גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי להקליט התגובה גזע המוח של עכברוש לאחר הלידה הגורים. לבחון התפתחות תפקודית של תאים שיער החיצוני, ההליך ניסיוני של קלאמפ תיקון שלם-תא הקלטה בתאים מבודדים שיער החיצוני מתואר צעד אחר צעד.

Abstract

תא שיער החיצוני הוא אחד משני הסוגים של תאי חישה שיער ב שבלול יונקים. הם לשנות אורכם תא עם הקולטן פוטנציאליים כדי להגביר את הרטט חלש של אותות קול ברמה נמוכה. מורפולוגיה ורכוש אלקטרופיזיולוגיות של תאים שיער החיצוני (OHCs) להתפתח מוקדם הגילאים כמחנכת. ההבשלה של תא שיער החיצוני יכול לתרום להתפתחות של מערכת השמיעה. עם זאת, התהליך של פיתוח OHCs לא למדה היטב. זה גם בגלל הקושי למדוד את תפקידם על ידי גישה אלקטרופיזיולוגיות. במטרה לפתח שיטה פשוטה כדי לטפל בבעיה לעיל, כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי ללמוד את הפונקציה של OHCs ב שבלול בחריפות הפומבית של חולדות כמחנכת. בשיטה זו, אנו יכולים להעריך את התגובה שבלולי לגירויים צליל טהור, לבחון את רמת הביטוי והתפקוד של prestin חלבון מנוע ב- OHCs. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את תאי השיער הפנימי (IHCs).

Introduction

שתי פונקציות שונות של שבלולי תאים שיער החישה הם חיוניים עבור יונקים שמיעה: mechanoelectric התמרה חושית (MET) ו- electromotility^1,2. על ידי ערוצי MET ממוקם על הצרור שיער, IHCs (IHCs) OHCs המר רטט קול לתוך שינויי פוטנציאל ממברנה, כמו גם את האותות החשמליים של ספירלה innervated גנגליון נוירונים. OHCs לשנות את אורכם תא עם קרום פוטנציאליים ומגבירים את הרטט של קול ברמה נמוכה. פעילות זו כינה electromotility נגזר על ידי prestin חלבון המנוע ממוקם בקיר הלטראלי של OHCs³.

במינים רבים כולל מכרסמים, הפונקציה שמיעה היא בשלה^4,מוקדמת אפוק כמחנכת⁵. אין פוטנציאל פעולה בתגובה אותות קול יכול להתגלות בקליפת המוח השמיעתית לפני^6,תחילת⁷שמיעה. התפתחות המורפולוגיה והתפקוד של שבלול נחקרה נרחב העכבר, גרביל, עכברוש-^4,-^5,-⁸. Mechanotransduction ואת electromotility של תאים שיער מפותחים גם בתחילת החיים אפוק⁵.

על מנת להעריך את הרגישות שמיעה של חולדות בגילאים שונים כמחנכת, פיתחנו שיטה של גזע המוח השמיעתית תגובה (ABR) הקלטה עכברוש הגורים. תיקון שלם-תא קלאמפ היא טכנולוגיה אידיאלי כדי לחקור את OHCs electrophysiologically. עם זאת, בהשוואה את המלחציים תיקון הופיעה נוירונים ותאי אפיתל אחרים, שיעור נמוך של תאים שלמים איטום מוגבלת החקירה של electromotility של OHCs מבודדים.

כאן נתאר הליך כדי לחקור את OHCs מורפולוגית, electrophysiologically ב שבלול בחריפות הפומבית של חולדות כמחנכת. בשיטה זו יכול להיות שונה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המסדירים הפנימי תא שיער התפתחות ותפקוד.

Protocol

כל הפרוטוקולים ניסיוני מעורבים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה חיה של האוניברסיטה הרפואית בדרום.

