产后大鼠听觉脑干反应及外毛细胞全细胞贴片钳记录

摘要

本协议描述的方法, 记录的听觉脑干反应的产后鼠幼崽。为研究外发细胞的功能发育情况, 本文分步介绍了全细胞膜片钳在分离外毛细胞中的实验过程。

摘要

外毛细胞是哺乳动物耳蜗内两种感觉毛细胞之一。它们通过受体电位改变细胞长度, 放大低电平声信号的弱振动。OHCs 外毛细胞的形态和电生理特性在产后早期发育。外毛细胞的成熟可能有助于听觉系统的发展。然而, OHCs 的发展过程还没有得到很好的研究。这部分是由于难以用电生理方法来测量它们的功能。为了开发一种简单的方法来解决上述问题, 我们在这里描述了一步一步的协议, 以研究 OHCs 在急性离型耳蜗从产后大鼠的功能。通过这种方法, 我们可以对纯色调刺激的耳蜗反应进行评价, 并对 OHCs 中运动蛋白 prestin 的表达水平和功能进行研究。该方法也可用于研究内毛细胞 (IHCs)。

引言

耳蜗感觉毛细胞的两个不同功能是哺乳动物听觉的关键: mechanoelectric 转导 (见) 和 electromotility^1,2。通过在发束中遇到的通道, IHCs (IHCs) 和 OHCs 将声音振动转换成膜电位的变化, 以及支配螺旋神经节神经元的电信号。OHCs 改变其细胞长度与膜电位, 放大低电平声音的振动。这种活动称为 electromotility 是由位于 OHCs³侧壁的运动蛋白 prestin 所衍生。

在许多物种中, 包括啮齿类动物, 听觉功能是不成熟的早期出生的时代^4,5。在听觉皮层中, 在听觉皮质上没有任何动作电位可以检测到声音信号^6,7。耳蜗的形态学和功能的发展已被广泛研究的老鼠, 沙鼠, 鼠^4,5,8。毛发细胞的 mechanotransduction 和 electromotility 也在早期生命世纪的⁵中发展起来。

为评价大鼠不同出生年龄的听觉敏感性, 研制了一种听觉脑干反应 (ABR) 记录方法。全细胞贴片钳是研究 OHCs electrophysiologically 的理想技术。然而, 与神经元和其他上皮细胞中的膜片钳相比, 全细胞封闭率低, 限制了孤立 OHCs electromotility 的调查。

在这里, 我们描述了一个程序, 以调查 OHCs 的形态和 electrophysiologically 在急性分离的耳蜗从产后大鼠。该方法可对调节内毛细胞发育和功能的分子机制进行改进。

研究方案

所有涉及动物学科的实验性协议均由南方医科大学动物伦理委员会批准。

1. 准备实验解决方案

1. 准备麻醉剂 (参见材料表): 1.5% 戊巴比妥钠溶解在 ddH₂O。
2. 准备解剖解决方案 (参见材料表): 在 ddH₂的1升中溶解一袋 Leiboviz 的 L-15 粉, o 将 pH 值调整为 7.3, 用1米氢氧化钠。使用前使用 osmometer 和 10 mM HEPES 将渗透调整为 300-330 mOsm。
3. 溶出2毫克/毫升胶原酶 IV (参见材料表) 在步骤1.2 中制备的解剖溶液中。
4. 准备染色解决方案 (参见材料表): 将4% 多聚甲醛溶解在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中。
   注意: 多聚甲醛有毒;穿戴适当的保护。
5. 稀释0.3% 渗透剂在 PBS。将 PBS 中的10% 正常山羊血清稀释为阻塞缓冲液。在阻塞缓冲器中稀释 prestin 抗体1:200。在阻塞缓冲器中稀释 Alexa488-conjugated 抗体1:600。在 PBS 中稀释罗丹明-四甲基罗丹明 B 异硫氰酸酯1:200。
6. 准备胞外溶液 (参见材料表): 准备 Leiboviz 的 L-15 介质, 如上文所述 (步骤 1.2)。
7. 准备细胞内溶液 (参见材料表)。

