de várias frequências (2, 4, 8, 16, 24 e 32 kHz) e intensidades (diminuídas de 85 para 10 dB SPL na etapa 5 dB). Variar a frequência e a amplitude manualmente ou usando um computador. Entrega a estímulos sonoros através de um alto-falante eletrostático localizado a 10 cm de distância em direção a cabeça do animal.
5. Filtro (100-1.000 Hz), amplificar e média (256 vezes) o som eliciado potencial usando um processador de multi-função para obter os ABRs. Os vestígios da ABR é monitorado on-line e armazenados para análise off-line. Demora cerca de 40 min para completar o ABR a gravação de um animal.
   Nota: Normalmente, de três a sete picos (onda eu a onda VII) com latências inferior a 15 ms pode ser identificado (figura 1B). O limiar da ABR é definido como o nível mínimo de som no qual wave I e II pode ser detectado.
6. Eutanásia antes os animais acordou da anestesia (com a injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio 1,5% 0,3 mL).

3. a dissecação do órgão de Corti (OC)

1. Filhotes de anestesiar. Para ratos menos de 6 dias de idade (< P6), manter o animal em um prato de cultura de 100 mm e cubra o prato com gelo por 10 min. Para ratos > P6, anestesiar o animal com uma única injeção de pentobarbital de sódio 1,5% (22 mg/kg, i.p.). Decapitar os filhotes de rato após a anestesia.
2. Esterilize a cabeça pulverizando com etanol a 70% (vol/vol).
3. Abrir o crânio ao longo da linha sagital mediana com tesoura; Remova o cérebro para expor o ouvido interno.
4. Transferência da orelha interna em uma placa de Petri 35mm preenchido com 3 mL de gelado L-15 (Figura 2A).
5. Sob o microscópio de dissecação, use pinça fina para remover a cápsula óssea da cóclea (Figura 2B).
6. Desembrulhe o OC e associados do stria vascularis (SV) do modiolus.
7. Mantendo a porção basal do SV com fórceps, separar o OC a SV completamente desenrolando lentamente da base-de-apex (Figura 2).
8. Corte o OC uniformemente em três pedaços, usando uma tesoura fina (Figura 2D).

4. mancha da imunofluorescência

1. Usando uma ponta de pipeta 200 µ l, transferir os segmentos de OC (passo 3.8) numa lâmina de vidro e fixar com 100 µ l de paraformaldeído 4% pelo menos 4 h a 4 ° C.
   Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; Use proteção adequada.
2. Lave o tecido deslocando o paraformaldeído com 100 µ l de PBS fresco. Lave o tecido três vezes por 10 min.
3. Incube o tecido com agente de permeabilidade de 0,3% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
4. Descartar o agente de permeabilidade em PBS e lave o tecido 3 vezes com PBS.
5. Bloco com 10% de soro de cabra normal em PBS por 1h à temperatura ambiente.
6. Incube com anticorpo anti-prestin-C-terminal (1: 200) no bloqueio solução para 2 h à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.
7. Lave tres vezes com PBS por 5 min.
8. Incube com anticorpos secundarios conjugados a Alexa488 (1:600) em solução de bloqueio por 1h à temperatura ambiente no escuro.
9. Lave tres vezes com PBS por 5 min no escuro.
10. Incube com rodamina-faloidina (1: 200) por 10 min à temperatura ambiente no escuro.
11. Lave tres vezes com PBS por 5 min no escuro.
12. Montar sobre uma lâmina de vidro com meio de montagem (contendo DAPI). Imagem com microscopia confocal usando 405 nm, 488 nm e 594 nm de lasers. Definir a potência do laser em 0.1-0.5 mW e o scan velocidade no quadro/s 0.5.