1. מכינים את פתרונות לניסויים

1. להכין ההרדמה (ראה טבלה של חומרים): סודיום פנטוברביטל 1.5% מומס ddH₂O.
2. להכין את הפתרון לנתיחה (ראה טבלה של חומרים): להמיס שקית אחת של אבקת L-15 של Leiboviz ב 1 ליטר של ddH₂O. התאם pH ל 7.3 עם 1 M NaOH. התאם osmolarity ל 300-330 mOsm על-ידי שימוש, osmometer ו 10 מ מ HEPES לפני השימוש.
3. לפזר 2 מ"ג/מ"ל collagenase הרביעי (ראה טבלה של חומרים) בתמיסה לנתיחה מוכן בשלב 1.2.
4. להכין את הפתרונות immunostaining (ראה טבלה של חומרים): להמיס את paraformaldehyde 4% בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS).
   התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת.
5. לדלל את הסוכן חדירות 0.3% ב- PBS. לדלל את הנסיוב עז נורמלי 10% ב- PBS כמו המאגר חסימה. לדלל את 1:200 נוגדן prestin במאגר חסימה. לדלל את 1:600 Alexa488 מצומדת נוגדן במאגר חסימה. לדלל את 1:200 isothiocyanate Phalloidin-Tetramethylrhodamine B ב- PBS.
6. להכין את הפתרון חוץ-תאית (ראה טבלה של חומרים): להכין L-15 בינוני של Leiboviz, כפי שתואר לעיל (שלב 1.2).
7. להכין את הפתרון תאיים (ראה טבלה של חומרים).

2. ABR הקלטה

הערה: ABR הקלטה תוארה בעבר בפירוט שלנו המחקר הקודם⁹.

1. עזים ומתנגד חולדות ספראג Dawley (SD) (בת 1-14 יום הגורים ו- 2 - בת חודשים מבוגרים, שני המינים) עם זריקה אחת של 1.5% סודיום פנטוברביטל (22 מ"ג/ק"ג עבור הגורים ו- 30 מ"ג/ק"ג למבוגרים, בקרום הבטן (i.p.)).
2. מקם את החיה anesthetized תבנית פוליאתילן מוקצף לשתק גוף החיה. במקום החיה על טבלת אנטי רטט בחדר attenuating-קול. לשמור על טמפרטורת גוף של החיה 37.5 ° C עם כרית חימום.
3. נגב באזור הראש עם אתנול 70% (vol/כרך). באמצעות מספריים בסדר, לבצע חתך 1-2 מ מ ventrolateral פינה חיצוני כדי למקם את הפניה אלקטרודה או הקרקע. אלקטרודה המחט תת-עורי (הקלטה אלקטרודה) ממוקם מעל לקודקוד הגולגולת (איור 1 א').
4. שימוש מחולל אותות, ליצור התפרצויות הטון מכויל (עלייה ms 1/סתיו, מישור 3 ms) של תדרים שונים (2, 4, 8, 16, 24 ו- 32 kHz) בעוצמות (ירד מ 85 dB SPL 10 בשלב 5 dB). לגוון את תדירות משרעת באופן ידני או באמצעות מחשב. לספק גירויים קול באמצעות רמקול אלקטרוסטטי ממוקם 10 ס מ משם לכיוון הראש של חיה.
5. סינון (100-1, 000 Hz), להגביר, ממוצע (256 פעמים) קול elicited פוטנציאל באמצעות מעבד מרובה פונקציות כדי לקבל את Abr. עקבות ABR להשגחה באינטרנט ומאוחסן לניתוח במצב לא מקוון. זה לוקח בערך 40 דקות כדי להשלים את ABR הקלטה מחיה לחיה.
   הערה: בדרך כלל, 3-7 פסגות (גל אני לגל VII) עם השהיות ארוכות יותר פחות מ 15 ms יכול להיות מזוהה (איור 1B). הסף ABR מוגדר של רמת הקול המינימלי-מאיזה גל I ו- II יכול להתגלות.
6. המתת חסד לפני החיות ער מן ההרדמה (עם זריקה בקרום הבטן של 0.3 mL 1.5% סודיום פנטוברביטל).