2. ABR 记录

注意: 以前的研究⁹中已经详细描述了 ABR 记录。

1. 麻醉大 (SD) 大鼠 (1-14 天的老幼崽和2月大的成年人, 两性) 与单一注射1.5% 戊巴比妥钠 (22 毫克/千克为幼崽和30毫克/公斤成人, 腹腔 (ip))。
2. 将麻醉动物放入聚乙烯泡沫霉菌中, 使动物的身体固定。将动物放在隔音室的防振台上。用暖气垫把动物的体温保持在37.5 摄氏度。
3. 用 70% (卷/卷) 乙醇擦拭头部区域。使用细剪刀, 使1-2 毫米切口延髓到外部耳廓放置参考电极或地面。真皮下针电极 (记录电极) 位于头骨顶点 (图 1A)。
4. 使用函数发生器, 产生校准的音调爆发 (1 毫秒上升/下降, 3 ms 高原) 的各种频率 (2, 4, 8, 16, 24, 和32赫) 和强度 (从85分贝到10分贝在 5 db 步骤)。手动或使用计算机改变频率和振幅。通过一个位于10厘米处的静电扬声器向动物头部传递声音刺激。
5. 过滤器 (100-1, 000 Hz), 放大和平均 (256 倍) 的声音产生的潜力使用多功能处理器获得 ABRs。ABR 跟踪被在线监视并存储以进行离线分析。从一个动物那里完成 ABR 记录需要大约40分钟。
   注: 通常, 三到七峰 (波 I 到波 VII) 的潜伏期小于15毫秒, 可以识别 (图 1B)。ABR 阈值定义为可以检测到波 I 和 II 的最小声级。
6. 弄死在动物醒之前从麻醉 (与腹腔注射0.3 毫升1.5% 戊巴比妥钠)。

3. Corti (OC) 解剖机构

1. 麻醉鼠崽。对于不到6天的老鼠 (< P6), 将动物放在100毫米的培养皿中, 用冰覆盖盘子10分钟。对于老鼠 > P6, 麻醉的动物与单一注射1.5% 戊巴比妥钠 (22 毫克/千克, ip)。麻醉后斩首鼠幼崽。
2. 用 70% (卷/卷) 乙醇喷雾消毒头部。
3. 用剪刀将头骨沿矢状中线打开;去掉大脑, 露出内耳。
4. 把内耳转成一个35毫米的培养皿, 里面装满3毫升冰冷的 L-15 (图 2A)。
5. 在解剖显微镜下, 使用细钳去除耳蜗骨胶囊 (图 2B)。
6. 从蜗轴中打开 OC 和相关的纹耳蜗 (SV)。
7. 通过将 sv 的基底部分与镊子保持在一起, 完全通过从基到顶点 (图 2C) 慢慢展开来将 OC 与 SV 分开。
8. 使用细剪刀将 OC 均匀地切成三块 (图 2D)。

4. 免疫荧光染色

1. 通过使用200µL 吸管尖端, 将 OC (步骤 3.8) 的段转移到玻璃滑块上, 然后用100µL 4% 多聚甲醛, 在4摄氏度上修复至少4小时。
   注意: 多聚甲醛有毒;穿戴适当的保护。
2. 用100µL 的新鲜 PBS 取代多聚甲醛来冲洗组织。把纸巾洗三次, 10 分钟。
3. 室温下在 PBS 中用0.3% 通透剂孵化组织, 室温30分钟。
4. 在 pbs 中丢弃渗透剂, 用 pbs 清洗组织三次。
5. 在室温下, 在 PBS 中用10% 正常山羊血清阻断1小时。
6. 在室温或4摄氏度时, 用抗 prestin-C 终点抗体 (1:200) 在2小时的阻塞溶液中孵化。
7. 用 PBS 洗三次, 5 分钟。
8. 用 Alexa488-conjugated 次生抗体 (1:600) 在室温下的1小时的阻塞溶液中孵化。
9. 在黑暗中用 PBS 洗三次, 5 分钟。
10. 用罗丹明-罗丹明 (1:200) 在室温下在黑暗中孵育10分钟。
11. 在黑暗中用 PBS 洗三次, 5 分钟。
12. 安装在带有安装介质的玻璃滑梯上 (含 DAPI)。使用 405 nm、488 nm 和 594 nm 激光的共焦显微图像。将激光功率设置为 0.1-0.5 兆瓦, 扫描速度为0.5 帧/秒。