5. braçadeira de Patch gravação de OHCs isolado

1. Usar o extrator de pipeta e microfalsificador para fazer patch pipetas com um diâmetro de ponta 2-3 µm. Back-preencher as pipetas com solução intracelular. Geralmente, a resistência inicial da pipeta remendo foi MΩ 2.5-3.5 em solução de banho.
2. Usando uma ponta de pipeta de 200 µ l, transferi uma parte do co (da etapa 3.8) em uma placa de Petri de 35mm. Digerir o tecido com 100 µ l de meio de digestão enzimática (colagenase IV, consulte Tabela de materiais) por 5 min à temperatura ambiente.
3. Deslocar o meio da digestão enzimática com 100 µ l de L-15. Corte o tecido em pequenos pedaços, usando um micro bisturi para isolar as células capilares.
4. Após suave pipetagem, transferir as células em uma câmara de plástico pequena caseira (diâmetro ~ 1,5 cm) preenchido com solução de banho livre de enzima (~ 1,5 mL, consulte Tabela de materiais).
5. Coloque a câmara no palco de um microscópio invertido. Encontre os OHCs solitárias saudável-aparecendo.
6. Carrega a pipeta de remendo para o palco principal de um amplificador de 700B. Mover a pipeta de remendo cuidadosamente por um micromanipulador e posicioná-lo em torno do fundo da célula exterior de cabelo (Figura 3A).
7. Braçadeira do remendo de células inteiras o OHC selando a parede lateral do corpo celular. Aplique sucção leve até a membrana celular é rompida. Conjunto da exploração potencial em -70 mV. Células com resistência de acesso variou entre 10 e 17 MΩ e resistência de membrana variaram de 100 a 500 MΩ e são consideradas uma configuração bem sucedida de células inteiras.
8. Usando o controle de computador, aplicar hiperpolarização e despolarizantes tensão (250 ms de duração e que variam de −140 a +94 mV em 13 passos de mV) para a célula para eliciar correntes de células inteiras.
9. Amplificar as correntes de células inteiras, filtrar (frequência de canto de 5 kHz) por um amplificador de 700B. Converta os dados por um conversor de 1440A e loja para análise off-line.
10. Medir a capacitância de membrana de OHCs usando um protocolo de estímulo dois da onda de seno-tensão controlado por um software de braçadeira do remendo. Definir a escala de tensão de estimular de-140 a 110 mV. Armazene os dados para análise off-line.

Resultados

ABR pode ser provocada de anestesiados filhotes mais velhos que o 7º dia pós-natal (P7) usando rajadas de Tom puro (figura 1A). Como mostrado na figura 1B, as formas de onda ABR obtidas de filhotes mostrou apenas três ou quatro ondas distintas com pequena amplitude. Normalmente, até sete picos foram observadas as formas de onda ABR de animais adultos (figura 1B).

Discussão

Em ratos mais jovens do que de dia 11, sem potencial de ação em resposta à estimulação sonora pode ser observada no córtex auditivo^6,7. Portanto, dia pós-natal 11 é descrito como "início de audiência"¹⁰. O desenvolvimento da função auditiva antes de início da audiência não foi bem estudado ainda. Usando o método semelhante para a gravação de ABR adulta, demonstramos que ABRs poderiam ser provocados pela explosão de Tom p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	1.5% in water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
Collagenase IV	Sigma	C5138	2 mg/mL in L-15
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	PH 7.3
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4% in PBS
Triton X-100	Amresco	ZS-0694	0.3% in PBS
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	10000C	10% in PBS
prestin antibody	Santa Cruz	SC-22694	dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11055	dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	dil 1:200
DAPI	Solarbio	C0060	dil 1:20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
CsCl	Sigma	7647-17-8	140 mM
MgCl2	Sigma	7791-18-6	2 mM
EGTA	Sigma	67-42-5	10 mM
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Osmometer	Gonotec	OSMOMAT 3000 basic
Forcep	WPI	14095	Tweezers dumont
Micropipette puller	Sutter Instrument	MODLE-P97
Micro Forge	Narishigen	MF-830
Mini Operating System	Sutter Instrument	MP-285
MultiClamp	Axon	700B
Low-Noise Data Acquisition System	Axon	1440A
ES1 speaker	Tucker-Davis Technologies
TDT system 3	Tucker-Davis Technologies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
SigGenRP software	Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software	Tucker-Davis Technologies
jClamp	Scientific Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
SD rat	Experimental Animal Center of Southern Medical University