3. ניתוח של איבר קורטי (OC)

1. עזים ומתנגד עכברוש הגורים. עבור חולדות בן פחות מ 6 ימים (< P6), לשמור את החיה לצלחת תרבות 100 מ מ, מכסים את הכלי עם קרח למשך 10 דקות. עבור חולדות > P6, עזים ומתנגד החיה עם זריקה אחת של 1.5% סודיום פנטוברביטל (22 מ"ג/ק"ג, i.p.). לערוף את הגורים עכברוש לאחר הרדמה.
2. לחטא את הראש ע י ריסוס עם 70% (vol/כרך) אתנול.
3. לפתוח את הגולגולת לאורך הקו האמצעי הסאגיטלי עם מספריים; מסירים את המוח כדי לחשוף את האוזן הפנימית.
4. העברת האוזן הפנימית לתוך צלחת פטרי 35 מ מ מלא 3 מ"ל של קרח L-15 (איור 2 א).
5. תחת המיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש מלקחיים בסדר כדי להסיר את הקפסולה הגרמי של שבלול (איור 2B).
6. עטיפה OC ומקושרת לחריץ vascularis (SV) מ- modiolus.
7. על-ידי החזקת בחלק הבסיס של ה-SV עם מלקחיים, להפריד OC של ה-SV לחלוטין על-ידי רגיעה לאט מן הבסיס-כדי-איפקס (איור 2C).
8. לחתוך OC באופן שווה לתוך שלוש חתיכות באמצעות מספריים בסדר (איור דו-ממדי).

4. immunofluorescence מכתים

1. באמצעות טיפ פיפטה µL 200, להעביר את הקטעים של OC (שלב 3.8) על זכוכית, לתקן עם 100 µL של 4% paraformaldehyde במשך 4 שעות לפחות ב 4 º C.
   התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת.
2. לשטוף את הרקמה באמצעות הסטת את paraformaldehyde עם µL 100 ל- PBS טריים. לשטוף את הרקמה שלוש פעמים במשך 10 דקות.
3. דגירה הרקמה עם סוכן חדירות 0.3% ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
4. למחוק את הסוכן חדירות ב- PBS ולשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם PBS.
5. בלוק עם הנסיוב עז נורמלי 10% ב- PBS לשעה בטמפרטורת החדר.
6. דגירה עם נוגדן anti-prestin-קצה קרבוקסילי (1:200) בחסימה פתרון 2 h בטמפרטורת החדר או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
7. לשטוף שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
8. דגירה עם נוגדנים משניים מצומדת-Alexa488 (1:600) בתמיסה החסימה לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.
9. לשטוף שלוש פעמים עם PBS עבור 5 דקות בחושך.
10. תקופת דגירה עם rhodamine-phalloidin (1:200) של 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
11. לשטוף שלוש פעמים עם PBS עבור 5 דקות בחושך.
12. הר על משטח זכוכית הרכבה בינונית (מכיל דאפי). התמונה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות 405 ננומטר, 488 ננומטר, 594 ננומטר לייזר. קבע את עוצמת הלייזר-0.1-0.5 mW מהירות הסריקה-מסגרת 0.5/s.