5. 隔离 OHCs 的膜片钳记录

1. 使用吸管拉拔和微伪造器, 使修补吸管与尖端直径2-3 µm. 背部填充吸管细胞内的溶液。通常, 在浴缸溶液中, 贴片吸管的初始电阻为 2.5-3.5 MΩ。
2. 通过使用200µL 吸管尖端, 将 OC 的一块 (从步骤 3.8) 转移到35毫米培养皿中。用100µL 酶消化培养基 (胶原酶 IV, 参见材料表) 在室温下5分钟消化组织。
3. 用100µL 的 L-15 取代酶消化培养基。用微型手术刀将组织切成小块, 以隔离毛发细胞。
4. 经过温和的吹打, 将细胞转移到自制的小塑料室 (直径 ~ 1.5 厘米), 填充无酶浴溶液 (~ 1.5 毫升, 见材料表)。
5. 把房间放在倒置显微镜的舞台上。找到健康出现的孤独 OHCs。
6. 将贴片吸管加载到700B 放大器的头部阶段。小心地移动机器人, 并将其定位在外发单元格的底部 (图 3A)。
7. 全细胞贴片通过封闭细胞体的外侧壁来夹紧 OHC。应用轻吸, 直到细胞膜破裂。设置保持电位在-70 mV。具有接触阻力的细胞从10到 17 MΩ, 膜阻力范围从100到 500 MΩ, 被认为是一个成功的全细胞构型。
8. 使用计算机控制, 应用极化和去极化型电压 (250 毫秒的持续时间和范围从−140到 +94 mv 在 13 mv 步骤) 到细胞, 以引出全细胞电流。
9. 放大整个细胞电流, 过滤器 (5 赫的角频率) 由700B 放大器。将数据转换为1440A 转换器并存储为离线分析。
10. 用膜片钳软件控制的两个正弦波电压刺激协议测量 OHCs 的膜电容。将刺激电压范围设置为-140 到 110 mV。存储数据以进行离线分析。

结果

ABR 可以从7岁以上的麻醉鼠幼崽 (P7) 使用纯音调爆发 (图 1A) 中诱发。如图 1B所示, 从鼠幼崽获得的 ABR 波形仅显示三到四个小振幅的不同波。通常在成年动物的 ABR 波形中观察到七峰值 (图 1B)。

对于以下染色和电生理测量, 大鼠内耳从颞骨进行了新的解剖。我们...

讨论

在11岁以下的老鼠中, 听觉皮层可能没有反应出对声音刺激的动作电位^6,7。因此, 后天11被描述为 "听觉发作"¹⁰。听力发病前听力功能的发展尚未得到很好的研究。使用类似的方法, 成人 ABR 记录, 我们证明, ABRs 可以引起的纯音调爆裂的鼠幼崽比 P11 (图 1)。然而, 从大鼠幼崽获得的 ABR 波形显示出与成年动物不同的特?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	1.5% in water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
Collagenase IV	Sigma	C5138	2 mg/mL in L-15
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	PH 7.3
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4% in PBS
Triton X-100	Amresco	ZS-0694	0.3% in PBS
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	10000C	10% in PBS
prestin antibody	Santa Cruz	SC-22694	dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11055	dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	dil 1:200
DAPI	Solarbio	C0060	dil 1:20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
CsCl	Sigma	7647-17-8	140 mM
MgCl2	Sigma	7791-18-6	2 mM
EGTA	Sigma	67-42-5	10 mM
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Osmometer	Gonotec	OSMOMAT 3000 basic
Forcep	WPI	14095	Tweezers dumont
Micropipette puller	Sutter Instrument	MODLE-P97
Micro Forge	Narishigen	MF-830
Mini Operating System	Sutter Instrument	MP-285
MultiClamp	Axon	700B
Low-Noise Data Acquisition System	Axon	1440A
ES1 speaker	Tucker-Davis Technologies
TDT system 3	Tucker-Davis Technologies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
SigGenRP software	Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software	Tucker-Davis Technologies
jClamp	Scientific Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
SD rat	Experimental Animal Center of Southern Medical University