5. תיקון קלאמפ הקלטה של OHCs מבודדים

1. השתמש את פולר פיפטה, מיקרו-הזייפן לבצע תיקון סיליקון בקוטר טיפ 2-3 מיקרומטר. מילוי חוזר של פיפטות עם פתרון תאיים. בדרך כלל, ההתנגדות הראשונית של תיקון פיפטה היה 2.5-3.5 MΩ בתמיסה אמבט.
2. באמצעות טיפ פיפטה 200 µL, להעביר פיסת OC (מתוך שלב 3.8) 35 מ מ פטרי. לעכל את הרקמה עם 100 µL עיכול אנזימטי בינוני (collagenase הרביעי, ראה טבלה של חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. תחסיר המדיום עיכול אנזימטי עם 100 µL של L-15. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות בעזרת אזמל מיקרו לבודד את תאי השיער.
4. לאחר pipetting עדין, להעביר את התאים לתא פלסטיק קטן תוצרת בית (קוטר ~ 1.5 ס מ) מלא אמבטיה ללא אנזים פתרון (~ 1.5 מל ', ראה טבלה של חומרים).
5. מניחים את התא על השלב של מיקרוסקופ הפוכה. למצוא את OHCs בודד בריא להופיע.
6. לטעון על פיפטה תיקון לתוך השלב הראשי של מגבר 700B. להעביר את פיפטה תיקון בקפידה על-ידי micromanipulator ומקמו אותו סביב החלק התחתון של התא שיער החיצוני (איור 3 א).
7. תיקון שלם-תא מהדק OHC על ידי איטום הקיר לרוחב של גוף התא. החל יניקה קלה עד נקרע קרום התא. הגדר החזקת פוטנציאליים ב-70 mV. תאים עם הגישה התנגדות נע בין 10 ל 17 MΩ והתנגדות ממברנה נע בין 100 ל 500 MΩ, והם נחשבים תצורה שלם-תא מוצלחת.
8. באמצעות שליטה במחשב, החל hyperpolarizing depolarizing מתח (משך 250 ms והחל −140 וכלה +94 mV ב- 13 שלבים mV) על התא שמעודדים תאים כל הזרמים.
9. להגביר את הזרמים תאים שלמים, לסנן (תדירות פינה של 5 קילו-הרץ) על ידי מגבר 700B. להמיר את הנתונים על-ידי ממיר 1440A חנות לניתוח במצב לא מקוון.
10. למדוד את קיבול הממברנה של OHCs באמצעות פרוטוקול גירוי מתח גל סינוס שני נשלט על ידי תוכנת מלחציים תיקון. הגדר את טווח מתח stimulate מ-140 110 mV. לאחסן את הנתונים לניתוח במצב לא מקוון.

תוצאות

ABR יכול להיות ממיתוס עכברוש מרדימים גורים שגילם יום כמחנכת 7 (P7) באמצעות התפרצויות צליל טהור (איור 1 א'). כפי שמוצג באיור 1B, ואת ABR המתקבל הגורים עכברים הראה רק 3-4 גלים ברורים עם משרעת קטן. בדרך כלל, עד שבע הפסגות נצפו ב ואת ABR למבוגרים בעלי חיים (<...

Discussion

בחולדות צעיר יותר היום ה-11, אין פוטנציאל פעולה בתגובה לגירוי צליל יכול להיות שנצפו בקליפת השמיעה^6,7. לכן, כמחנכת היום ה-11 מתואר "תחילת הדיון"¹⁰. פיתוח שמיעה פונקציה לפני תחילת הדיון היה לא טוב למד עדיין. באמצעות השיטה דומה עבור הקלטת ABR למבוגרים, נדג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	1.5% in water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
Collagenase IV	Sigma	C5138	2 mg/mL in L-15
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining solutions
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	PH 7.3
Paraformaldehyde	Sigma	158127	4% in PBS
Triton X-100	Amresco	ZS-0694	0.3% in PBS
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	10000C	10% in PBS
prestin antibody	Santa Cruz	SC-22694	dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11055	dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	dil 1:200
DAPI	Solarbio	C0060	dil 1:20
Name	Company	Catalog Number	Comments
Extracellular solution
Leiboviz's L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 pack in 1 L water
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
CsCl	Sigma	7647-17-8	140 mM
MgCl2	Sigma	7791-18-6	2 mM
EGTA	Sigma	67-42-5	10 mM
HEPES	Sigma	7365-45-9	10 mM
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Osmometer	Gonotec	OSMOMAT 3000 basic
Forcep	WPI	14095	Tweezers dumont
Micropipette puller	Sutter Instrument	MODLE-P97
Micro Forge	Narishigen	MF-830
Mini Operating System	Sutter Instrument	MP-285
MultiClamp	Axon	700B
Low-Noise Data Acquisition System	Axon	1440A
ES1 speaker	Tucker-Davis Technologies
TDT system 3	Tucker-Davis Technologies
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
SigGenRP software	Tucker-Davis Technologies
BioSigRP software	Tucker-Davis Technologies
jClamp	Scientific Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
SD rat	Experimental Animal Center of Southern Medical University